重组人β2糖蛋白1作为抗磷脂抗体综合征口服耐受原的实验研究

目的:探讨口服重组人β2糖蛋白1(rhβ2-GP-1)诱导小鼠β2-GP-1特异性免疫耐受机制.方法:以rhβ2-GP-1免疫小鼠,在免疫的不同时间给予小鼠口服不同剂量的rhβ2-GP-1,应用3H-TdR掺入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖水平,应用ELISA方法检测免疫小鼠抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2-GP-1)产生滴度以及免疫小鼠IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TGF-β等细胞因子的产生情况.结果:在免疫的不同时间、口服不同剂量的rhβ2-GP-1可不同程度地诱导免疫小鼠anti-β2-GP-1滴度下降;耐受小鼠T淋巴细胞增殖水平明显降低(P＜0.01);IL-4、IL-10、TGF-β水平显著升高,IL-2水平显著降低,IFN-γ水平未见显著变化.结论:在合适的时间口服适当剂量的rhβ2-GP-1能够诱导小鼠β2-GP-1特异性免疫耐受.     

氧化修饰的β2-糖蛋白-1诱导抗心磷脂抗体的产生

目的:探讨蛋白质的氧化修饰与体内抗磷脂抗体产生的关系.方法:首先,在体外以次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧化系统氧化大鼠β2-GP1,然后以氧化的β2-GP1(oxβ2-GP1)免疫同种大鼠,最后以ELISA方法检测被免疫大鼠β2-GP1血清中的抗心磷脂抗体(ACA).结果:氧化的β2-GP1免疫的大鼠血清中产生高滴度的ACA.结论:β2-GP1的氧化修饰在ACA的产生上可能起十分重要的作用.     

氧伲修饰的β2—糖蛋白—1诱导抗心磷脂抗体的产生

目的：探讨蛋白质的氧化修饰与体内抗磷脂抗体产生的关系。方法：首先,在体外以次黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶氧化系统氧化大鼠β２－ＧＰ１,然后以氧化的β２－ＧＰ１（ｏｘβ２－ＧＰ１）免疫同种大鼠,最后以ＥＬＩＳＡ方法检测被免疫大鼠β２－ＧＰ１血清中的抗心磷脂抗体（ＡＣＡ）。结果：氧化的β２－ＧＰ１免疫的大鼠血清中产生高滴度的ＡＣＡ。结论：β２－ＧＰ１的氧化修饰在ＡＣＡ的产生上可能起十分重要的作用。     

β2-糖蛋白Ⅰ及其抗体与抗磷脂综合征

抗磷脂综合征是一种非炎症性自身免疫疾病,以患者血栓形成和(或)病态妊娠、血中存在抗磷脂抗体为临床特征.β2糖蛋白Ⅰ是该病的主要自身抗原,它的独特的氨基酸序列、具有构想变化和氧化还原修饰等特性使得它在疾病发病机制中占重要作用.它与其自身抗体结合交联触发靶细胞外和胞内信号通路,引起血栓形成和病态妊娠.进一步明确β2糖蛋白Ⅰ与其抗体间相互作用、该抗原抗体复合物引起血液稳态失衡的具体机制有助于开发更有效的针对抗磷脂综合征发病机制的特异性治疗手段.     

人β2GP1全长cDNA的分子克隆及重组质粒构建

采用逆转录ＰＣＲ技术自人胎肝细胞中克隆出人全长１０５９ｂｐ的β２ＧＰ１ｃＤＮＡ，经限制性内切酶图谱分析初步证实后，定向插入表达性载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，并筛选出带有插入片段的阳性克隆，为研究抗磷脂抗体所针对的抗原及表位奠定了基础。     

产科抗磷脂综合征患者血清对脐静脉内皮细胞活化的研究

目的观察产科抗磷脂综合征患者血清对脐静脉内皮细胞活化的影响。方法用采集的16例APS患者和10例健康对照者血清分别处理体外培养的脐静脉内皮细胞,用逆转录定量聚合酶链反应检测脐静脉内皮细胞上细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和E-选择素（E-selectin）mRNA表达,用流式细胞仪检测二者蛋白的表达。结果APS血清处理后脐静脉内皮细胞上粘附分子ICAM-1和E-selectin mRNA和蛋白均比对照组明显升高,差异有显著性（P〈0.05）。结论抗磷脂综合征患者血清可激活脐静脉内皮细胞,使粘附分子表达增加。     

β_2糖蛋白1多肽抗体的制备与应用

目的利用人工合成β2糖蛋白1(β2GP1)多肽制备针对人源、鼠源β2GP1的多克隆抗体,并鉴定抗体的特异性及致病性。方法应用Fmoc法化学合成β2GP1 N端第35~51位氨基酸的多肽,将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰大白兔制备抗血清,蛋白G纯化得到抗β2GP1多肽抗体,利用ELISA和Western blot法鉴定其效价和特异性。体外实验使用抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物刺激C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR、Western blot法分别检测细胞组织因子(TF)mRNA和蛋白表达;Western blot法检测细胞p38、磷酸化p38、核因子κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65表达情况;体内实验采用C3H/He N小鼠腹腔注射抗β2GP1多肽抗体建立实验性抗磷脂综合征(EAPS)模型,检测小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度及部分凝血活酶时间(APTT)。结果化学合成β2GP1多肽的纯度为94%,达到免疫用抗原标准。偶联KLH后免疫新西兰大白兔,其抗血清效价大于1∶32 000。Western blot结果显示抗β2GP1多肽抗体可特异性识别人源和鼠源β2GP1条带,双抗夹心ELISA检测表明该多肽抗体可与β2GP1隐蔽表位特异性结合。体外实验显示抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物能够增强小鼠腹腔巨噬细胞p38、NF-κB p65磷酸化,诱导细胞TF mRNA及蛋白表达。体内实验成功建立EAPS小鼠模型,小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度大于1∶3200,APTT明显缩短。结论所制备的抗β2GP1多肽抗体可识别人源和鼠源β2GP1分子,能与β2GP1隐蔽抗原特异性结合且具有致病效应。     

抗β2GPI抗体与抗磷脂抗体综合征的相关性研究

目的：探讨αβ２ＧＰＩ在抗磷脂抗体综合征中诱导抗体产生的机制。方法：随机抽取活动期ＳＬＥ患者６０例，采用ＥＬＩＳＡ法测定血清中αβ２ＧＰＩ。结果：发现与正常对照组相比ＳＬＥ组αβ２ＧＰＩ水平明显升高（Ｐ＜０００１）。以ｘ＋３ｓ为正常值上限，阳性率高达９５％，显示αβ２ＧＰＩ与ＳＬＥ有显著相关性。结论：αβ２ＧＰＩ是抗磷脂肮体综合征的重要标志。     

人β_2GP1第5功能区cDNA的分子克隆及重组表达

采用逆转录PCR技术自人胎肝细胞中克隆出人β_2GP1第5功能区cDNA,长度为298bp,经纯化后定向插入表达性载体pGEX-2T,并筛选出带有插入片段的阳性克隆,重组克隆经IPTG诱导,可产生约36kD的融合蛋白,为研究抗磷脂抗体所针对的抗原及表位奠定了基础.     

TNF-α、IL-1β 、LPS对人多核白细胞、脐静脉内皮细胞血小板内皮细胞粘附分子-1表达的影响

目的：初探炎性刺激对人多核白细胞（ＰＭＮ）和脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）的血小板内皮细胞粘附分子－１（ＰＥＣＡＭ－１）表达的影响和ＰＥＣＡＭ－１的可能作用。方法：使用流式细胞仪和免疫组化法,观察脂多糖（ＬＰＳ）、白介素（ＩＬ）－１β和肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）－ａ对ＰＭＮ和ＨＵＶＥＣ ＰＥＣＡＭ－１表达的变化。结果：ＬＰＳ、１Ｌ－１β和ＴＮＦ－ａ可引起ＰＭＮ表达ＰＥＣＡＭ－１蛋白减少,而对ＨＵＶＥＣ　ＰＥＣＡＭ－１的表达无显著影响,但组化显著在ＨＵ－ＶＥＣ连接部的ＰＥＣＡＭ－１染色变淡。结论：上述炎性刺激物不仅可引起ＰＭＮ表达ＰＥＣＡＭ－１减少、激活ＰＭＮ,而且可改变内皮细胞ＰＥＣＡＭ－１的分布,因此ＰＥＣＡＭ－１在炎症中可能起重要作用。     

IL-1β通过抑制AKT下调人脐静脉内皮细胞eNOS Ser1177磷酸化水平

目的:探讨白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)能否调控人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)第1 177位丝氨酸(Ser1177)磷酸化水平及其可能的机制。方法:将HUVECs随机分为正常对照组、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)处理组、IL-1β处理组、IL-6处理组、单纯SC79[蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)特异性激动剂]处理组和SC79+IL-1β处理组。用Western blot方法检测HUVECs中eNOS、p-eNOS-Ser1177、AKT和pAKT-Ser473的蛋白水平。采用化学比色法检测HUVECs培养液中一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量。结果:与正常对照组相比,TNF-α和IL-6处理对HUVECs中p-eNOS-Ser1177的蛋白水平均无显著影响(P>0.05),而IL-1...     

何首乌提取物对人脐静脉内皮细胞株ECV-304的VCAM-1、ICAM-1表达的影响

内皮细胞是血液与血管壁之间的结构和功能屏障．内皮细胞受损是动脉粥样硬化(AS)形成的始发因素,粘附分子在内皮细胞受损过程中起了重要作用。因此如何控制内皮细胞粘附分子的表达在防止AS发生中是至关重要的。中药何首乌临床证实其提取物对生物体多种代谢活性具有积极的影响作用,但对内皮细胞粘附分子的表达是否有影响。还未见文献报道。     

1-磷酸鞘氨醇抑制TGF-β诱导的人脐静脉内皮细胞间充质转化

目的:探讨1-磷酸鞘氨醇(S1P)对转化生长因子β(TGF-β)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs内皮-间充质转化(End-MT)的作用及机制。方法:根据实验分组采用TGF-β、S1P和S1P受体1(S1PR1)抑制剂VPC23019处理HUVECs。Western blot检测内皮细胞标志物(CD31和VE-cadherin)、间充质细胞标志物(α-平滑肌肌动蛋白和成纤维细胞特异性蛋白1)、S1PR1和p-Smad3的表达;免疫荧光染色检测Smad3的核转位。结果:与TGF-β组相比,TGF-β+S1P组End-MT进程显著被抑制,Smad3磷酸化及核转位显著减少(P<0.05);而加入S1PR1抑制剂后,上述S1P的作用被逆转(P<0.05)。结论:在HUVECs中,S1P通过S1PR1抑制TGF-β诱导的End-MT,该效应可能与Smad3磷酸化及核转位水平的降低有关。     

MEK1/2在脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达中的作用

目的：探讨MEK1/2在脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）ICAM-1表达中的作用。 方法： 用不同浓度LPS或LPS加MEK1/2特异性抑制剂PD98059和HUVECs孵育不同时间后，分别采用RT-PCR和Western blotting检测ICAM-1 mRNA和蛋白的表达。 结果： LPS呈时间-浓度依赖性地上调HUVECs ICAM-1 mRNA和蛋白的表达。LPS预处理后2 h，HUVECs ICAM-1 mRNA和蛋白的表达即开始升高，LPS(100 μg·L-1)作用后6 h,ICAM-1 mRNA和蛋白的表达基本达到高峰；PD98059(10 μg·L-1)可显著抑制LPS(100 μg·L-1)诱导6 h的ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，抑制率分别为54.4%和44.9%（P<0.01 vs LPS）。 结论： 调控MEK1/2通路可能为内毒素休克诱导血管内皮损伤的防治提供新的策略。     

重组人促红细胞生成素对人脐静脉内皮细胞HoxB2及HoxD3 mRNA表达影响

目的研究重组人促红细胞生成素(rHuEPO)调节体外培养内皮细胞参与血管生成机制。方法从人脐静脉体外分离培养内皮细胞(HUVEC),采用形态学观察及血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ-R Ag)免疫组织化学方法检测进行内皮细胞鉴定,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测HUVEC同源盒HoxB2及HoxD3基因mRNA表达变化。结果与对照组比较,rHuEPO可明显上调内皮细胞HoxB2及HoxD3 mRNA表达水平,差异有统计学意义(P0.05)。结论 rHuEPO可调节内皮细胞HoxB2及HoxD3 mRNA表达,这种调节作用可能是其促血管生成的主要原因之一。     

替格瑞洛对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的 探究不同浓度的替格瑞洛对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞在蛋白及RNA水平表达细胞间黏附分子-1的影响。方法 离体培养人脐静脉内皮细胞,平均接种于6孔培养板,待细胞生长至融合状态时取三孔加入ox-LDL（50 μg/ml）,再分别加入不同浓度的替格瑞洛（0、20、40 μmol/L）。刺激干预24 h后采用Western Blot法测定ICAM-1的蛋白表达水平。重复实验,采用Real-time PCR法测定ICAM-1的RNA表达水平。结果 ①oxLDL能明显上调ICAM-1的表达;②Western Blot蛋白定量结果显示,oxLDL诱导组ICAM-1的蛋白表达明显高于对应的非诱导组（P＜0.05）;未予替格瑞洛干预组ICAM-1的蛋白表达高于替格瑞洛低浓度组（P＜0.05）;替格瑞洛低浓度组ICAM-1的蛋白表达高于替格瑞洛高浓度组（P＜0.05）;③Real-time PCR结果与Western Blot蛋白定量结果一致。结论 oxLDL能在RNA水平提高ICAM-1表达,替格瑞洛能在RNA水平抑制ICAM-1的表达,并与浓度正相关。     

褪黑素抑制白介素-1β诱导的人脐静脉内皮细胞通透性

目的 观察褪黑素(MLT)对自介素-1B(IL-1β)诱导的内皮通透性改变的影响.方法 用不同浓度的IL-1β和MLT干预人脐静脉内皮细胞(HUVECs).用Transwell系统检测透过单层HUVECs的荧光标记的葡聚糖.用免疫荧光和Western blot检测HUVECs钙黏素(VE-cadhefin)的表达.结果...     

活化蛋白C对脂多糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞凋亡的影响研究

目的：观察不同剂量活化蛋白C(APC)对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）凋亡的作用。方法:将培养成功的HUVECs通过LPS（1 mg/L）孵育诱导细胞凋亡模型，并给予APC（10 μg/L）或APC（50 μg/L）建立药物治疗组，同时设立正常对照细胞组和单独LPS（1 mg/L）诱导细胞凋亡组。应用电镜观察细胞超微结构；DNA ladder与TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡情况；Annexin-Ⅴ/PI双标记行流式细胞仪测定定量观察细胞凋亡率。同时采用MTT法测定细胞存活率和Western blotting测定增殖细胞核抗原（PCNA），以观察细胞的增殖变化。结果:通过细胞形态，DNA ladder和TUNEL荧光染色发现单独LPS诱导组的细胞可见明显的凋亡现象，而通过APC治疗组的细胞凋亡改变明显减轻和细胞凋亡率下降，同时细胞存活率和PCNA表达率增高，尤其在50 μg/L时，与单独LPS诱导组细胞比较差异显著（P<0.05）。结论:APC拮抗LPS诱导的血管内皮细胞凋亡并促进细胞的增殖，发挥保护细胞的作用。