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1.
以梭曼水解反应过渡态类似物 O1-甲基 - O2 -(1 ,2 ,2 -三甲基丙基 ) - 2 -羟基 - 5-硝基苯基甲基膦酸为半抗原得到了梭曼单链抗体酶 EP6.对这一株抗体进行了核苷酸序列的测定 ,测序结果表明这一单链抗体基因全长 71 4bp,其中重链长 351 bp,编码1 1 7个氨基酸 ,轻链长 31 8bp,编码 1 0 6个氨基酸 ,二者由编码 (Gly4 Ser) 3的 45bp的连接肽基因相连 .重 ,轻链均为开放读框 ,有明确的四个框架区和三个互补决定区 (CDR)以及抗体特征性的两个半胱氨酸残基 ,表明重 ,轻链的氨基酸序列符合鼠抗体可变区特征 .在 SGI工作站上对 EP6的三维结构进行了同源模建 .计算机模型显示 EP6表面包含一个由重轻链 CDRs围成的 ,可能用于半抗原结合和催化活性的长裂缝 ,其中轻链的 CDR3(L- CDR3)和重链三个 CDRs(H- CDRs)都可能参与抗原或半抗原的接触 ,L- CDR3和 H- CDR2的贡献较大 ,对抗体酶功能可能起重要作用 相似文献
2.
采用计算机模拟方法研究了梭曼4个异构体与乙酰胆碱酯酶(AChE)活性中心的作用情况. 结果表明RR构型的梭曼对AChE的作用最强,而在RS, SS和SR构型的梭曼分子中,由于磷原子(P)上的甲基对His440的排斥作用,使其上的咪唑环旋转,削弱了His440促进磷酰化酶的老化作用,同时也得出梭曼上的(CH3)3C+与Trp84和Phe330残基上的芳香环也有一定的静电相互作用. 相似文献
3.
IQ23 对豚鼠心室肌细胞钙通道和CHO H10细胞异源表达的钙通道α1亚单位的作用 总被引:1,自引:0,他引:1
应用膜片钳全细胞记录技术, 观察了具有正性肌力作用的苄基异喹啉衍化物IQ23,即1-〔对甲氧苄基-2-(N-苄基, N-甲基)〕-6,7-二甲氧基异喹啉盐酸盐,对豚鼠心室肌分离细胞的Ca2+通道, 以及CHO H10细胞表达的Ca2+通道α1亚单位的作用. 结果显示, 当豚鼠心室肌细胞从保持电位(Vh)-50 mV除极至测试电位(Vt)0 mV时, IQ23 3, 10 μmol·L-1分别使Ca2+电流(ICa)由对照的(0.47±0.23) nA增至(0.57±0.23)和(0.79±0.31) nA (P<0.05). 在CHO H10细胞Vt 为20 mV时, IQ23 10 μmol·L-1电压依赖性的增强Ba2+电流(IBa), IBa从(0.45±0.10) nA增至(0.67±0.20) nA (Vh=-80 mV), 或从(0.43±0.08) nA增至(0.60±0.14) nA (Vh=-40 mV). IQ23 10和30 μmol·L-1还分别使电流-电压曲线的峰值和失活曲线的半失活电位向负膜电位方向移动. 实验结果表明, IQ23通过作用于通道的α1亚单位, 对心肌L型Ca2+通道产生电压依赖性激动作用, 此作用为其正性肌力效应提供了部分解释. 相似文献
4.
探讨一氧化氮(NO)在常氧和无氧(0% O2)条件下对肺动脉内皮细胞(PAEC)增殖的影响. 结果表明,无氧和NO合酶抑制剂L-硝基精氨酸(L-NA 2.5 mmol·L-1)培养24 h对PAEC形态无明显影响,NO供体SIN-1(0.1-1.0 mmol·L-1)使常氧与无氧条件下培养的PAEC贴壁细胞明显减少;与常氧组相比,无氧培养24 h使PAEC的[3H]TdR参入降低53%;L-NA对PAEC的[3H]TdR参入无明显影响,SIN-1则浓度依赖性地抑制PAEC的[3H]TdR参入. 流式细胞分析表明,无氧使进入S期和G2/M期的细胞分别增加22%和144%,而进入G0/G1期的细胞降低49%(P<0.01);SIN-1(0.5 mmol·L-1)具有与低氧相似的作用,使进入S期和G2/M期的细胞分别增加42%和104%,而进入G0/G1期的细胞减少41%(P<0.01). 无氧加入SIN-1后使S期细胞增加更为显著. 结果说明低氧和外源性NO均抑制PAEC的增殖,其抑制作用环节可能是阻止G2/M期细胞向G0/G1期过渡. 相似文献
5.
利拉鲁肽(Victoza) 总被引:1,自引:0,他引:1
2010年1月25日,美国FDA批准由丹麦诺和诺德公司研发的利拉鲁肽(liraglutide,商品名为Victoza)注射剂在美国上市,该药被用于治疗部分成年人2型糖尿病。利拉鲁肽目前已完成了在中国的注册研究工作,并已向国家食品药品监督管理局(SFDA)递交上市申请。利拉鲁肽英文化学名称:Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu-(N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37;分子式:C172H265N43O51;相对分子质量:3751.2 ;CAS登记号:204656-20-2。 相似文献
6.
目的 研究硫辛酸对氧化应激的PC12细胞NF-κB - iNOS-NO信号通路的影响。方法 用终浓度为0.4 mmol·L-1的H2O2损伤PC12细胞,用MTT法测定细胞存活率;用激光共聚焦法(LSCM)检测细胞内一氧化氮的动态变化;用RT-PCR法检测iNOS mRNA和NF-κB p65 mRNA表达量的变化。结果 0.4 mmol·L-1的H2O2处理PC12细胞4 h,细胞存活率为27.9%(P<0.01),硫辛酸10 mg·L-1可以提高H2O2损伤的PC12细胞存活率(65.4%,P<0.01);LSCM检测显示,DAF-2荧光强度的比值(Ft/F0)的最大值由损伤模型组的5.34下降到1.80;和模型组比较,iNOS mRNA和NF-κB p65 mRNA的表达明显下调 (P<0.05或P<0.01)。结论 硫辛酸可能通过抑制NF-κB - iNOS-NO信号减轻氧化应激诱导的PC12细胞损伤。 相似文献
7.
甲基莲心碱对豚鼠心肌及猪冠状动脉平滑肌细胞钾通道的作用 总被引:3,自引:0,他引:3
用膜片钳单通道技术,观察在细胞膜内侧加入甲基莲心碱(Nef)后K+通道特性的改变, 以研究Nef对豚鼠心室肌细胞及猪冠状动脉平滑肌细胞K+通道的作用. 结果:Nef可使心肌细胞及冠脉平滑肌细胞上K+通道开放概率(PO)降低. 10, 20 μmol·L-1 Nef分别使心肌细胞K+通道降低(50±32)%和(96±5)%, 30, 50 μmol·L-1的Nef分别使猪冠脉平滑肌细胞上K+通道PO降低(51±21)%和(71±14)%. 结果表明,Nef可从通道内口阻断心肌及平滑肌细胞上K+通道,但对前者的作用更强. 相似文献
8.
目的 含磷毒剂主要是通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)发生毒害作用,本文旨在建立一种在体外快速测定AChE 活性的方法,为有机磷毒剂中毒及解救时AChE活性检测奠定基础。方法 以动物全血红细胞作为AChE的来源,利用硫代乙酰胆碱与巯基显色剂DTNB反应形成黄色化合物的原理,用分光光度法在412 nm处比色定量测定AChE活性。首先利用还原型谷胱甘肽能提供巯基,其显色效应相当于硫代胆碱,故用谷胱甘肽进行DTNB法测定AChE活性标准曲线的绘制;其次进行了DTNB法测定全血样品AChE活性的方法学研究,主要包括对全血进行20, 40和60等不同倍数的稀释后测定AChE活性、使用兔、豚鼠、比格犬及猴等不同动物全血红细胞作为AChE的来源进行AChE活性的测定,同时对不同批次全血样品及同一批次血样不同时间的AChE活性进行测定,验证DTNB法测定AChE活性的方法的可行性;最后选择兔全血红细胞作为AChE的来源,对有机磷毒剂如沙林及梭曼进行了体外药效学评价,梭曼终浓度为6.25 nmol·L-1~0.4 μmol·L-1,沙林终浓度为6.25 nmol·L-1~4 μmol·L-1,以不同浓度沙林及梭曼的负对数对兔子全血AChE抑制百分率的对数作图,求出沙林及梭曼抑制动物全血AChE的量效曲线,计算得到其IC50值和IC90值。结果 以吸光度值(标准管吸光度值-零管吸光度值)为纵坐标,AChE活性为横坐标作图,即得谷胱甘肽标准曲线,标准曲线方程为Y=0.0029+0.1218X,r=0.9999,结果表明,该检测方法在AChE活性为0~10.8 mmol·L-1的范围内保持线性。选取兔全血40倍稀释后作为AChE的来源进行实验,通过对不同动物批内及批间AChE活性进行测定并统计得出,批内差异为0.44%~0.67%,批间差异为1.03%~2.27%。表明该方法批内及批间差异较小,均不超过10%,可以进行有机磷类化合物的体外药效学评价。不同浓度沙林及梭曼对兔全血AChE活性抑制的量效关系表明其作用强度的顺序为:梭曼>沙林,该实验结果与文献报道相符合。梭曼对兔全血AChE量效曲线图表明,其量效曲线方程为:Y= 372.69-45.53X,R=-0.9930;梭曼对兔全血AChE活性抑制的IC50值和IC90分别为83 nmol·L-1和0.62 μmol·L-1。沙林对兔全血AChE量效曲线图表明,其量效曲线方程为:Y= 284.45-3905X,R=-0.9679;沙林对兔全血AChE活性抑制的IC50值和IC90分别为1.2 μmol·L-1和15 μmol·L-1。结论 该方法能够快速测定不同动物全血红细胞AChE的活性,实验结果可靠,重现性好,可用于多种有机磷毒剂体外药效学评价。由于红细胞中AChE全部存在于细胞膜表面,因此,本测定方法不需将红细胞溶解就能够直接测定AChE活性,能够减少制备酶原的过程,适于快速完成体外AChE活性的分析测定。 相似文献
9.
速激肽受体拮抗剂对白三烯C4诱导豚鼠气道收缩和微血管渗漏的作用 总被引:1,自引:0,他引:1
本实验探讨了内源性速激肽是否参与白三烯C4(LTC4)的气道效应. LTC4(0.5 μg·kg-1, iv)可增高豚鼠肺内压(IPP)和气道内依文思蓝渗出。速激肽NK-1受体拮抗剂CP-96345{(2S, 3S)-顺式-2-( 二苯甲基)-N-[(2-甲氧苯)-甲基]-1-杂氮双环[2.2.2]辛烷-3-胺} 1 mg·kg-1,iv,可减弱LTC4诱导的依文思蓝渗出;NK-2受体拮抗剂SR-48968{(S)-N-甲基-N-[4-(4-乙酰氨基-4-苯基哌啶)-2-(3,4-二氯苯基)丁基]苯甲酰胺},1 mg·kg-1, iv,可抑制IPP的增高. 白三烯拮抗剂ONO-1078 (0.03 mg·kg-1, iv)可阻断这两种反应. 结果说明内源性速激肽增强 LTC4的气道作用,其中NK-1受体介导微血管渗漏,NK-2受体介导支气管收缩. 相似文献
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目的 研究胆碱酯酶抑制剂梭曼导致犬发生进行性循环衰竭时酸中毒生化参数指标的变化及新型抗毒剂宾赛克嗪的干预作用。方法 14只杂种犬,雄性,体质量12~15 kg。随机分为循环衰竭组和呼吸衰竭组,每组7只。动物称重、麻醉后,进行气管插管,给予人工正压呼吸。将导管置入左心室、股动脉及股静脉,通过八导电生理记录仪,连续记录心功能及动脉压变化。开始梭曼累积染毒,方法为每次肌内注射1/3LD梭曼(1LD=10 μg·kg-1),每10 min追加1次。呼吸衰竭组以氧分压(paO2)<60 mmHg, 二氧化碳分压(paCO2)>50 mmHg, 氧饱和度(SO2)<90%为标准,在犬达呼吸衰竭标准后,然后立刻用宾塞克嗪0.1 mg·kg-1肌内注射进行抢救。循环衰竭组以平均动脉血压降至45 mmHg为标准,在循环衰竭维持约6 h后静脉注射宾赛克嗪0.1 mg·kg-1进行抢救。检测两组梭曼染毒前、后及抢救后动脉血指标变化。以梭曼染毒前各指标为对照组,染毒后实验结果用SAS6.12软件进行自身对照t检验分析。结果 犬发生呼吸衰竭时,机体pH值由染毒前7.290±0.040降低到7.150±0.050水平,paCO2, paO2由染毒前的(42.6±3.6)mmHg和(92.0±6.4)mmHg改变为(56.1±6.5)mmHg和(38.4±9.3)mmHg,发生显著性差异(P<0.01),使用宾赛克嗪抢救6 h后,与呼吸衰竭中毒时相比pH值升高至7.290±0.110,恢复到染毒前水平;反映酸碱失衡的指标在2 h内均发生显著性改变(P<0.05)。犬发生循环衰竭时,pH值由染毒前的7.345±0.064降低到6.956±0.022,且呈显著性下降(P<0.01),使用宾赛克嗪救治后,平均动脉血压升高为76 mmHg,pH值升高到7.185±0.029水平(P<0.01, n=3~7)。反映酸碱失衡的指标部分有显著性差异。结论 梭曼中毒诱发犬发生呼吸衰竭及循环衰竭时产生酸中毒,使用宾赛克嗪药物抢救后,在酸中毒的早期可得到明显改善作用,后期则能够有效地控制恶化的程度。 相似文献
11.
目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。 相似文献
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目的:抗胶质瘤单克隆抗体建株初期效价为1:10^5,经长期传代培养后效价下降至低于1:10^4,为探索其分子机制并将其改造为有活性的单链抗体,为构建靶向基因转移载体奠定基础。方法:通过RT-PCR克隆该单抗可变区基因,发现轻链可变区CDR1区出现一终止密码子,为此利用PCR定点诱变技术将其突变为该亚组相应的氨基酸,进一步构建单链抗体表达载体,并在大肠杆菌表达。结果:改造后的单链抗体能高效表达,Western blot和免疫荧光证实能与相应的膜抗原特异结合。结论:成功地改造并构建单链抗体,可用于胶质瘤靶向基因治疗。 相似文献
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目的:通过计算机辅助分子模拟,解析抗乙酰胆碱酯酶(AChE)单克隆抗体3F3抑酶的分子基础.方法:用柔性连接肽(Gly4Ser)3连接VH及VL设计3F3单链抗体(Sc3F3).将重组的Sc3F3的氨基酸序列进行计算机辅助分子模建,并与抗原分子AChE对接,模拟抗原抗体反应的三维模式.结果:模拟的Sc3F3结构具有经典抗体的共性特征,抗体的重链和轻链可变区都含有两个β片层和片层连接区.单链抗体与AChE相互作用对接图显示形成了稳定的结构.范德华力起着重要的作用,提示Sc3F3与AChE通过疏水作用形成复合物.结论:从Sc3F3与AChE形成复合物的空间结构看出Sc3F3结合在胆碱酯酶活性中心狭缝的入口处,对底物进入活性中心起到阻碍作用. 相似文献
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抗表皮生长因子受体噬菌体抗体库的构建筛选及单链抗体可溶性表达 总被引:1,自引:0,他引:1
近年来的研究表明,表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 是肿瘤治疗中一个很重要的靶点。本研究应用噬菌体展示技术筛选EGFR特异性单链抗体 (single chain Fv, scFv)。利用高表达EGFR的人鳞状上皮癌细胞A431免疫小鼠,提取脾细胞mRNA,RT-PCR扩增VH和VL基因并拼装成scFv基因。将scFv基因连接到噬菌粒pCANTAB 5E中,电击转化E.coli TG1细胞,构建了库容为2.5×107的噬菌体单链抗体库。用纯化的EGFR为靶抗原对噬菌体抗体库进行5轮富集筛选,得到次级抗体库6F-10。挑取48个克隆进行ELISA测定,45个克隆为阳性。取阳性值最高的克隆感染E.coli HB2151,IPTG诱导scFv的表达。scFv (约27 kD) 以可溶形式存在于细胞质及细胞周质中,并可分泌至上清液。测序结果表明,scFv基因序列全长768 bp,编码256个氨基酸。VH为与小鼠Ig同源的重链可变区基因,VL为κ型轻链可变区基因;VH和VL均由3个抗原互补决定区和4个框架区构成。免疫印迹和细胞免疫荧光显示,可溶性scFv可分别与纯化的EGFR抗原以及细胞表面的EGFR发生特异性结合。抗EGFR特异性scFv的获得,为研制靶向EGFR的抗体药物与研究生物治疗提供导向载体分子。 相似文献
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目的探讨用抗CD3抗体重链可变区与轻链可变区基因,经重叠延伸拼接连接形成单链抗体。方法用DNA序列分析及动态模拟构象分析,并与相关软件分析,推导Scfv基因编码的氨基酸序列。结果该基因全长732bp,三维构象稳定,兼容性分数S>0。将单链抗体基因克隆于载体中,在强启动子作用下,目的蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的20%。结论重链可变区与轻链可变区经短肽连接而成的单链抗体,具有分子量小,免疫原性低的特性,具有较广的应用前景。 相似文献
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目的 克隆人脂联素单链抗体基因并进行表达。方法提取分泌抗脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,与质粒pUC19载体连接,形成克隆,并对其进行鉴定分析。结果抗体重、轻链可变区扩增拼接后的重、轻链各约为340bp、350bp,基因全长约710bp,将拼接产物插入pUC19质粒中转化大肠杆菌JM109,得到数个克隆,经酶切分析约含710bp片段,与拼接结果基本相同,经测定特异性较好,与其他杂蛋白及载脂蛋白没有交叉反应。结论抗人脂联素单链抗体基因的克隆和表达较为成功。 相似文献
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目的 欲用计算机模拟及分子对接技术揭示抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体 3F3抑酶的分子基础 ,但 3F3分子远大于乙酰胆碱酯酶 (AChE) ,难以操作 ,故拟用其单链抗体为工具进行研究。本研究旨在设计、克隆并表达抗AChE单链抗体Sc3F3基因 ,推演重组单链抗体的氨基酸顺序 ,并证明纯化的重组单链抗体有抑制AChE的作用。方法 使用分泌抗电鳐AChE单克隆抗体 3F3(3F3Ab)的杂交瘤细胞提取总RNA。用RT PCR技术扩增重链可变区 (VH)cDNA及轻链可变区 (VL)cDNA基因 ,通过连接肽(Gly4 Ser) 3 基因将VH 基因和VL 基因连接 ,制成单链抗体基因 (ScFv)。将ScFv基因插入载体pCANTAB 5E用于表达。在大肠杆菌中表达的 3F3单链抗体(Sc3F3)用SephadexG75凝胶过滤和QAE SephadexA 5 0离子交换层析纯化。AChE与抗体的免疫反应性用ELISA法测定。AChE活性用微量羟胺比色法测定。结果 测序结果证明所克隆的ScFv基因是功能重排基因 ,长度为 72 3bp。重、轻链基因长度分别为 35 7bp和 32 1bp。ScFv基因 (含连接肽基因 )所编码的纯化的重组Sc3F3的分子量为 31.6ku。Sc3F3与AChE反应良好 ,但对AChE活性的抑制明显弱于 3F3Ab。Sc3F3的抑制效力约为 3F3Ab的 1/10。结论 在计算机模拟及分子对接研究中使用本研究设计的单链抗体Sc3F3应是可靠的 相似文献
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本研究从哮喘患者外周血分离淋巴细胞、提取总mRNA,采用RT-PCR技术分别构建重链可变区VH(variable region of heavy chain)和轻链可变区VL(variable region of light chain)cDNA库,然后通过连接肽(Gly4Ser)3和特定引物将VH和VL cDNA基因组装成人源单链抗体(scFv)核糖体展示模板基因库。应用兔网织红细胞核糖体展示技术,单引物原位反转录技术,经3轮展示富集并回收针对人源IgE蛋白(免疫球蛋白E)的目的单链抗体基因;回收的抗体基因经双酶切后与pET22b(+)载体连接,转化至E.coli Rosseta(DE3)宿主细胞,应用菌落PCR结合Dot blotting技术快速鉴定阳性克隆,抗原ELISA法进一步鉴定阳性克隆。VH和VL基因库得到正确的构建,长度分别为400和710 bp,库容为1013。核糖体展示模板构建正确,长度为1 100 bp。该基因库经过3轮针对IgE蛋白的核糖体展示,目的基因得到了有效富集和回收。经过高效克隆、表达和鉴定,确定1株针对人IgE蛋白显示最强亲和力的阳性克隆菌pET-IgE-6。经测序和序列分析证实该单链抗体为人源抗体,序列未见国内外报道。结果表明,采用患者外周血构建人源抗体基因库,结合核糖体展示技术,可以成功获得高亲和力的人源单链抗体分子。该技术路线为快速获得具有药用价值的人源抗体提供了参考。 相似文献
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Molecular genetic basis of rapid and slow acetylation in mice 总被引:1,自引:0,他引:1
The molecular genetic basis of N-acetylation polymorphism has been investigated in inbred mouse models of the human acetylation polymorphism. Two genomic clones, Nat1 and Nat2, were isolated from a C57BL/6J (B6) mouse (rapid acetylator) genomic library. The Nat1 and Nat2 genes both have intronless coding regions of 870 nucleotides and display greater than 47% deduced amino acid similarity with human, rabbit, and chicken N-acetyltransferases. Amplification of Nat1 and Nat2 from A/J (A) mouse (slow acetylator) genomic DNA by the polymerase chain reaction and subsequent sequencing revealed that Nat1 was identical in B6 and A mice, whereas Nat2 contained a single nucleotide change from adenine in B6 to thymine in A mice. This nucleotide substitution changes the deduced amino acid at position 99 from asparagine in B6 to isoleucine in A mice. Hydropathy analysis revealed that this amino acid change alters the hydropathy of the flanking peptide segment in NAT2 from hydrophilic in the B6 mouse to hydrophobic in the A mouse. The amino acid change occurs in a region of the gene where no polymorphism has yet been reported in human or rabbit NAT2 and may represent an important structural domain for N-acetyltransferase activity. Nat1 and Nat2 have the same 5' to 3' orientation in the B6 mouse; the two genes are separated by approximately 9 kilobases, with Nat1 located 5' of Nat2. 相似文献