心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅴ．外源基因在大鼠心肌中的表达

有效的基因转移技术是基因治疗的关键步骤。为了研究外源基因在动物心肌组织中的表达，我们将ｐＮ２－ＬａｃＺ质粒直接注射到大鼠的左心室壁，经Ｘ－ｇａｌ染色和酶活力测定，结果表明外源基因直接注射入心肌组织后，可在大鼠心肌中高效表达。     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅰ．重组质粒pN2－LacZ在体外的表达

构建了带有标记基因ＬａｃＺ的逆转录病毒质粒ｐＮ２－ＬａｃＺ。用磷酸钙共沉淀的方法，将ｐＮ２－ＬａｃＺ转染培养的大鼠血管平滑肌细胞，Ｇ４１８筛选得到抗性集落。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，ＬａｃＺ基因已整合到细胞染色体上并转录出相应的ｍＲＮＡ。组化染色和酶活力测定结果表明，外源基因ＬａｃＺ可在血管平滑肌细胞中表达出有活性的蛋白质产物。提示，血管平滑肌细胞可作为心血管疾病基因治疗的靶细胞。     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅳ．外源基因的在体表达

将ｐＮ２－ＬａｃＺ和ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ质粒直接注射到Ｗｉｓｔａｒ大鼠股四头肌，可以在肌肉中检测到这两种基因的表达产物。注射ｐＮ２－ＬａｃＺ质粒后７天，β－半乳糖苷酶的表达量最高，可达２．４８×１０－４Ｕ／ｇ组织，并且可持续表达３周以上。组织化学染色表明部分肌细胞内有ＬａｃＺ基因表达。当用脂质体介导时，注射含３０μｇ质粒的脂质体─ＤＮＡ复合物，β－半乳糖苷酶的活性同直接注射８０μｇ质粒时的活性无差别，直接注射ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ质粒后７天，单链尿激酶原含量最高，可达５５０ｎｇ／ｇ组织。基因注射后３个月仍可检测到单链尿激酶原。     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅲ．重组质粒fPGV－MT－LacZ在大鼠血管平滑肌细胞中的表达

为观察外源性基因在心血管细胞内的表达，本工作构建了含有外源性标记基因ＬａｃＺ的逆转录病毒质粒ｆＰＧＶ－ＭＴ－ＬａｃＺ。应用脂质体（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）包裹质粒，转染培养的大鼠主动脉平滑肌细胞，经Ｇ４ｌ８筛选、克隆以及β－半乳糖苷酶的酶活测定，证明外源性基因可以在血管平滑肌细胞中表达。揭示血管平滑肌细胞可作为心血管疾病基因治疗的一种靶细胞。     

基因治疗基因转移方法

基因转移是指用适当手段将外源基因导入体外或体内受体细胞中的分子生物学技术。常用方法可概括为物理、化学和生物三大类，前两类是非病毒的方法，生物方法主要指病毒介导的基因转移，包括RNA病毒、DNA病毒两类，物理化学法携带的遗传物质在细胞内易受DNA酶降解，而且不容易稳定地存在细胞基因组中，但是这些方法不存在野生型病毒污染．比较安全．病毒方法的特点是基因转移效率较高，但是安全性问题需要重视。理想的基因转移方法应符合以下要求，(1)高效的转移率；(2)外源基因定向导入受体细胞，且能转导非分裂相的细胞；(3)能稳定地、定点整合到宿主染色体上．最好是同源重组；(4)较高的安全性．对人体不构成较严正重的危害；(5)容易操作．易推广应用。     

基因转移方法的实验研究

将医用缝线浸于含有ｐＣＨ１１０质粒的ＰＢＳ缓冲液中，制成基因缝线，缝合于ＳＤ大鼠肝脏、肠壁、腹主动脉壁、腹肌、股四头肌等组织中，结果ｌａｃＺ基因在缝线周围组织中得以表达，说明缝线法转移基因的可行性，有效性，通用性。     

基因转移的骨骼肌细胞及其在基因治疗中的应用

基因转移的骨骼肌细胞及其在基因治疗中的应用田竟生郑少鹏近年来发现，若将外源基因包括报告基因及目的基因克隆到哺乳动物表达性质粒载体或病毒载体上，再将质粒ＤＮＡ以裸露方式或用脂质体包裹，直接注射或先体外后体内（ｅｘｖｉｖｏ）法，即经骨骼肌的前体细胞——成...     

阳离子脂质体及其在基因转移和基因治疗中的应用

基因治疗 (Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ)是指将遗传物质 (即ＤＮＡ)转移入人体细胞 ,并整合至染色体中 ,取代突变基因 ,补充缺失基因或关闭异常基因 ,从而达到治疗机体疾病或有益于治疗的目的。应用基因治疗研究最多的是肿瘤。据统计 ,1994年 7月美国重组ＤＮＡ咨询委员会 (ＲＡＣ)批准的人类基因治疗方案共 72个 ,其中 36个与癌症有关 ,与囊性纤维化和艾滋病有关的各 7个[1] 。由于基因转移 (Ｇｅｎｅｔｒａｎｓ ｆｅｒｉｎｇ)技术的发展 ,基因治疗取得了突破性的进展。1　基因转移的方法近年发展起来的体外或体内基因转移技术有十余种 ,可分为…     

脂肪组织的干细胞作为神经系统基因治疗载体的研究

目的观察大鼠脂肪组织源性基质细胞表达外源基因的能力和脑内移植后的分布,以获取基因治疗自体移植的载体细胞。方法腺病毒载体Ad5βgal介导法将LacZ转入培养的大鼠脂肪组织源性基质细胞。Hoechst33258标记细胞,立体定向移植到大鼠的纹状体,脑组织切片,在荧光显微镜下检查存活的细胞。结果脂肪组织源性基质细胞能够在体内和体外稳定表达LacZ基因,细胞移植到脑内可以移行,移植细胞没有过渡增生和肿瘤形成,对宿主脑组织无破坏。结论脂肪组织源性基质细胞可以稳定表达夕J源基因,与脑组织有很好的相容性,是中枢神经系统基因治疗的良好载体。     

基因治疗中反转录病毒的细胞导向性基因转移

成功的基因治疗要求将治疗基因高效、细胞特异性地传递到靶组织并稳定表达。因此需要发展细胞导向性转移基因的基因治疗载体。反转录病毒（Retrovirus，RV）是目前最常用、也是成功率最高的基因治疗载体，但普遍缺乏细胞导向性。RV载体靶向转移基因可以通过两种水平来实现：1．基因传递水平，利用天然或修饰RV包膜糖蛋白与细胞特异性表面蛋白的相互作用使基因定向传递到靶组织；2．基因传递水平，利用组织特异性启动子控制基因在特定组织表达。本文主要讨论RV载体在基因传递水平靶向转移基因方面的研究进展。     

自制阳离子脂质体介导的体内外基因转移研究

目的：研究阳离子脂质体介导体内外基因转移的效率。方法：采用逆相蒸发法制备出包裹TNFα DNA的脂质体,将其与体外培养的靶细胞共育,或将其直接注射至小鼠腹腔内,检测TNFα的分泌水平。结果：TNFα基因转染NIH3T3细胞和腹腔细胞,10d后均可检测到TNFα的分泌。结论：研制的脂质体不但能将目的基因转移至体外培养的靶细胞中,还可通过腹腔内注射直接将TNFα基因转移至腹腔细胞,稳定表达TNFα。     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅱ．Pro－UK和t－pA基因的体外表达

构建了带有人的全长Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因ｃＤＮＡ的逆转录病毒质粒ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ或ｐＮ２－ＣＭＶ－ｔＰＡ。重组质粒转染包装细胞ＰＡ３ｌ７后获得含假病毒的培养上清。用假病毒上清感染培养的血管平滑肌细胞（ＶｓＭＣ），经Ｇ４ｌ８筛选得到抗性集落。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因已整合到宿主细胞染色体。在转染的ＶＳＭＣ中，Ｐｒｏ－ＵＫ和ｔ－ｐＡ的含量分别为２６５ｎｇ／１０７细胞／２４小时和５．６ｎｇ／１０７细胞／２４小时。溶圈法测定结果证明，Ｐｒｏ－ＵＫ基因导入细胞后可以表达出有生物活性的尿激酶原。     

经周围静脉途径转移的外源基因在大鼠体内的表达

目的 :探讨经周围静脉注射的外源基因在大鼠体内不同组织的表达。方法 :将重组LacZ腺病毒经尾静脉注射导入Wistar大鼠体内 ,以X gal染色法明确腺病毒载体介导的标识基因 (LacZ)在大鼠体内的表达部位和时间。结果 :β gal表达具有剂量依赖性 ,而且存在器官、组织和细胞 3种水平的表达差异。剂量较小时 ,肺、肾、肝、脾优先表达 ,而心肌在 1× 10 1 1 pfu·kg- 1 剂量组才有少量表达 ,大血管和脑组织始终未见表达。注射后 1～ 2周 ,大鼠的肾、肺、肝、脾、肾上腺高表达 β 半乳糖苷酶 ,3～ 4周表达量减少 ,5周基本消失。结论 :腺病毒介导的外源基因经静脉途径转移 ,可能是肾、肺、肝的部分疾病基因治疗的有效基因转移途径     

胶质细胞源性神经营养因子基因转移与基因治疗——帕金森病与运动神经元病的基因治疗进展

神经营养因子（NTF）对健康及受损神经元的存活及再生有重要意义,神经系统某些NTF的代谢改变或缺乏构成了变性疾病的基础。自1952年神经生长因子（NGF）被发现后随着神经细胞培养,DNA重组等技术的建立相继发现了众多NTF。其中以脑源性神经营养因子（BDNF）及胶质源性神经营养因子（GDNF）与帕金森病（PD）及运动神经元（MN）病的关系最为密切。BDNF与NGF同属一个家族,由119个氨基酸组成,许多动物及人的BDNF基因已被克隆［1］。用BDNF处理过的中脑多巴胺（DA）神经可以减轻1-甲基-4-苯基吡啶（DA）（MPP+）及6-OHDA的敏感性。减轻受损多巴胺能神经元的数目［2］。     

胶质细胞源性神经营养因子基因转移与基因治疗：帕金森病与运动神经元病的基

神经营养因子 (ＮＴＦ)对健康及受损神经元的存活及再生有重要意义 ,神经系统某些ＮＴＦ的代谢改变或缺乏构成了变性疾病的基础。自 195 2年神经生长因子 (ＮＧＦ)被发现后随着神经细胞培养 ,ＤＮＡ重组等技术的建立相继发现了众多ＮＴＦ。其中以脑源性神经营养因子 (ＢＤＮＦ)及胶质源性神经营养因子 (ＧＤＮＦ)与帕金森病 (ＰＤ)及运动神经元 (ＭＮ)病的关系最为密切。ＢＤＮＦ与ＮＧＦ同属一个家族 ,由 119个氨基酸组成 ,许多动物及人的ＢＤＮＦ基因已被克隆[1] 。用ＢＤＮＦ处理过的中脑多巴胺 (ＤＡ)神经可以减轻 1 甲基 4 苯基吡啶(…     

经鼠中心静脉途径注射重组腺病毒的基因转染效率及靶向性

目的：探讨经中心静脉途径注射外源基因在大鼠体内不同组织的表达及靶向性。 方法:将重组腺病毒AdLacZ经中心静脉途径导入SD大鼠体内,以X-gal染色法检测腺病毒介导的标识基因（LacZ）在大鼠体内的表达部位和时间。结果:注射AdLacZ（1×109pfu/mL）后1d,大鼠肺、肝、肾、脾组织即有少量表达。3d后大鼠肺、肝、肾、脾组织LacZ基因表达明显,7d时达高峰,14d开始下降,28d基本消失。肺组织,第3,7,14,21d,LacZ基因明显高于其他组织（P<0.05）,脑组织始终未见表达。结论:腺病毒携带的外源基因,经中心静脉途径给药,可能是肺、肝、肾等疾病基因治疗的有效途径,尤其适用于肺部疾病的基因治疗。     

基因治疗病毒载体的研究及应用

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用,因此它可用来治疗一些后天性和遗传性疾病,其成功与否的关键是载体。目前应用的载体主要有包括病毒和非病毒载体,但在基因治疗中应用最为广泛的载体是病毒载体。本文就近年来病毒载体系统在基因治疗中的应用及其改进等方面的研究进行综述。