16S rRNA基因序列鉴定标本中病原细菌的方法学研究

目的研究16S rRNA基因序列鉴定标本中病原微生物的关键技术,评价序列分析技术作为病原微生物检测方法的可行性和实用件。方法对117份不同来源的临床标本分别采用形态学、细菌培养、16S rRNA基因扩增与测序分析,比较不同方法对病原菌检出的灵敏度与特异性。分子技术通过改良的微量核酸提取方法,扩增16S rRNA基因两个区域（BSF8-BSR534和BAK11 w-BAK2）。结果细菌培养和PCR检测的阳性率分别是49％（57／117）和72％（84／117）,63％（53／84）的PCR产物通过直接测序鉴定到种;60例（52％）培养阴性标本中有7例（12％）经序列分析再次鉴定出病原菌;形态学检查阳性率为64％（75／117）,与PCR结果接近,两者结合可提供推测性报告。第1对引物（扩增区：BSF8-BSR534）较适合革兰阳性细菌分类,第2对引物（扩增区：BAK11w-BAK2）对临床常见病原菌均可获得理想的序列。结论改进核酸提取技术、筛选恰当的引物、优化基因扩增和测序流程,通过16S rRNA基因序列直接鉴定标本中病原微生物有着广阔的应用前景。     

16SrDNA测序在儿童血流感染细菌性病原菌分布中的应用

目的：探讨PCR方法在分析血流感染病原菌分布中的作用,为儿童细菌性血流感染的流行病学调查提供新的思路。方法从儿科重症监护病房（PICU）收集100份疑似血流感染患儿的外周静脉血进行血培养,同时扩增并测序细菌16S rDNA,比较培养结果与PCR结果。结果100份血液标本中11份细菌培养阳性,阳性率为11%;PCR法23份阳性,阳性率为23%,二者比较差异具有统计学意义（χ2=10.08,P〈0.05）;在23例PCR阳性标本中,革兰氏阳性球菌占65.2%,其中表皮葡萄球菌最多（6例,26.1%）,革兰氏阴性菌占34.8%,以大肠埃希菌为主（4例,17.4%）。结论16S rDNA-PCR结合测序的方法可以很好地鉴定血流感染病原菌,与血培养相比能更客观地反映病原菌分布,可作为一种新的流行病学方法在临床应用;儿科重症监护病房血流感染病原菌以革兰氏阳性球     

应用寡核苷酸探针阵列法快速鉴定临床分离株中的分支杆菌

目的:建立一种简便、快速、灵敏、特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方法:通过16S rRNA聚合酶链反应(polym erase chain reaction,PCR)-单链构象多态性(single-stranded conform ation polymorph ism,SSCP)分析鉴定253株分支杆菌临床分离株;应用16S rRNA PCR-寡核苷酸探针与待测菌株生物素标记的16S rRNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。结果:分析28种分支杆菌标准菌株和9种非分支杆菌菌株,结果显示寡核苷酸探针是特异的。253株分支杆菌临床分离株,198株为结核分支杆菌复合群,55株为非结核分支杆菌。经寡核苷酸探针阵列法分析,198株结核分支杆菌分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,36株鉴定为非结核分支杆菌,分别与相对应的特异探针杂交,另19株与分析探针杂交阴性。结论:16S rRNA PCR-寡核苷酸探针阵列法灵敏度高、特异性强、简便、快速,可用于鉴定临床分离株分支杆菌菌种。     

基于16S rDNA测序技术分析异烟肼致大鼠肝损伤中肠道菌群变化特征

目的采用16S rDNA测序技术分析异烟肼(INH)致大鼠抗结核药物性肝损伤(ADLI)时肠道菌群的变化情况。方法将24只雄性SD大鼠随机均分为对照组(D0组)、INH灌胃10 d组(H10组)、INH灌胃28 d组(H28组),分别于连续灌胃0、10和28 d后收集大鼠新鲜粪便进行16S rDNA测序,分析肠道菌群的结构和组成,并取肝组织进行HE染色,观察大鼠肝组织病理学变化。结果与D0组比较,H10组和H28组α多样性未发生改变(均P>0.05),β多样性发生变化(均P<0.05),门水平上Verrucomicrobia丰度减少而Tenericutes丰度增加(均P<0.05),属水平上Lactobacillus、Romboutsia和Akkermansia丰度减少而Ruminococcaceae_UCG-005、Dubosiella、norank_f__norank_o__Mollicutes_RF39、unclassified_f     

16S rDNA序列分析在临床不常见细菌鉴定中的初步应用

目的建立细菌16S rDNA序列分析技术并探讨其在临床不常见细菌鉴定中的应用价值。方法收集经全自动微生物分析系统鉴定其可靠率在99%及以上的常见细菌10株和常规方法难以鉴定或少见菌17株,通过PCR扩增16S rDNA v3-v4区基因片段并进行序列测定,序列与16SpathDB 2.0数据库上已知细菌的16S rDNA序列进行比对分析确定细菌种属。当v3-v4序列片段不能明确鉴定细菌时,结合16S rDNA长片段测序及管家基因dnaJ和rpoB的序列做进一步分析。结果经16S rDNA v3-v4区序列分析,10株(100%)临床常见菌都能鉴定到种水平,其可靠性大于98.0%。17株不常见菌株中,10株(58.8%)细菌只与1种菌相似性大于98.0%,成功鉴定到单个种水平;6株(35.3%)细菌与不止1种菌的相似比大于98.0%;1株菌与已知菌相似性在96.0%~98.0%之间只能鉴定到属(棒状杆菌)。进一步结合16S rDNA长片段及管家基因dnaJ和rpoB的序列分析,所有菌株均可鉴定到单个种水平。结论结合16S rDNA和管家基因序列分析,可用于临床常见及不常见细菌的分子鉴定。     

基于16S rDNA测序的帕金森病患者肠道菌群初步分析

目的对帕金森病患者的肠道菌群进行初步分析。方法收集2018年10月～2019年4月某三甲医院收治的7例帕金森病患者及7例健康对照者的粪便样本,提取菌群DNA,选取细菌16S r DNA的V3～V4区序列进行基因扩增及Illumina测序,生物信息学分析肠道菌群测序数据。结果 Alpha多样性分析中,Chao指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数在两组样本间无显著统计学差异(P0.05)。在界、门分类水平上PD组及健康对照组物种数目相等,在纲、目、科、属、种、OTU分类水平上PD组所包含的物种数目依次高于健康对照组。受试样本中肠道菌群结构由4个主要的菌门组成,分别为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门。在PD组中,检测到了12种显著升高的肠道菌群组分(P0.05)。结论帕金森病患者与健康对照者的肠道菌群结构在大体上是相似的,有部分菌群在两组间存在着差异,深入分析肠道菌群变化有望为研究帕金森病的发病机制、疾病预防及治疗提供新思路。     

曲霉菌临床分离株的分子鉴定及体外抗真菌药物敏感性分析

目的 研究曲霉菌临床分离株的分子鉴定及体外抗真菌药物的敏感性。方法 采用Internal Transcribed Spacer（ITS）及β-tubulin基因部分测序对临床分离的53株经形态学鉴定为曲霉的菌株进行分子鉴定,并按照美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的M38-A2微量液基稀释法测定唑类（伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑）,两性霉素B和棘白菌素类（米卡芬净、阿尼芬净和卡泊芬净）共7种抗真菌药物对所有菌株的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）或最低有效浓度（minimum effective concentration, MEC）。结果 53株曲霉菌包含烟曲霉复合体22株（烟曲霉21株和仑图卢斯曲霉1株）,黑曲霉复合体23株（塔宾曲霉16株、黑曲霉5株和百岁兰曲霉2株）及土曲霉和黄曲霉各4株;米卡芬净、阿尼芬净、卡泊芬净、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B对曲霉菌株的MIC90为0.031、0.031、0.25、0.5、0.5、1、2μg/mL。除1株烟曲霉对伊曲康唑（MIC≥16μg/mL）和伏立康唑（MIC为2μg/mL）耐药及1株仑图卢斯曲霉对两性霉素B耐药（MIC为8μg/mL）外,其余菌株对7种药物均敏感。4种曲霉复合体对7种抗真菌药物的敏感性差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 棘白菌素类药物体外抗曲霉菌活性最好,两性霉素B体外抗曲霉菌活性相对较差,唑类药物介于以上两者之间。不同种曲霉菌对不同抗真菌药物的敏感性存在差别。     

基于16S r DNA测序检测原发性胆汁性胆管炎患者肠道菌群的变化

目的 研究原发性胆汁性胆管炎(PBC)患者的肠道菌群丰度和多样性。方法 收集2018年1月至2019年1月期间浙江大学医学院附属第一医院收治的9例原发性胆汁性胆管炎患者(另有8名健康者作为健康对照),分别提取肠道菌群DNA,采用16S rDNA高通量测序方法扩增V3～V4区序列相应基因片段,建库测序及生物信息学分析。结果 Alpha多样性分析中,两组间Ace指数、Chao指数、Simpson指数、Shannon指数比较,差异无统计学意义(P0.05)。通过OTU聚类和物种注释,发现两组间部分菌群的丰度比较,差异有统计学意义(P0.05)。与健康对照组(NC)相比,原发性胆汁性胆管炎组(PBC)解纤维素根瘤菌(Cellulosilyticum)、霍尔德曼氏菌(Holdemanella)、毛螺菌(Lachnospiraceae)、乳酸乳球菌(Lactococcus)和摩根菌(Morganella)降低,亨盖特拉菌(Hungatella)显著升高。此外,采用实时定量PCR技术检测PBC组和NC组肠道中大肠杆菌的含量,发现PBC组中的含量显著高于NC组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 与健康对照组(NC)相比,原发性胆汁性胆管炎组(PBC)在一定水平上肠道菌群发生了改变。进一步分析肠道菌群的变化,有望为研究原发性胆汁性胆管炎的发生发展和寻找新的敏感微生物标志物提供新的思路。     

16S rRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的: 运用16S rRNA 基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法: 提取细菌DNA,采用通用引物PCR扩增16S rRNA 基因片段并测序。将测序结果用Blastn 在线软件在Nucleotide 数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果: 12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。 结论: 16S rRNA 基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

16SrRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的：运用16SrRNA基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法：提取细菌DNA,采用通用引物PcR扩增16SrRNA基因片段并测序。将测序结果用Blastn在线软件在Nucleotide数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果：12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。结论：16SrRNA基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

基于16S rDNA高通量测序分析2型糖尿病腹泻患者肠道菌群的变化

目的 利用16S rDNA高通量测序技术,研究2型糖尿病腹泻患者肠道菌群的变化。方法 收集18例2型糖尿病腹泻患者和23例健康受试者的粪便样本,提取肠道菌群基因组,采用二代高通量基因测序技术,对16S rDNA V3～V4高变区进行扩增测序、生物信息学分析,比较两组人群肠道菌群结构和种类的差异。结果 Alpha多样性分析显示2型糖尿病腹泻患者肠道中菌群的丰度和多样性低于健康对照组,P<0.05。在门水平上,2型糖尿病腹泻患者组拟杆菌门占比低于健康组,P<0.05;而厚壁菌门,疣微菌门高于健康组,P均<0.05。另外,厚壁菌门/拟杆菌门比值,患者组高于健康组,P<0.05。在属水平上,2型糖尿病腹泻患者组中粪杆菌属低于健康对照组,P<0.05。结论 16S rDNA高通量测序技术有助于分析2型糖尿病腹泻患者肠道菌群多样性,为研究肠道菌群与2型糖尿病腹泻的关系提供新的思路和理论依据。     

PCR为基础的反向线点杂交及16S～23S rDNA间区测序分析5种少见类型奴卡菌

目的探讨5种新出现的奴卡菌种16S～23S rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)DNA基因序列的多态性,筛查特异的奴卡菌种逆向线点杂交(reverse line blot,RLB)探针。方法对6例奴卡菌标本进行ITS基因扩增、克隆、测序,设计奴卡菌种特异探针及ITS间区rDNA基因特异的探针,进行以PCR为基础的RLB(PCR/RLB)杂交试验,不同的RLB型进行ITS基因测序分析,以鉴别不同的奴卡菌种及种内分型。结果发现2个Nocardia beijingensis菌株ITS间区有8个基因序列型,4个RLB型;N.thailandica有4个基因序列型及RLB型;N.blacklockiae有5个基因序列型,3个RLB型,其中N-bla RLBⅢ型与所有Nbla-ITS探针杂交没有信号;N.elegans有5个基因序列型,3个RLB型;N.vinacea有5个基因序列型,2个RLB型。结论通过PCR/RLB试验,准确的ITS基因测序认识了新出现的菌种,即N.beijingensis,N.blacklockiae,N.elegans,N.thailandica及N.vinacea。同时建立了可以大量筛查奴卡菌种的PCR/RLB方法,以进行快速临床诊断及流行病学研究。     

基于16S rDNA测序分析功能性便秘婴幼儿的肠道菌群组成

目的：探讨16S rDNA测序分析功能性便秘婴幼儿肠道菌群的结构与组成,为临床治疗提供依据。方法：选取2020 年1月至12 月湖州市妇幼保健院门诊就诊的功能性便秘婴幼儿17 例作为便秘组,正常婴幼儿15例作为对照组,收集粪便,采用16S rDNA扩增子测序的方法检测2组婴幼儿肠道菌群的组成并分析其结果。结果：2组肠道菌群Alpha多样性差异无统计学意义（P ＞0.05）,但Beta多样性差异有统计学意义（P ＜0.01）。在门水平中放线菌门、厚壁菌门、变形菌门是2组儿童肠道微生物群落中最丰富的菌群,其中疣微菌门在便秘组中丰度高于对照组（P ＜0.05）。在属水平中,双歧杆菌为2组优势菌种,乳酸菌属与阿克曼菌属在便秘儿童肠道中的丰度高于对照组（P ＜0.05）。便秘组中双歧杆菌种、疣微菌门、阿克曼菌属、副干酪乳杆菌的丰度差异有统计学意义,而对照组齿双歧杆菌、放线菌目、放线菌科、放线菌属、鼠李糖乳杆菌的丰度差异有统计学意义（均P ＜0.05）。结论：功能性便秘婴幼儿存在肠道菌群结构和多样性的改变,便秘与肠道菌群之间可能存在相关性。     

16s rDNA扩增子测序分析慢性乙型肝炎患者肠道菌群的改变

目的 应用16s rDNA扩增子测序技术分析慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者和健康人肠道菌群的差异,探讨肠道菌群对CHB患者疾病的影响及可能的作用机制.方法 收集2017年1月—2018年12月就诊的CHB患者(60例)、健康对照者(30例)粪便样本,应用16s rDNA扩增子测序技术...     

16SrDNA序列测定在细菌鉴定中的应用

目前临床微生物鉴定主要依靠表型方法,但遇到革兰染色差、生化反应不活跃、代谢反应和生长模式较为独特的菌株,则鉴定变得十分困难.随着核酸技术发展,16SrDNA序列测定被用于细菌分型鉴定,还可用于发现和描述新的细菌种类,尤其是表型鉴定难于确定的细菌.     

细菌16S rDNA基因T碱基特异的PCR产物片段化

目的探讨细菌16S rDNA检测芯片杂交前的样本处理优化方法。方法设计针对细菌16S rDNA基因全长的通用引物,通过PCR时掺入一定比例的dUTP替代dTFP,扩增长度为1：5kb的片段,用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)消化处理掺入到双链上的dUTP后,再经浓氨水特异性断开DNA双链上原dUTP处的磷酸二酯键,然后用聚丙烯酰胺凝受胶电泳(PAGE)和琼脂糖电泳确认片段化的效果。结果本实验选用的基因当dUTP与dTFP的比例在3：7～1：1时,都能够获得比较理想的片段化结果。结论通过控制一定的dUTP掺入比例再经UDG及氨水处理能够得到稳定的片段化结果。     

采用16S rRNA基因分析技术鉴定正畸患者矫治前龈沟液的细菌种类

目的  了解安氏Ⅱ类错■畸形患者矫治前期龈沟液的细菌分布情况,为进一步探讨细菌感染对安氏Ⅱ类错■畸形矫治后牙根吸收的影响奠定基础。方法  从中南大学口腔医学院收集24例安氏Ⅱ类错■畸形的12~18岁患者龈沟液,在厌氧条件下进行细菌培养,PCR扩增细菌16S rRNA基因序列,经测序后通过序列比对鉴定细菌菌株。结果  共鉴定出43株菌,其中链球菌属18种菌株,奈瑟菌属7种菌株,放线菌属6种菌株,孪生球菌属2种菌株,罗氏菌属2种菌株,艾肯菌属等其他8个菌属各1种菌株。结论  安氏Ⅱ类错■畸形患者矫治前期龈沟液中分布多种细菌。

     

鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的检测

目的了解耐氨基糖苷类药物鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的流行情况。方法收集2008年1月—2009年4月临床分离对阿米卡星和庆大霉素耐药的鲍曼不动杆菌70株,PCR（聚合酶链反应）方法扩增5种甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD）,PCR产物进行电泳分析和测序。统计菌株对亚胺培南等12种抗生素的耐药率。结果 armA基因的检出率为68.6%,未检出rmtB、rmtA、rmtC和rmtD基因。所有菌株对除亚胺培南外其它抗生素的耐药率均大于80%。结论 16S rRNA甲基化酶（armA亚型）基因广泛存在于这些耐药菌株中。这些对阿米卡星和庆大霉素耐药的菌株,对其它抗生素的耐药也十分严重。     

几种灵芝rDNA基因间隔序列分析与鉴定

目的  基于基因间隔序列（ITS）序列对灵芝进行分类。方法  培养灵芝、提取DNA、优化聚合酶链反应（PCR）体系、纯化与克隆、测序、构建遗传进化树、进行遗传分析。结果  经过一系列的梯度实验得知优化的PCR体系为25μl反应混合物中含模板DNA 25 ng、Mg2+为2.0 mmol/L、dNTPs 200μmol/L、Taq 1.5 U、引物为20 pmol;最佳反应程序为93℃预变性4 min,93℃变性40 s,59℃退火40 s,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃继续延伸7 min,4℃无限循环。所采用的HZ002、DZ003、NZ004和XC005在遗传进化树上面十分接近,说明其可以划分为同一菌属,同属于灵芝菌属。结论  基于ITS序列对灵芝进行分类,与其他的分子标记技术所取得的分类结果一致,证实依据ITS序列来对真菌菌属进行分类是十分合理的。