风疹病毒E1基因的克隆及原核表达

目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a(+),并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达。结果成功扩增出399bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。     

2006 - 2015年江西省风疹病毒野毒株基因特性研究

目的 研究江西省近10年风疹病毒野毒株的基因特性,为江西省的风疹防控提供技术支撑。方法 采集江西省2006 - 2015年风疹疑似病例咽拭子标本,用Vero/SLAM细胞对标本进行病毒分离培养,再对细胞分离物进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）对细胞分离物进行风疹病毒核酸鉴定,采用RT-PCR对风疹病毒核酸检测阳性标本扩增病毒糖蛋白E1基因,对其核苷酸序列进行测定,运用生物学软件对测定序列进行处理分析。结果 江西省2006 - 2015年风疹病毒野毒株分属于2个基因型:1E基因型（14株）和2B基因型（20株）,1E基因型为江西省2005 - 2013年风疹病毒流行唯一基因型,并在2015年被2B基因型替代。1E和2B基因型各毒株之间E1基因核苷酸同源性分别为97.6%～99.9%和99.2%～99.9%,与疫苗株BRDII株核苷酸同源性分别为89.4%～89.9%和92.6%-93.0%,氨基酸同源性为98.8%～99.6%;氨基酸序列相对保守,未发现重要抗原位点的改变。结论 1E基因型和2B基因型为江西省2006 - 2015年风疹病毒流行的基因型,2B基因型为2015年首次在江西省发现,并为当年的绝对优势基因型。     

2019年河南省1E基因型风疹病毒结构蛋白基因特征分析

目的 分析2019年河南省1E基因型风疹病毒分离株结构蛋白基因特征,探讨抗原位点变异情况,为河南省风疹防控提供支持.方法 对河南省2019年风疹病毒分离株采用RT-PCR方法扩增结构蛋白基因片段并测序,截取C、E2、E1蛋白序列,使用Mega7.0.26软件进行进化树分析、同源性分析和氨基酸特征分析.结果 对5株1E基...     

江西省2005～2006年甲1亚型流感病毒株与疫苗株的HA1区差异分析

[目的]分析江西省2005～2006年分离的甲1亚型流感病毒株与疫苗推荐株HA1区的差异,以了解江西省流感病毒变异情况及WHO推荐疫苗株对人体的保护作用.[方法]采集监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分商,对分离到的甲1亚型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒基因后进行核苷酸序列测定,用DNAStar5.0、BioEdit (Version5.0)、Mage生物软件对测序结果进行分析处理,并与WHO推荐疫苗株进行比对.[结果]20株甲1亚型流感病毒HA1区域核苷酸序列长度均为960bp,未发现核苷酸的丢失和插入.平均点突变率为2.94%.2005年甲1亚型流感病毒分离株与2005年WHO北半球流感甲1亚型疫苗推荐株A/New caledonia/20/99(H1N1)HA1区相比较,不同毒株氨基酸的同源性是96.9%～98.1%,替换数在6～10个之间,涉及2～3个抗原决定簇,抗原决定簇区的氨基酸变异数平均为2.33.2006年甲1亚型流感病毒分离株与疫苗推荐株HA1区相比较,不同毒株氨基酸的同源性是95.3%～97.2%,、替换数在9～15个之间,涉及4个抗原决定簇,抗原决定簇区的氨基酸变异数平均为6.0个.2006年我省甲1亚型流摩病毒分离株与WHO疫苗推荐株之间在HA1区域的氨基酸差异以及抗原决定簇上氨基酸的差异,均显著大于2005年我省甲1亚型流感病毒分离株与WHO疫苗推荐株之间差异(P<0.0005).[结论]2005年根据WHO疫苗推荐株生产的疫苗对该年度我省的甲1亚型流感总体上有较好的预防效果,而2006年根据WHO疫苗推荐株生产的疫苗对我省该年度的甲1亚型流感预防效果不够理想.     

2008-2012年江西省甲型H3N2流感病毒HA1基因特征及与疫苗株差异分析

目的掌握2008-2012年江西省甲型H3N2亚型流感病毒HA1基因特征,在分子水平了解WHO甲3型疫苗推荐株对江西省甲3亚型流感病毒预防效果。方法采集监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离,对分离到的甲3型流感病毒毒株进行核酸的提取,扩增病毒HA1基因后进行核苷酸序列测定并对HA1基因特性进行分析。结果 2008-2012年共分离到甲3型流感病毒553株,对其中23株毒株进行HA1基因序列测定,各年份的毒株HA1序列分别与当年WHO对北半球推荐的疫苗株进行比对,结果为2008-2012年氨基酸同源性分别为98.4%~99.1%、96.6%~98.4%、97.2%~98.4%、96.2%~97.2%和96.6%~98.1%;抗原决定簇区氨基酸平均变异数分别为1.3个、3.2个、1.4个、3个和2.5个;其中2009年有3株在2个抗原决定簇区发生了4~5个的氨基酸替换。结论2008-2012年甲型H3N2亚型流感病毒分离株HA1基因在不断发生变异,疫苗对我省2008年度、2010年度和2012年度的甲型H3N2亚型流感保护效果良好,在2011年度保护效果存在滞后现象,对2009年甲型H3N2亚型流感保护效果较差。     

安徽省2018-2022年风疹病毒流行株基因特征

目的 分析安徽省风疹病毒(Rubella virus, RV)流行株基因特征。方法 对安徽省2018-2022年RV阳性咽拭子标本开展RV分离、靶基因序列扩增和序列测定分析,构建与1E和2B基因亚型参考株之间的基因亲缘性关系树,鉴定RV基因亚型,分析核苷酸和氨基酸序列同源性。结果 2018-2021年共分离获得83株RV毒株,其中1E-L2基因亚型81株,来自2018-2020年13个地市;2B-L2c基因亚型2株,来自2019年和2021年2个地市;2022年未获得RV毒株。与其他省份同期的相应RV代表株相比,1E-L2基因亚型流行株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.32%-100%和98.78%-100%,2B-L2c基因亚型流行株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.59%-99.86%和100%。结论 安徽省2018-2021年RV流行株为输入性的1E-L2和2B-L2c基因亚型,其中1E-L2基因亚型RV为2018-2020年优势流行株。2022年流行RV基因型别不详,需加强风疹病原学监测。     

江西省赣州市17株B型流感病毒HA和NA基因特性分析

目的了解2008-2015年江西省赣州市B型流感病毒株HA与NA基因变异特征。分析WHO推荐的北半球B型流感病毒疫苗株预防效果,为江西省赣州市B型流感监测和防控提供理论依据。方法依据全国流感监测技术指南对获得的18份典型流感样病例鼻咽拭子标本的B型流感病毒进行分离和鉴定。对分离合格的17份样品进行核酸提取,通过逆转录PCR及Sanger测序获取流感病毒HA与NA基因序列信息。采用生物信息学方法,获得HA与NA基因的氨基酸序列,并与WHO推荐的北半球B型流感病毒疫苗株进行比对,绘制毒株相关性热图和进化树。结果与WHO推荐的B型流感病毒疫苗株比较,江西省赣州市17份B型流感病毒在4个HA及8个NA抗原决定簇区域存在多个变异(HK,Ni等),其中抗原决定簇区域131,137,141,144,163,164,165在江西省赣州市收集的病毒株中发生较大变化(3～7个变异)。结论由此推测,WHO推荐疫苗株对江西省赣州市发现的B型流感病毒株的预防效果可能不太理想,需进一步采集本市B型流感病毒样本并对其变异情况进行监测,寻找针对本市新发B型流感病毒的疫苗株。     

2009年-2010年广东省风疹病毒分离株基因特征分析

目的:对2009年-2010年广东省两起疑似麻疹暴发疫情进行病原学鉴定,并对分离到的风疹病毒进行基因型别鉴定和分子流行病学特征的分析。方法:采集两起疑似麻疹暴发病例的血清学标本和病原学标本,使用ELISA法检测血清麻疹和风疹IgM抗体;同时将临床标本接种至Vero/Slam细胞进行病毒分离,通过逆转录-聚合酶链反应和序列测定与分析鉴定其基因型别。结果:2009年-2010年在广东省发生的两起疑似麻疹暴发证实是由风疹病毒引起,从暴发疫情中分离到的8株风疹病毒均为1E基因型,并且2009年和2010分离株之间的同源性为99.5%。结论:2009年-2010年广东省流行1E基因型风疹病毒,在广东省持续循环。1E基因型风疹病毒在我国广泛分布和流行,说明广东省的风疹病毒不是独立进化,而是与我国其他省份风疹病毒在共同进化。     

沪191麻疹病毒疫苗株的核蛋白基因分析

目的研究沪191(S191)麻疹病毒疫苗株的核蛋白(N)基因.方法将S191株主代病毒(HK33HAM39CEC20)在实验室连续传递11代,从原代鸡胚细胞(CEC)20代连续传至CEC31代.除观察每代病毒培养特性外,还选其中的21、22、25、26、29、30、31代病毒及S191强毒株(HK33HAM45)、Edmonston(Ed)强毒株(HK28HAM40MRC-55),以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对这些病毒标本的N基因编码区的全长以及羧基末端的450个核苷酸区域进行片段扩增.结果通过N基因的序列分析发现,S191疫苗株与强毒株在N基因上有10～13个核苷酸差异,差异率为0.63%～0.82%.S191株主代病毒在CEC上连续传递11代的过程中,有2个代次病毒的个别核苷酸出现有义突变,分别导致第22代病毒的278位氨基酸Glu→Lys,第26代病毒的341位氨基酸Val→Lys,但这一变化不存在重复性,随着继续传代又恢复到21代的序列水平.结论S191麻疹病毒疫苗株在CEC长期传代过程中,各代次之间的N基因高变区序列一致,包括N基因中与免疫功能有关的3个B细胞表位区域的序列在传代中也无改变,故不可能影响到疫苗的免疫效果.     

福建省脊髓灰质炎Ⅱ型疫苗重组株病毒特性与分析

对福建省脊髓灰质炎 (脊灰 )Ⅱ型病毒基因的VP1区和 3D区进行PCR -RFLP分析 ,结果有 5株为脊灰Ⅱ型疫苗重组株病毒 ,均表现为VP1区为Ⅱ型疫苗株 ,3D区为Ⅲ型疫苗株 ,有 4株在VP1区出现不同于标准脊灰Ⅱ型疫苗株病毒的变异。流行病学资料揭示 ,分离出脊灰Ⅱ型重组株病毒的急性弛缓性麻痹 (AFP)病例大多具有脊灰的症状 ,且发病表现出明显的季节性 ;而从“零”剂次免疫儿童或近 6个月从未服过脊灰疫苗儿童的粪便标本中 ,只分离到此病毒。这表明福建省自然环境中存在脊灰Ⅱ型疫苗重组株病毒循环 ,此病毒可能是这类AFP病例的致病因子。在我国保持无脊灰状态下如何控制脊灰Ⅱ型重组株病毒的致病 ,适时采取相应对策对今后的工作提出了新的挑战。     

风疹病毒E1蛋白与DsbA蛋白原核融合表达及应用

目的 利用DsbA蛋白分子伴侣性质,原核系统内可溶性表达风疹病毒E1蛋白并进行纯化,用于检测风疹病毒特异性抗体IgM. 方法 将PCR扩增的风疹病毒E1核酸序列克隆至融合表达载体pET-DsbA中,依次进行表达和亲和纯化,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定DsbA-E1融合蛋白的抗原性及实用性. 结果 表达纯化的E1蛋白经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗风疹病毒IgM阳性血清和60份健康人血清,其中阳性血清检出例数为45例,检出率为75％;健康人血清检出1例,检出率为1.7％,特异度为98％;用酶标记E1蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率98.3％ (59/60),阴性检出率100％,初步表明E1蛋白抗原表位有较好的抗原特异性. 结论 融合蛋白DsbA-E1在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在,该重组蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测风疹病毒抗体.     

风疹病毒山东地方株的分离与鉴定

目的 了解山东省风疹病毒流行情况，进行风疹野病毒山东地方株的分离、鉴定。方法 2001～2002年，从我省的济宁、淄博、济南、德州市风疹爆发流行中，采集53份具有风疹典型症状患者的咽拭子，经Vero，RK-13，BHK-21，MK2细胞分离培养，选出有明显的细胞病变株。结果 在Vero细胞上对HSV-1病毒攻击呈干扰现象；风疹免疫荧光阳性者；共分离出9株风疹病毒山东地方野毒株(SDRV)，代码为SDRV1、2、3、4、5、6、7、8、9。结论 细胞用于风疹病毒的分离培养，免疫荧光实验可作为风疹病毒鉴定、诊断的重要方法。     

江西省2004～2007年脊髓灰质炎疫苗相关株AFP病例分析

[目的]了解江西省AFP病例监测脊灰疫苗相关株的状况,分析江西省近年人群中脊灰病毒变化趋势.[方法]对江西省2004～2007年分离出脊灰疫苗相关株的AFP病例进行流行病学和病原学分析.[结果] (1)Ⅲ型分离率和构成比从2006年开始显著上升,而且,Ⅲ型发生变异最多,变异核甘酸数也最多.(2)疫苗相关株的58例AFP病例中未免疫或未全程免疫的儿童占51.7%.(3)脊灰病毒分离率与采集标本时的服苗时间有关.[结论]对脊灰病毒在人群中的变化趋势进行分析,可以预测VDPVs的发生和流行,可为提前采取防控措施提供依据.消灭脊灰进程中,尽早实现使用脊灰灭活疫苗、直至停止使用脊灰疫苗很有必要.     

2008-2012年江西省乙型流感病毒HA1基因特性分析

摘要:目的　了解2008-2012年江西省分离的B型流感病毒株HA1基因变异特征。方法　采集监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离,对分离到的B型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒基因后进行核苷酸序列测定,用DNAStar5.0、Mage对测序结果进行分析处理,推导出氨基酸序列,进行基因特性分析。结果　10株Yamagata系B型毒株HA1基因之间的同源性为97.5%～100.0%,14株Victoria系B型毒株HA1基因之间的同源性为97.0%～99.9%。我省2008年分离的Yamagata系流感病毒与疫苗株间有5～7个变异,2009-2011年分离的Victoria系流感病毒与疫苗株间有5～7个变异,2012年分离的Yamagata系流感病毒与疫苗株间有1～4个变异,其中最多只有1个变异位于抗原决定簇。结论　2008-2012年江西省B型流感HA1基因未发生明显变异,WHO推荐的B型流感疫苗株对我省流行的B型流感具有保护作用。     

2004～2006年江西省乙型流感病毒HA1基因特性分析

目的：了解江西省2004～2006年分离的B型流感病毒株HA1基因变异特征。方法：采集监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离,对分离到的B型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒基因后进行核苷酸序列测定,用DNAStar5.0、BioEdit（Version5.0）、Mage生物软件对测序结果进行分析处理,推导出氨基酸序列,进行基因特性分析。结果：2004年和2005年分离到的B型流感病毒均为B型的Yamagata系;2006年以Victoria系为优势株,但有Yamagata系的活动。9株Yamagata系B型流感病毒HA1区域核苷酸序列长度均为1014 bp,未发现核苷酸的丢失和插入,与疫苗推荐株B/Shanghai/361/2002 HA1区相比较,不同毒株氨基酸同源性为96.4%～97.3%,替换数在10～11个,所有毒株均在9个相同的氨基酸位点发生了相同的替换,在196位增加了一个糖基化位点。12株Victoria系B型流感病毒HA1区域核苷酸序列长度均为1017 bp,未发现核苷酸的丢失和插入,与疫苗推荐株B/Malaysia/2506/2004的HA1区相比较,不同毒株氨基酸同源性为98.4%～99.5%,替换数在2～4个,所有毒株均在2个相同的氨基酸位点发生了相同的替换,在197位增加了一个糖基化位点。结论：江西省2004～2006年Yamagata系B型流感病毒HA1基因特性已发生改变,从基因水平说明Yamagata系B型流感病毒抗原性发生了改变。2006年Victoria系B型流感病毒HA1基因特性有所改变,疫苗仍有预防效果。     

江西省2011年麻疹病毒野毒株与疫苗株的快速鉴别

目的 建立并运用逆转录多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性分析方法(RT-PCR-RFLP方法)快速鉴别2011年江西省麻疹野毒株与疫苗株.方法 用Vero/SLAM细胞对1例疑似麻疹病例咽拭子标本进行麻疹病毒分离,通过RT-PCR-RFLP方法对分离得到的毒株进行麻疹病毒鉴定,RFLP方法主要是运用AflⅡ酶判断是否含有AflⅡ酶切位点(疫苗株有,野毒株没有)鉴别野毒株和疫苗株,同时对该毒株进行N基因全序列测定,以验证RT-PCR-RFLP方法.结果 RT-PCR-RFLP方法鉴定的结果为:该毒株(MVi/Jiangxi.CHN/23.11)呈单一条带,不能被AflⅡ酶切开,N基因序列测定结果为:麻疹病毒野毒株H1基因型.结论 成功建立江西省麻疹病毒野毒株与疫苗株的快速鉴别方法,并鉴别2011年江西省1例疑似麻疹病例由野毒株感染引起.     

酵母表达的风疹病毒E1在ELISA检测中应用

目的将毕赤酵母表达系统中表达的E1糖蛋白作为包被抗原,建立一种优于病毒作为包被抗原的风疹病毒(rubellavirus,RV)抗体ELISA检测方法。方法将重组包膜糖蛋白(E1)抗原和风疹病毒分别作为包被抗原,用间接ELISA法检测90份临床血清标本,同时用晶美(JINGMEI)进口分装试剂盒和德国RECI公司试剂盒进行检测;将RECI试剂盒作为金标准,计算另外三者检测结果的特异性、灵敏性和符合率;比较他们之间的差异有无统计学意义,特别是重组抗原与病毒抗原作为包被抗原检出RV抗体阳性率的差异有无统计学意义。结果重组蛋白重复性实验结果经统计学处理,P>0·05,差异无统计学意义;RECI试剂盒与重组抗原、病毒抗原的检测结果差异有统计学意义(P<0·05);重组抗原与病毒抗原的检测结果差异有统计学意义(P<0·05),作为包被抗原,重组抗原优于病毒抗原。结论用毕赤酵母表达的RVE1重组蛋白作为包被抗原进行ELISA检测优于病毒作为包被抗原,具有广阔的应用前景。     

中国黄热疫苗减毒株和世界卫生组织黄热疫苗标准株基因全序列分析

目的研究中国黄热疫苗生产用减毒株与世界卫生组织（WHO）黄热疫苗标准株的基因序列,了解其核苷酸序列变异程度,和与其相关的氨基酸是否发生突变。方法根据基因库（GenBank）中收录的黄热病毒（Yellow Fever Virus,YFV）17D序列设计引物,提取该两株YFV的核酸,逆转录后进行聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增病毒各部分基因片段,PCR产物纯化后直接测序,5＇和3＇端TA克隆后进行测序,然后进行遗传进化分析。经核苷酸序列测定进行序列比对分析。结果经序列测定后,进行两株YFV的序列比对,并与GenBank中收录的其它相关YFV17D疫苗株和野毒株进行序列比对,发现中国黄热疫苗生产株与WHO黄热疫苗标准株间的核苷酸序列并未发生较大变异,核苷酸和氨基酸的同源性分别约为99%和99%。其重要病毒抗原E蛋白也未发生较大突变,但发现E区与毒力密切相关的173位氨基酸发生回复突变,进一步通过系统发生分析说明两者亲缘关系十分接近。结论传代过程中,中国黄热疫苗株和WHO黄热疫苗标准株在基因水平上除个别外未发生较大改变,其基因组具有一定的稳定性。     

广西分离乙脑病毒与减毒活疫苗株(SA14-14-2)E基因差异分析

目的 分析广西近几年来分离的流行性乙型脑炎病毒(乙脑)与减毒活疫苗株(SA14-14-2 株)之间在E 基因区段核苷酸及氨基酸差异.方法 广西6 株乙脑病毒株E 基因序列由本实验室测定获得,减毒活疫苗株和131V 株序列从GenBank 中下载获得,应用Clustal X(1.8)、DNASTAR 等生物软件进行分析.结果 广西分离株与SA14-14-2 株之间的核苷酸同源性在87.4%～88.1%之间,氨基酸同源性在96.8%～97.2%之间.SA14-14-2 株与广西分离株之间共存在19 个位点的差异,其中E107、E129、E138、E176、E177、E222、E244、E264、E279、E315、E327、E366、E439、E447 处所有广西分离株与SA14-14-2 株存在共同差异.结论 广西分离的乙脑病毒与减毒活疫苗株在E 基因的部分氨基酸位点存在差异,但均不处在影响病毒生物学活性的关键位点.使用减毒活疫苗株SA14-14-2 株能保护新分离株引起的感染.     

脊髓灰质炎疫苗株病毒检测分析

急性迟缓性麻痹病例(AFP)是指任何15岁以下儿童出现的急性软瘫.我们按照世界卫生组织(WHO)推荐的监测方法在全省开展AFP监测,以期进行无脊灰后的证实.