血管平滑肌细胞的培养及其在心血管疾病研究中的应用

平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）是冠状动脉粥样硬化和再狭窄病变中的主要细胞成份之一，受多种因素调节，各种细胞因子和信号途经相互作用，协调细胞生理及病理状态下的表达和功能。细胞培养方法的建立为研究SMC提供了稳定可靠的方法学，也为了解SMC的特性和分化规则，找寻血管疾病的病因和防治方面起到重要作用。SMC在组织工程学和基因治疗中的应用，为心血管疾病的治疗带来了曙光。     

组织因子途径抑制物基因转移对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的研究组织因子途径抑制物基因转移对兔血管平滑肌细胞迁移的影响,探讨其抑制再狭窄的机制。方法将含有人组织因子途径抑制物基因的重组腺病毒和含β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒在体外分别转染兔血管平滑肌细胞,用X-gal染色法检测腺病毒的转染率,用逆转录聚合酶链反应方法检测转染后平滑肌细胞中组织因子途径抑制物mRNA的表达,于第13、、5及7天用玻片法检测血管平滑肌细胞迁移距离。结果感染指数为100,腺病毒的转染率可达到95%;基因转移后3天在血管平滑肌细胞中检测到组织因子途径抑制物mRNA的表达;同一浓度下转染组织因子途径抑制物基因重组腺病毒组和对照组相比迁移距离显著减少(P<0.001),并具有浓度依赖性。结论腺病毒具有较高的转染培养的血管平滑肌细胞的能力,组织因子途径抑制物基因转移能够显著抑制体外培养的兔血管平滑肌细胞迁移,并且这种抑制作用具有浓度依赖性。     

脑血管疾病基因治疗的实验研究

研究证实缺血集聚产生组织损伤是通过缺血坏死和凋亡两条途径。脑缺血后需要确定凋亡受累基因。用阻滞凋亡细胞死亡制剂可以作为治疗急性缺血性卒中的另一途径。近期,基因转移至体外和活体内的颈动脉颅内血管已获得成功,可用于预防蛛网膜下腔出血后的血管痉挛,刺激侧支血管生长,稳定粥样硬化斑块和预防血管成形术后的再狭窄。基因转移也可治疗因细胞激酶抑制或过度表达和神经细胞作用下的缺血。     

缺血性脑血管病的基因研究及治疗进展

本文介绍了目前缺血性脑血管病（ICVD）的基因研究及治疗进展,主要讨论了有关缺血性脑血管病的基因研究、基因治疗、载体等问题。     

腺病毒介导性基因导入血管平滑肌细胞

目的 :探讨腺病毒介导性基因导入血管平滑肌细胞 ( SMC)的有效性。方法 :选用含有细菌 L ac Z基因的重组腺病毒及脂质体载体导入培养主动脉 SMC并用组织化学法定性定量检测基因表达的产物。结果 :腺病毒与 SMC接触几分钟就可使 SMC转染 ,2 h即可使 10 0 %的细胞受其转染并表达 L ac Z基因 ;基因表达的程度与病毒滴度呈剂量依赖关系 ;转染后 2 4h即可在 SMC中检出外源基因的表达 ,3～ 5 d达高峰 ;脂质体转导法仅可使不足 1%的 SMC表达外源基因 ;腺病毒介导性基因导入法约为脂质体转导法的 2 5 0倍。结论 :本研究获得的腺病毒介导性基因导入 SMC的多种参数 ,可为其未来的研究和治疗应用提供依据     

野生型p53基因转移对体外增减的血管平滑肌细胞增殖的抑制？…

正确构建了介导野生型Ｐ５３基因转移的复制缺陷重组腺病毒，将其感染体外增减的兔血管平滑肌细胞，结果表明腺病毒能介导野生型ｐ５３基因高效地转移和表达，对ＶＳＭＣ的增殖具有明显的帽作用；     

不同方法对血管平滑肌细胞表型特性影响的实验研究

目的 通过两种分离方法体外获取血管平滑肌细胞（VSMCs）,比较细胞表型差异及生物学特性,为血管性疾病研究提供精确实验基础.方法 分别采用组织块法及酶消化法获取SD大鼠胸主动脉VSMCs,分为组织块组与酶消化组.倒置显微镜、结晶紫染色观察形态学改变并定量分析;MTT比色法及TransweU细胞迁移实验分别检测分析细胞增殖与迁移活性;流式细胞周期测定细胞周期分布;细胞免疫荧光染色鉴定VSMCs并测定分析收缩型标记蛋白α-平滑肌肌动蛋白（SMA）以及合成型标记蛋白平滑肌胚胎型肌球蛋白重链（SMemb）、原肌球蛋白-4（TPM-4）表达量的变化.结果 两组细胞SMA细胞免疫荧光染色阳性率≥95％,细胞呈现谷峰状结构生长.组织块组与酶消化组两组细胞长径径值分别为（95.10±16.23）μm和（114.67±15.92）μm.与酶消化组相比,组织块组细胞增殖及迁移活性分别增加23.04％和1.54倍（P＜0.05）,S＋G2期所占比例增加49.68％（P＜0.05）,SMA蛋白表达量下降（P＜0.05）,SMemb及TPM-4蛋白表达均增加（P＜0.05）.结论 组织块法获取细胞多以合成表型为主,酶消化法则主要呈收缩表型.伴随细胞形态学、增殖及迁移活性、表型特异性蛋白表达等不同改变,两种细胞获取方法可为不同目的研究提供精确的体外模型.     

野生型p53基因转移对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

作者用正确构建的带野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒感染体外培养的血管平滑肌细胞(VSMC),结果表明p53基因转移对VSMC的增殖具有明显的抑制作用;PCR扩增法证实了病毒感染的VSMC中含有外源性p53基因;半定量逆转录PCR方法显示有p53基因mRNA的表达;Western blot印迹转移证明有外源性p53蛋白的表达。进一步证明了作者构建的重组p53腺病毒载体的正确性和有效性,为高血压病、动脉粥样硬化、PTCA术后再狭窄等疾病的基因治疗提供了实验依据。     

转导人TIMP-2基因抑制胃癌浸润转移的实验研究

目的外源性人ＴＩＭＰ－２基因在人ＬＡＫ细胞中的表达及其对胃癌浸润转移的抑制作用。方法通过磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀的方法将ＴＩＭＰ－２重组真核表达质粒ｐＬ（ＴＩＭＰ－２）ＳＮ转染兼性包装细胞ＰＡ３１７包装形成病毒颗粒。用病毒液感染人ＬＡＫ细胞,再以Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及反向酶谱试验进行表达及活性分析。用转基因ＬＡＫ细胞（ＬＡＫ／ＬＴ）２×１０６给胃癌转移模型腹腔内注射。结果ＴＩＭＰ－２在ＬＡＫ／ＬＴ中ｍＲＮＡ高度表达,在ＬＡＫ中弱表达。ＬＡＫ／ＬＴ细胞中有相对分子质量２１０００大小的蛋白质表达,具抑制Ⅳ型胶原酶降解明胶的活性。肿瘤种植后１０周,对照组肿瘤体积为（４．００±１．７０）ｃｍ３,肝转移率和腹膜转移率均达１００％,脾脏转移率为７０％（ｎ＝１０）;单用ＬＡＫ细胞治疗组肿瘤体积为（２．７２±１．２０）ｃｍ３,肝及腹膜转移率分别为６０％和７０％;ＴＩＭＰ－２高表达的ＬＡＫ／ＬＴ细胞治疗组肿瘤体积仅（１．２１±１．１６）ｃｍ３,肝转移率与腹膜转移率仅分别为２０％和３０％。肿瘤生长抑制率达７０％,肝及腹膜转移抑制率分别为８０％和７０％。结论ＴＩＭＰ－２对胃癌生长及转移具有抑制作用。     

转VEGF基因对血管损伤后平滑肌细胞增殖和表型的影响

目的：观察局部转染pAdTrack CMV-VEGF165对动脉粥样硬化兔血管损伤后平滑肌细胞增殖和表型转变的影响。方法：90只新西兰大白兔分为3组,I组（30只）单纯拉伤腹主动脉;Ⅱ组（30只）拉伤后局部转染真核表达质粒pAdTrack CMV;Ⅲ组（30只）拉伤后局部转染pAdTrack CMV-VEGF165;每组按实验终点（术后3d、1周、2周、4周和8周）分为5个亚组,术前1周开始予高脂饮食至实验终点,取拉伤段血管用于^3H-TdR掺入实验、病理学检测和电镜观察平滑肌细胞表型变化。结果：^3H-TdR掺入实验结果显示,I组和Ⅱ组在血管拉伤后3d ^3H-TdR掺入量增加（P＜0．05）,2周时达到高峰（P＜0．01）,以后逐渐下降,8周时恢复至正常,而Ⅲ组血管组织术后3d同样出现^3H-TdR掺入增加（P＜0．05）,术后1周时^3H-TdR掺入值明显低于I组和Ⅱ组（P＜0．01）,术后4周时^3H-TdR掺入量接近正常;透射电镜观察显示I组和Ⅱ组从术后3d开始出现合成型VSMC,2周时达到高峰,80％以上为合成型,至4周时,仍以合成型平滑肌细胞为主（60％）,而Ⅲ组血管组织术后3d时可见少量合成型平滑肌细胞（10％）,1周时合成型VSMC约占30％,术后2周时90％为收缩型平滑肌细胞,4周时已无合成型平滑肌细胞。结论：局部转染VEGF165基因可抑制平滑肌细胞增殖和表型改变,缩短修复时程。     

线粒体融合素基因2突变体Mfn2-1A抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖及机制研究

目的:研究线粒体融合素基因2(Mfn2)的突变体片段Mfn2-1A,对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞的增殖抑制作用,并进一步探讨相关作用机制。方法:用已构建的重组腺病毒Adv-Mfn2-1A感染大鼠血管平滑肌细胞,利用细胞计数、四甲基偶氮唑盐比色法检测血管平滑肌细胞增殖,流式细胞仪检测细胞生长周期,蛋白免疫印迹法分析Mfn2-1A对信号通路Mek-Erk1/2蛋白表达水平的影响。结果:重组腺病毒Adv-Mfn2-1A感染平滑肌细胞能正常表达相应蛋白;转染Adv-Mfn2-1A后能抑制平滑肌细胞增殖(P<0.05),第3天开始效果明显;Adv-Mfn2-1A较Adv-Mfn2作用效果更显著(P<0.05);转染Adv-Mfn2-1A和Adv-Mfn2后阻滞于G0/G1期的细胞明显增多,转染Mfn2-1A后阻滞在G0/G1期细胞达到(77.74±3.67)%;Mfn2-1A可降低平滑肌细胞中磷酸化Erk1/2蛋白的表达,效果比Mfn2更明显(P<0.05)。结论:Mfn2基因突变体片段1A可明显抑制血管平滑肌增殖,使细胞阻滞在G0/G1期,其机制与抑制Mek-Erk1/2信号通路有关。     

Gremlin promotes vascular smooth muscle cell proliferation and migration

Recent reports highlight the importance of BMP in the vasculature. We investigated the expression pattern and role of the BMP antagonist gremlin in VSMC. We detected gremlin mRNA constitutive expression in adult and embryonic rat aortic VSMC, and in rat carotids. In vitro analysis demonstrated that angiotensin II, TGF-β1 and PDGF induced significant changes in gremlin mRNA expression. Gremlin stable overexpression in A7r5 cells blocked BMP signaling. BMP-induced reduction in VSMC DNA synthesis was markedly inhibited by gremlin overexpression. In fact, gremlin overexpression increased DNA synthesis and cell counts, and accelerated cell cycle progression of VSMC, through mechanisms that include p27^kip1 down-regulation. Gremlin also led to marked increments in VSMC migration. In addition, gremlin gene silencing promoted a significant blockade on cell proliferation and migration. In vivo studies disclosed increased gremlin protein expression in the neointima of balloon-injured carotid arteries. In summary, the BMP antagonist gremlin is constitutively expressed in the normal vasculature. Gremlin induces VSMC proliferation and migration and is significantly regulated by growth factors and injury. We postulate that gremlin plays a part in the development of pathological phenotypic changes of adult VSMC.     

可罗卡林对血管平滑肌细胞增殖及c-myc基因表达的影响

目的：观察对大鼠主动脉平滑肌细胞起负调节作用的可罗卡林(cromakalim对同型半胱氨酸(hcy)刺激的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖及c—myc基因表达的影响。方法：在建立hcy诱导的平滑肌细胞增殖模型后，应用流式细胞术观察VSMC增殖周期的变化；并用免疫细胞化学方法观察可罗卡林对VSMC增殖及c—myc基因蛋白表达的影响。结果：可罗卡林使VSMC处于G0／G1期的细胞数显著增多(P＜0．01)，S期G2 M期的细胞数显著减少(P＜0．01．)，能够抑制hcy诱导的VSMC增殖和c—myc基因蛋白表达的增加。结论：可罗卡林对hcy诱导的VSMC增殖有显著的抑制作用，其作用机制与抑制c—myc基因表达有关。     

巨噬细胞集落刺激因子与血管平滑肌细胞增殖

目的一些以血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖为特点的血管疾病，在病变部位常有巨噬细胞浸润。本研究巨噬细胞集落刺激因子（ＭＣＳＦ）在ＶＳＭＣ生长调节中的作用。方法实验采用培养大鼠主动脉ＶＳＭＣ，细胞增殖观察指标采用氚标胸腺嘧啶核苷掺入法，并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ技术测定原癌基因表达。结果（１）Ｌ９２９细胞上清液（富含ＭＣＳＦ）及重组ＭＣＳＦ以剂量依赖关系刺激氚标胸腺嘧啶核苷掺入；（２）ＶＳＭＣ在接受刺激后表达某些原癌基因，如ｃｆｏｓ、ｃｍｙｃ、ｅｒｇ１和ＪｕｎＢ；（３）凝血酶、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ与ＭＣＳＦ在促增殖作用上具有协同作用。结论ＭＣＳＦ与其它生长因子协同作用，通过自分泌／旁分泌机制调控ＶＳＭＣ增殖，从而可能在血管病变的形成和进展中起重要作用     

青蒿素对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :观察青蒿素 (artemisinin ,Art)对体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞 (VSMC)的增殖、DNA合成及细胞周期的影响 ,探讨作用机制。方法 :体外培养大鼠主动脉VSMC ,分为不同浓度的Art组及对照组。观察细胞生长曲线 ;四甲基偶氮唑盐微量酶反应 (MTT)法检测细胞活性 ;3H 胸腺嘧啶脱氧核苷(3H- TdR)掺入法观察其对DNA合成的影响 ;通过HE染色、DNA梯带检测和流式细胞术观察细胞的凋亡并测定细胞周期。结果 :与对照组相比 ,各浓度Art组VSMC计数不同程度减少 ,3H- TdR掺入率降低 ,细胞增殖受抑制 ,VSMC凋亡增加 ,并呈浓度依赖性 ;Art诱导细胞凋亡 ;使细胞周期阻滞于G0 / G1 期。结论 :Art对体外培养VSMC的增殖有抑制作用 ,可能通过抑制细胞DNA合成 ,诱导细胞凋亡及干扰细胞周期等途径发挥作用     

野生型p53基因转移对体外培养的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及其机制的研究

正确构建了的介导野生型ｐ５３基因转移的复制缺陷型重组腺病毒，将其感染体外培养的兔血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ），结果表明腺病毒能介导野生型ｐ５３基因高效地转移和表达，对ＶＳＭＣ的增殖具有明显的抑制作用；应用电镜、流式细胞计数仪、原位末端标记等方法，探讨野生型ｐ５３基因抑制ＶＳＭＣ增殖的机制。结果显示ｐ５３基因转移可有效地导致ＶＳＭＣ明显的Ｇ１期阻滞及大量凋亡，为高血压病、动脉粥样硬化、ＰＴＣＡ术后再狭窄等疾病的基因治疗提供了实验依据     

紫杉醇抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的实验研究

目的 以体外培养的大鼠血管平滑肌细胞为研究对象,探讨紫杉醇对平滑肌细胞增殖的作用.方法 SD大鼠腹腔注射麻醉后,解剖、分离其主动脉,仔细分离血管的平滑肌层并剪成小块置于培养瓶中培养.采用倒置像筹显微镜下观察及α平滑肌肌动蛋白免疫荧光检测对传4代～6代的细胞进行鉴定.根据加入的干预药物将平滑肌细胞分为无血清M199培养基组(A组)、1 nmol/L紫杉醇组(B组)、10 nmol/L紫杉醇组(C组)及100 nmol/L紫杉醇组(D组)共4组,每组均为5个样本.采用流式细胞仪检测不同干预组平滑肌细胞的生长周期,用增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)检测方法 检测细胞的PCNA阳性百分比.结果 培养约2周后出现大量细胞生长,可见致密的细胞层.倒置像差显微镜下观察,细胞呈梭形;随着细胞融合度的增加,可以看到平滑肌细胞特有的"峰-谷"生长现象.培养的血管平滑肌细胞α平滑肌肌动蛋白免疫荧光检测呈阳性,总阳性率大于90%.随着紫杉醇用量的增加,细胞的PCNA阳性百分比呈逐渐减少的趋势,与对照组(A组)比较,10 nmol/L(C组)和100 nmol/L(D组)两种浓度下的紫杉醇引起的PCNA阳性率明显减低.流式细胞仪检测显示,随着紫杉醇用量的增加,细胞S期百分比旱逐渐减少的趋势.与对照组相比,10 nmol/L(C组)和100 nmol/L(D组)两种浓度下的紫杉醇引起的S期百分比明显减低.结论 紫杉醇能够抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖.     

紫杉醇抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的实验研究

目的以体外培养的大鼠血管平滑肌细胞为研究对象,探讨紫杉醇对平滑肌细胞增殖的作用。方法SD大鼠腹腔注射麻醉后,解剖、分离其主动脉,仔细分离血管的平滑肌层并剪成小块置于培养瓶中培养。采用倒置像差显微镜下观察及α平滑肌肌动蛋白免疫荧光检测对传4代～6代的细胞进行鉴定。根据加入的干预药物将平滑肌细胞分为无血清M199培养基组（A组）、1nmol／L紫杉醇组（B组）、10nmol／L紫杉醇组（c组）及100nmol／L紫杉醇组（D组）共4组,每组均为5个样本。采用流式细胞仪检测不同干预组平滑肌细胞的生长周期,用增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）检测方法检测细胞的PCNA阳性百分比。结果培养约2周后出现大量细胞生长,可见致密的细胞层。倒置像差显微镜下观察．细胞呈梭形：随着细胞融合度的增加,可以看到平滑肌细胞特有的“峰-谷”生长现象。培养的血管平滑肌细胞α平滑肌肌动蛋白免疫荧光检测呈阳性,总阳性率大于90％。随着紫杉醇用量的增加,细胞的PCNA阳性百分比呈逐渐减少的趋势,与对照组（A组）比较,10nmol／L（C组）和100nmol／L（D组）两种浓度下的紫杉醇引起的PCNA阳性率明显减低。流式细胞仪检测显示,随着紫杉醇用量的增加,细胞S期百分比呈逐渐减少的趋势。与对照组相比,10nmol／L（C组）和100nmol／L（D组）两种浓度下的紫杉醇引起的S期百分比明显减低。结论紫杉醇能够抑制大鼠向管平滑肌细朐的增殖．