呼吸道合胞病毒地方株SH蛋白基因序列分析

目的：分析我国呼吸道合胸病毒（RSV)地方株SH蛋白基因的遗传特点、变异特征。方法：从本室保存的不同年份、不同地区、不同流行特征的呼吸道合胞病毒地方株中抽取7株,分别用RT－PCR扩增其SH蛋白基因并克隆到PTZ18R载体中进行了序列测定和分析。结果：我国RSV地方株间SH蛋白基因相比较变异的部位及形式很相似,地方株间核苷酸全序列的同源性为97．0％－100％。结论：RSV在我国不同地区的不同流行特征与SH蛋白基因的变异无明显关系。     

呼吸道合胞病毒地方株SH蛋白基因序列分析

目的 :分析我国呼吸道合胞病毒 (RSV)地方株SH蛋白基因的遗传特点、变异特征。方法 :从本室保存的不同年份、不同地区、不同流行特征的呼吸道合胞病毒地方株中抽取 7株 ,分别用RT PCR扩增其SH蛋白基因并克隆到PTZ18R载体中进行了序列测定和分析。结果 :我国RSV地方株间SH蛋白基因相比较变异的部位及形式很相似 ,地方株间核苷酸全序列的同源性为 97.0 %～ 10 0 %。结论 :RSV在我国不同地区的不同流行特征与SH蛋白基因的变异无明显关系     

呼吸道合胞病毒蛋白G基因l核苷酸分析

目的:对河南省呼吸道合胞病毒(RSV)进行分离与鉴定.方法:选择2006年冬季至2007年春季河南省部分医院急性呼吸道感染患者,采集咽拭子,利用Hep-2细胞和Vero细胞进行病毒分离,对分离株用特异性RTPCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行蛋白G全基因序列测定,并进行同源性分析,构建基因进化树.结果:共分离到4株RSV毒株,各分离株之间核苷酸同源性92%～99%;与A型RSV标准参考株的核苷酸同源性为86%～92%,与B型RSV标准株的同源性为70%.结论:2006年河南省RSV流行株为A型.     

北京地区呼吸道合胞病毒分离株F蛋白基因序列分析

目的分析中国北京地区4株呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的基因序列并与RSV原型株A2进行比较,得出中国北京地区RSV F蛋白基因是否存在变异及变异特征。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分2段扩增F蛋白的基因核苷酸序列,将得到的P1、P22段切胶纯化标记后测序,应用Bioedit软件对得到的序列做碱基配对和比较分析。结果4株RSV F蛋白核苷酸序列的同源性为94.92%~95.62%。信号肽区的同源性为99.36%~99.73%。F1、F2亚单位同源性分别为98.93%~99.31%和96.69%~97.33%。氨基酸同源性分别为:F蛋白的蛋白编码区97.39%~97.74%,信号肽区99.13%~99.65%,F1、F2亚单位98.78%~99.48%、98.61%~99.30%。结论中国RSV北京株与原型株A2之间的F蛋白基因变异小,具有很高的同源性。氨基酸在抗原位点Ⅱ保守,此段氨基酸可作为RSV疫苗的候选位点。     

四川呼吸道合胞病毒F蛋白基因序列和抗原表位变异分析

目的 分析呼吸道合胞病毒(RSV)四川分离株F蛋白基因序列,探讨F蛋白基因和抗原表位变异情况.方法 RT-PCR方法扩增F蛋白近全长序列并测序,分析核苷酸和氨基酸变异位点,比较不同亚型和基因型间中和表位、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位基因组成.结果 10株RSV F蛋白的核苷酸和氨基酸P-distance分别为0.102±0.005和0.058±0.006,中和表位47F和L4在亚型间高度保守,而RS-348和7C2在亚型内保守,CTL表位HLA B*57、HLA A*01和HLA Cw* 12也是亚型内高度保守,亚型间存在个别氨基酸变异.结论 RSV四川分离株F蛋白基因保守度较高,抗原表位在亚型内保守,已在A亚型上识别的CTL表位可能在B亚型内不能识别.     

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白M的基因克隆与序列分析

目的：建立汉坦病毒（HV）包膜糖蛋白M的克隆载体;研究M基因的变异情况,并对其序列进行系统发生树分析。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增GM04—38M片段的基因。产物纯化后克隆于PMD-18T载体。经氨苄青霉素筛选,酶切鉴定,并进行序列测定,应用DNASTAR软件将它与世界范围内分离的病毒株同一基因序列分析比较。结果：筛选出含有HVM蛋白基因的克隆。GM04—38株M片段的全基因序列共3651个核苷酸。4种核苷酸的比例分别为：A30．46％。T30．13％,G20．84％。C18．57％。序列同源分析表明。GM04—38株与Z37株核苷酸同源性最高（97.3％）。属于SEO型HV。与其他SEO各株的差别均小于18．0％：绘出了核苷酸系统发生树。结论：成功地建立汉坦病毒M蛋白基因克隆载体：中国不同地区汉坦病毒流行株基因序列存在明显差异。这为研究HV遗传与变异以及制备有效的亚单位疫苗奠定了基础。     

肾综合征出血热患者流产胎儿分离毒株84FLi的全基因序列分析

目的：克隆和测定汉滩病毒疫苗生产株84FLi的全基因组序列,了解其分子基础。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）,分节段扩增84FLi株L、M和S基因片段的cDNA,直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果：84FLi株L、M、S3个片段的全基因组序列为6533,3616和1688个核苷酸,分别编码2151,1135,429个氨基酸。A、C、G、T4种核苷酸分别为3830,2050,2510和3447个,GC含量为38．52％,AT含量为61．48％。序列同源性分析表明84FLi株与分离自广州的RG9株和分离自安徽的Chen4株高度同源。S片段核苷酸的同源性99．6％。与HTNV的国际标准毒株76－118的3个片段核苷酸同源性分别为83．7％、84．0％和87．2％,氨基酸同源性分别为97．5％、96．0％和97．9％。结论：84FLi株属于汉滩型病毒,并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高,与中国株Chen4株和RG9株属于同一亚型。     

广州地区HCMV临床病毒株UL137基因的结构特征与多态性

【目的】研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒（HCMV）临床低传代分离株UL137基因的结构特征与基因多态性。【方法】从62份被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离获得3株低传代临床病毒株，经多重PCR鉴定后分别命名为HCMVD2、D3和D52。对3株临床分离株进行HCMVUL137基因全序列PCR扩增，PCR产物纯化后进行基因克隆，构建HCMVUL137-pMD18-T重组质粒；基因测序；将HCMVUL137基因序列呈报GenBank，并进行基因生物信息学分析。【结果】成功从广州地区新生儿感染HCMV患儿体内分离3株HCMV临床病毒株。克隆测序后呈报GenBank并被收录，收录序列号分别为：DQ180388、DQ180376、DQ180360。通过序列分析，结果显示低传代分离株UL137基因DNA序列高度保守，同源性在96．91％～100％之间．其变异均为碱基替换：编码蛋白均由96个氨基酸残基组成，同源性在90．63％～100％之间，超半数的变异发生在第61～81位氨基酸残基之间：编码蛋白翻译后修饰位点包括PKS、MYS、cAMPs三类，其中4个PKS和44～49位的MYS高度保守，cAMPs位点仅在5株病毒出现；编码蛋白等电点在11．50～12．00之间，呈强碱性。【结论】广州地区临床低传代分离株HCMVUL137基因核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列极为保守，但仍存在-定多态性。提示HCMVUL137ORF可能是-个具有重要功能的基因。     

呼吸道合胞病毒融合蛋白变异及其对抗体和药物效果的影响

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是造成婴幼儿与老年人下呼吸道感染和住院的主要原因之一.目前开发疫苗、抗体及药物成为防控RSV的热点,其主要靶点是融合蛋白(fusion glyco-protein,F).本文分析了现有RSV病毒株融合蛋白的变异情况,剖析了融合蛋白的结构特点...     

1978～1996年广州地区呼吸道合胞病毒感染分析

为了解广州地区儿童呼吸道合胞病毒（RSV）感染的情况，采用病毒分离等方法，对广州地区1978～1996年连续18年的儿童支气管炎和支气管肺炎进行了RSV病原学检测。共检测患儿5273例，分离出RSV的患儿513例。病毒分离总阳性年9．7％。18年中以1985年、1986年和1992年RSV分离车最高；一年中RSV分离车从3月份开始增高，4月份达高峰，持续至5～8月，9月份开始下降。结论：18年来广州地区有过3次RSV感染流行高峰（1985年、1986年、1992年）；广州地区RSV感染的流行季节主要发生在每年的春夏季。     

A 63 kDa VSP9B10A-like protein expressed in a C-8 Giardia duodenalis Mexican clone

BACKGROUND: It is well documented that Giardia duodenalis undergoes surface antigenic variation both in vivo and in vitro. Proteins involved have been characterized and referred to as VSP (variable surface protein). METHODS: Two cloned cDNA inserts of 0.45 and 1.95 kb were obtained from G. duodenalis expression library and sequenced. Comparison sequence analyses were made against Genbank. PCR analysis was performed on G. duodenalis isolates to identify isolates bearing genes encoding such a peptide. Specific antiserum was prepared against 450-bp encoded peptide and tested by Western blot, immunofluorescence, and inhibition of adhesion of G. duodenalis to target cells. RESULTS: We cloned and characterized a G. duodenalis 450-bp DNA fragment; its DNA sequence analysis revealed that this fragment displayed 99% identity with vsp9B10A gene. Predicted amino acid sequence for this fragment also had significant (99%) identity to VSP9B10A. A second 1.95-kb insert, which encompassed the 450-bp cDNA fragment, was also isolated; its DNA and amino acid sequence displayed 99.5% identity with vsp9B10A gene and 99.2% with the corresponding inferred protein, respectively. This inferred protein contained 24 Cys-X-X-Cys motifs and long ORF of 642 aminoacids. PCR analysis showed that DNA sequence encoding a fragment of this gene was present in P1, CIEA:0487:2-C-8 clone and in INP:180800-B2 G. duodenalis human isolates, while it was absent in sheep isolate of G. duodenalis INP:150593-J10. CONCLUSIONS: Immunofluorescence analysis using antibodies raised against the peptide encoded by 450-bp fragment showed that expression of this epitope varies on trophozoite surface of the C-8 Mexican clone and is involved in parasite adhesion to target epithelial cells.     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因cDNA片段的克隆与鉴定

目的 获得白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因家族中的一个cDNA片段。方法 根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E同源区氨基酸序列,设计1对简并引物,进行反转录PCR,获得一大小与设计的细胞色素P450基因片段相符合的cDNA片段。将该片断与pUC19质粒重组,并克隆至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序;将推导的氨基酸序列进行同源性分析,并用PC/GENE软件绘制系统树。结果 获得了1条长240　bp的核酸序列;所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在36.3%～46.8%之间,但CYP6D1除外,其同源性为29.1%;而与CYP4家族同源性较低,与CYP4C1、CYP4D1、CYP4D2同源性分别为33.3%、32.9%和29.9%;与哺乳动物CYP3A亚家族同源性亦较高;所绘制的系统树显示出与同源性分析相一致的结果。结论 该序列为CYP6家族中某一成员的结构基因片段。     

SARS冠状病毒M基因的克隆及序列分析

目的克隆SARS冠状病毒(SARS-CoV)GD322株M基因,并进行序列分析。方法根据GenBank中公布的SARS冠状病毒Tor2株M基因序列,设计一对引物,用RT-PCR法从SARS-CoVGD322株基因组中扩增M基因片段。克隆至pET-32(a)载体,转化大肠杆菌BL-21后测序,利用DNAstar和ClustalX分析所测序列翻译的氨基酸与81株SARS-CoVM基因翻译的氨基酸序列的差异。结果该M基因与Tor2株M基因核苷酸同源性为99.86%;与已收集的81株SARS-CoVM基因所译氨基酸相比,和41株(占50.62%)M蛋白完全同源,37株(占45.68%)仅有一个氨基酸改变,同源性为99.55%,仅与3株(占3.70%)有2个氨基酸差异,同源性为99.10%。结论已获得具有代表性的SARS-CoVM基因重组质粒。     

湖南狂犬病毒P基因和M基因分子遗传特征

目的了解湖南省狂犬病毒的分子流行病学特征以及其与疫苗株的差异。方法对4株湖南狂犬病病毒P和M基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果同源性分析表明，4株湖南街毒P和M基因核苷酸同源性分别为97．3％-99．4％和98．4％-99．8％；与其它I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸同源性比较，P基因分别为78．4％-90．2％和81．8％-86．8％；M基因的分别为81．8％-92．1％和84．7％-90．6％。4株野毒P和M基因氨基酸同源性分别为98．0％-99．3％和98．5％-99．0％。结论4株病毒P基因和M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与我国现用的人用及兽用疫苗株存在一定差异。进化关系表明，4株病毒均为基因I型狂犬病毒；与我国宁夏分离株最近；与其它I型毒株分离自菲律宾和泰国等东南亚的毒株亲缘关系较近；而与翼手目的毒株关系最远。     

弓形虫HT分离株ROP5蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆和表达弓形虫虎源分离株(HT株)ROP5蛋白基因。方法运用RT-PCR技术从弓形虫HT株中扩增出ROP5基因,将其克隆入T载体中进行测序和分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1650bp,编码549个氨基酸。其中前24个氨基酸构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比,有12个核苷酸有差异,导致7个氨基酸发生改变,两者核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.2%和98.9%。转化重组质粒pETROP5的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出相对分子质量为64800的重组蛋白,并且能与弓形虫抗体发生血清学反应,表达量占菌体蛋白的15.6%。结论成功克隆和表达了弓形虫HT株ROP5蛋白基因,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2／N21基因的克隆与序列分析

目的 构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体,分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法 利用逆转 录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段,通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果 构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆,该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６     

丙型肝炎病毒2a型E2区基因cDNA的变异分析

目的 了解丙型肝炎病毒2a型基因组E2区序列的一级结构及变异特征，为进一步研究HCV包膜蛋白的生物学功能打下基础。方法 用逆转录套式多聚酶链反应(RT-nPR)法从1例NANB型肝炎患者血清中扩增出一条约1100bp的片段，以限制性内切酶EcoRI、HindⅢ双酶切后连入pUC19载体中，转化感受态细胞，经限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)和PCR法证实为阳性克隆后，用全自动序列分析仪测序。结果 测得约1100bp的核苷酸序列，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别与HCV-1、HC-C2、HCV-BK、HC-J6、HC-J8相应序列作比较，显示分离株HCV在核苷酸水平上与以上分离株的同源性分别为63．1％、64．2％、64．1％、86．9％、69．3％，在氨基酸水平上的同源性分别为69．6％、70．7％、69．6％、86．2％、83．1％。结论 分离株(HCV-JF)与HC-J6同属2a型。     

幽门螺杆菌临床菌株flaB基因的克隆和表达及鉴定

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）鞭毛素B基因（flaB），构建其原核表达系统，鉴定融合蛋白免疫性。方法：采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增flaB基因，T-A克隆后测定核苷酸序列，构建pET32a的flaB表达载体，在E.coli BL21DE3宿主中用不同浓度的IPTG诱导表达，采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中FlaB抗体和41株Hp临床菌株FlaB表达。结果：所克隆的flaB基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.31％-97.73％，氨基酸序列同源性高达99.41％-100.00％。pET32a-flaB-BL21DE3系统的FlaB融合蛋白表达量为细菌总蛋白的40％左右。FlaB融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应，免疫家兔能获得高效价抗体。结论：本研究成功地构建了Hp flaB高效原核表达系统，所表达的FlaB融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性；Hp临床菌株FlaB表达率高，且能刺激机体产生抗体。FlaB可作为Hp疫苗及诊断试剂盒的抗原。