一起 O139群霍乱疫情的实验室检测方法探讨

目的寻求适合 O139群霍乱疫情的病原学检测方法,以便为 O139群霍乱疫情的防控提供及时可靠的科学依据。方法用实时荧光定量PCR仪进行 O139群霍乱弧菌的核酸检测、常规分离培养、 O139群霍乱弧菌快速检测（胶体金法）。结果O。群霍乱弧菌的核酸检测阳性结果9份,且从这9份标本中分离到阳性菌株9株,有7份试样第一次增菌液胶体金法呈阳性反应,2份试样经过第二次增菌后胶体金法才呈阳性反应。结论实时荧光定量PCR法和胶体金法作为辅助检测 O139群霍乱弧菌的方法,可以较快得到初步结果,将两种方法与传统的分离培养鉴定相结合,可以保证结果的及时性和准确性。     

实时荧光PCR法、胶体金法和培养法检测甲鱼中霍乱弧菌

目的优化水产品甲鱼中霍乱弧菌的检测程序,提高甲鱼中霍乱弧菌检出率。方法用实时荧光PCR、常规细菌培养、胶体金法同时对甲鱼中霍乱弧菌进行检测,并用实时荧光PCR法检测标本中霍乱弧菌ctx基因。结果共检测185份甲鱼样品,其中实时荧光PCR法检出28份霍乱弧菌核酸阳性,阳性率为15.14%;6份ctx基因核酸阳性,阳性率21.43%(6/28)。常规细菌培养法分离出2株菌株,一株为O139群霍乱弧菌,一株为小川型霍乱弧菌,用实时荧光PCR检测这两株纯培养菌株或原始标本,霍乱弧菌ctx基因均为阴性;胶体金法未检出阳性标本。结论对于水产品标本,可先用实时荧光PCR法筛检霍乱弧菌,阳性标本再进行传统细菌分离培养,以提高霍乱弧菌菌株的检出率;同时阳性标本进行霍乱弧菌ctx基因核酸检测,如也为阳性,需提高警惕,加强流行病学上的预防控制措施,及时防范霍乱疫情的发生。     

水产品中霍乱弧菌的监测方法研究

目的:研究水产品中霍乱弧菌的监测方法,及时发现被霍乱弧菌污染的水产品,采取有效防控措施,防范霍乱疫情的发生。方法:用实时荧光PCR法、胶体金法、分离培养法三种方法分别对180份水产品进行霍乱弧菌检测,阳性样品再进行霍乱肠毒素检测。结果:三种方法检出了44份核酸阳性标本,18份霍乱肠毒素阳性标本,分离出8株霍乱弧菌。结论:在进行水产品霍乱监测时,可以先用实时荧光PCR进行初筛,筛出核酸阳性标本,进行霍乱肠毒素检测,及时发现被霍乱产毒株污染的水产品,再对筛出的核酸阳性标本结合胶体金法进行分离培养和分型鉴定,进一步完成霍乱疫情的确证和分析。     

荧光PCR和脉冲场电泳技术在一起霍乱弧菌疫情诊断中的应用

目的探讨荧光PCR和脉冲场电泳(PFGE)在霍乱弧菌疫情调查中的应用,为霍乱防治提供依据。方法采集疫情相关标本,进行分离培养鉴定和荧光PCR检测,霍乱弧菌分离菌株基因组进Not I酶切,通过PFGE获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果血清分型分离菌株为霍乱弧菌0139群,标本荧光PCR检测结果毒力基因呈阳性,该起疫情分离的8株霍乱弧菌毒株PFGE图谱一致。结论荧光PCR可快速准确鉴定病原体,PFGE具有较强的菌株同源性分析能力,两种方式的联合应用能在突发公共卫生事件的快速诊断及疫情处置中发挥重要作用。     

2010年湖南省霍乱弧菌病原学特征及溯源分析

目的分析2010年湖南省霍乱弧菌分离株的病原学特征,比较霍乱疫情分离株与常规监测分离株之间的克隆相关性,追溯传染源。方法对疫情与监测分离到的42株霍乱弧菌进行常规生物分型和PCR检测毒力基因,对23株代表株进行药敏试验,对18株代表株通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析,探讨菌株间的相关性。结果 2010年从湖南省霍乱疫情中分离10株霍乱弧菌均为O139群,ctxA阳性率100%。常规监测分离霍乱弧菌32株,其中O1群15株,全部为ctxA阴性株;O139群17株,ctxA阳性率94.11%。23株霍乱弧菌耐药结果显示强力霉素、复方新诺明的耐药率分别为47.83%、56.52%,发现1株对诺氟沙星、环丙沙星耐药。PFGE方法显示有5种脉冲场凝胶电泳图谱,相似率在82%~100%之间,甲鱼中分离的O139群霍乱弧菌与霍乱疫情分离菌株之间高度同源。结论湖南省霍乱弧菌存在紧密相关的流行克隆群;被O139群霍乱弧菌污染的甲鱼很可能是湖南省霍乱疫情发生的主要传染来源,海、水产品的监测是霍乱防控的重点;要密切关注对诺氟沙星、环丙沙星的耐药变化。     

一起霍乱疫情分离株的耐药性和分子流行病学分析

目的对2017年北京市房山区一起霍乱疫情的O1群霍乱弧菌的分子流行病学特征和耐药性进行分析。方法采集患者和有关人员及外环境(包括食物)样本109件,用实时荧光PCR检测碱性蛋白胨水增菌液中O1/O139群霍乱弧菌特异性基因;同时按常规法分离培养鉴定;对鉴定的阳性菌株用实时荧光PCR检测霍乱弧菌CTX基因,用微量肉汤稀释法进行20种药物敏感试验,用Not I和SfiⅠ限制性内切酶进行脉冲场凝胶电泳实验和聚类分析。结果 109件样本增菌液O1群霍乱弧菌特异性基因阳性率19. 27%(21/109,患者、密切接触者中家属和就餐地厨师肛拭子各1件阳性,就餐地后厨外环境样本18件阳性);常规培养鉴定O1群小川型霍乱弧菌阳性率5. 50%(6/109,患者和就餐地厨师肛拭子各检出1株,就餐地后厨外环境涂抹检出4株); 6株O1群小川型霍乱弧菌,霍乱CTX基因均阴性,对20种抗生素中12种100%敏感,对头孢唑林100%耐药,PFGE分子分型条带具有一致性。结论该起霍乱疫情的病原为O1群小川型非产毒株; PFGE分子分型溯源表明疫情与厨师有关;应关注霍乱疫情菌株的耐药监测。     

脉冲场凝胶电泳分型方法追溯霍乱传染源

目的　了解四川省 2 0 0 4年霍乱疫情分离菌株与常规监测的外环境和水产品中霍乱弧菌分离株之间的遗传相关性 ,追溯传染源 ,为预测疫情和制定防治措施提供依据。方法　O139群霍乱弧菌编码脂多糖 (LPS)特异性基因引物聚合酶链反应 (PCR)复核菌株 ,霍乱毒素 (CT)基因引物PCR检测霍乱毒力基因 ,脉冲场凝胶电泳 (PFGE)进行菌株的分子分型。结果　 2 5株受试菌株LPS基因 2对引物PCR结果均为阳性。所有 6株河水中分离的菌株均为CT基因阴性 ,其余均具有CT基因。 2 4株菌PFGE可分为 13个型。结论　LPS基因PCR检测结果从分子水平证实受试菌株均为O139群霍乱弧菌。河水中分离的 6株菌是非产毒株 ,其余菌株均具有致病性。环境水分离的O139群非产毒株之间以及产毒株与非产毒株之间遗传相关性较远。产毒株之间具有较高的同源性。四川省从甲鱼分离的O139群霍乱弧菌与同期流行的O139群霍乱弧菌分型的带型一致 ,在国内首次以分子流行病学分析提示甲鱼可能是四川省近年霍乱疫情主要传染来源之一。     

湖南省2005年-2010年霍乱疫情分离株的毒力基因PCR及PFGE分型分析

目的:了解2005年-2010年湖南省霍乱疫情分离到的O139群霍乱弧菌菌株的病原学特征,研究疫情分离株之间的克隆相关性。方法:采用K-B法进行药敏试验;聚合酶链反应(PCR)检测ctxAB毒力基因;脉冲场凝胶电泳对疫情分离代表株进行PFGE分型分析。结果:33株霍乱弧菌对强力霉素、复方新诺明的耐药率较高,分别为39.39%和75.76%,对环丙沙星、诺氟沙星以及丁胺卡那100%敏感;毒力基因的PCR结果显示为所有疫情分离的O139霍乱弧菌均为产毒株,即霍乱肠毒素基因ctxAB阳性;24株分离自2005年和2010年的7起疫情里的O139霍乱弧菌进行PFGE分型及聚类分析后,共分为3个PFGE带型,所有菌株的带型相似率在83%～100%之间。结论:湖南省2005年-2010年霍乱疫情以O139群为主,引起疫情的全部为产毒株,不同年份不同地区之间霍乱疫情的分离菌株之间存在着紧密相关的流行克隆群,对分离菌株进行耐药性监测和进一步的分子分型分析,有助于霍乱的主动监测和传染来源的追踪。     

一起霍乱疫情的病原学诊断与分析

目的对一起腹泻疫情病例标本进行病原学鉴定,分析其基因型。方法对采集的标本进行病原菌分离培养,对培养出的霍乱弧菌进行血清分型,应用PCR检测毒力基因Ctx,运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对其进行基因分型,与2013年湖南省分离到的菌株进行序列比对及溯源分析。结果在病例的水样便标本中检出1株Ctx肠毒素阳性的O139群霍乱弧菌,通过Pulse Net China湖南区域中心PFGE实验分析获得了PFGE-Not I指纹图谱,与2013年衡阳市霍乱常规监测中甲鱼涂抹样分离的菌株指纹图谱高度相似。结论该起疫情为O139群霍乱弧菌所致,O139群霍乱弧菌污染的甲鱼很可能是此次疫情的传染来源。     

珠江河口水体O1群和O139群霍乱弧菌监测

目的 分析珠江河口水体O1群和O139群霍乱弧菌菌型特征,探讨环境水体监测的方法和疫情监测中的作用.方法 2006年3月至2007年2月,在珠江河口选择24个水样采集点,每月采集一次,进行O1群和O139群霍乱弧菌的分离培养,并利用实时PCR监测样品增菌液中的O1群和O139群霍乱弧菌.采样同时测定气温、水温等气象资料.用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对分离菌株进行分型分析.结果 监测期间共采样862份,霍乱弧菌分离阳性率7.77%,实时PCR阳性率为26.33%.按月的水样检测阳性率与水温变化趋势相似;城区监测点阳性率高于其他区域,在一家海产品批发市场排水口下游检测到产毒O139群菌株;菌株的菌型构成中,分离菌株主要为非产毒株;O1群E1 Tor小川和稻叶型以及O139群菌株的分离无季节变化趋势;PFGE分析75株分离株被分为49种带型,相似性为57.4%～100%,表现出明显的多样性.结论 霍乱弧菌在珠江河口水体中广泛存在,并呈现多样性.水体监测提供产毒菌株的指示,可作为环境危险评价的指标,且能在霍乱弧菌的监测和霍乱疫情预警中发挥作用.     

四川省2005年霍乱分子流行病学特征

目的：分析四川省2005年霍乱弧菌分子特征,以及霍乱暴发疫情分离的菌株与菌株之间,疫情分离的菌株与海、水产品监测分离的霍乱弧菌之间的遗传相关性,查找霍乱传染来源,为预测疫情和制定防治措施提供依据.方法：利用聚合酶链反应（PCR）检测O139群霍乱弧菌特异性编码脂多糖基因（LPS）和霍乱毒力基因（ctxAB）;脉冲场凝胶电泳对菌株进行分子分型,所得结果以BioNumerics V4.0软件UPGMA方法进行聚类分析.结果：所试16株霍乱弧菌14株LPS阳性,为O139群霍乱弧菌;另2株为O1群稻叶型霍乱弧菌.2株稻叶型霍乱弧菌和1株O139群霍乱弧菌ctxAB阴性,其余13株菌均具有ctxAB,为产毒株.对16株菌以NotⅠ酶切后PFGE可分为5个型别.O139群霍乱弧菌优势流行株与从甲鱼分离的O139群霍乱弧菌PFGE型别一致,且同为产毒株.结论：甲鱼等海、水产品被O139群霍乱弧菌污染情况严重,甲鱼中分离的O139群霍乱弧菌与霍乱疫情分离菌株之间高度同源,被污染的甲鱼可能是本年度食源性霍乱暴发的主要传染来源之一,海、水产品的监测是近期霍乱防控的重点.     

湖南省O139群霍乱流行因素和快速评估研究

目的了解湖南省O139群霍乱的流行特点,分析流行因素,探索快速有效的监测评估方法和预防控制措施,为制定科学的防控策略提供依据。方法采用回顾性队列研究、生态学研究和现场流行病学调查研究湖南省O139霍乱的流行特点和高发区的流行因素;评估农村集体聚餐卫生指导和管理预防控制措施的效果。分别采用膜免疫层析法和常规细菌分离培养法对腹泻病人及霍乱病人的密切接触者粪便标本进行O139霍乱弧菌检测,以后者为金标准,计算膜免疫层析法的灵敏度和特异度。结果湖南省1997-2009年共发生48起O139霍乱疫情,报告病例103例,带菌者119例,死亡2例,病死率为1.94%。在局部地区有集中发生趋势。2002-2009年常规监测腹泻病人阳性率为2.47/万,水产品样阳性率为0.57%,疫点监测检测人群阳性率为1.18%,外环境阳性率为3.44%;非疫点地区水体环境中未检测到霍乱弧菌。48起疫情中暴发16起,散发32起,28起疫情与农村集体聚餐有关。2003年9起暴发疫情中参与聚餐人员的O139霍乱弧菌感染率为5.46%,食用聚餐剩菜人员的感染率为9.23%,未食用聚餐食物人员的感染率为0,病人和带菌者分离到的O139霍乱弧菌和甲鱼中菌株的PFGE图谱相同。高发区农村聚餐中使用甲鱼和食品制作生熟不分的比率、人均甲鱼消耗量、甲鱼中O139霍乱弧菌检出率均高于低发区。高发区采取农村集体聚餐卫生指导和管理措施后,农村厨师和就餐人群的卫生习惯改善,未再发现疫情。膜免疫层析法检测病例粪便标本中灵敏度为100%,特异度为95.20%,45份实验室霍乱弧菌培养阳性的甲鱼和外环境标本经二次增菌培养,试纸条检测结果为阴性。结论湖南省1997-2009年的O139霍乱疫情呈低流行水平;O139霍乱疫情的发生主要跟食用被霍乱弧菌污染的水产品特别是甲鱼有关,以农村集体聚餐卫生指导和管理为主的综合性预防控制措施是预防O139霍乱疫情发生的有效措施;膜免疫层析法可适用于各医疗机构的腹泻病门诊患者的快速筛查和评估。     

脉冲场凝胶电泳分型追溯江西省霍乱暴发传染源

目的分析2006年5月江西省聚餐暴发霍乱疫情的分离菌株与常规监测在外环境及水产品中分离的霍乱弧菌之间分子分型特征和遗传相关性。方法利用聚合酶链反应检测霍乱毒素基因，用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对菌株进行分子分型，所得结果以BioNumerics V4．0软件UPGMA方法进行聚类分析。结果30株与暴发相关分离菌株中，无论来自病例、带菌者、疫区污水、水产品的菌株均为产毒株。30株O139群霍乱弧菌以NotⅠ酶切后PFGE可分为4个型别。从甲鱼、牛蛙分离的O139群霍乱弧菌的型别与此次暴发的优势PFGE型别一致，并且也为产毒株。两起暴发包括多起聚餐，从中分离的菌株优势型别相同，传播媒介为甲鱼、牛蛙，均购于同一水产批发部，说明为同一传染源。结论携带O139群霍乱毒素基因的甲鱼、牛蛙是引起本次多起聚餐暴发霍乱的主要传染源。     

水产品中霍乱弧菌4种检测方法的效果比较

目的研究出一套高效、实用的水产品中霍乱弧菌检测方法,监测外环境和食品中霍乱弧菌污染状况,及时、有效地防控霍乱疫情。方法按照2012年版《全国霍乱监测方案》和第6版《霍乱防治手册》,配制含不同浓度霍乱弧菌的阳性水产品样品和不含霍乱弧菌的阴性水产品样品,用碱性蛋白胨水增菌6 h后,分别用胶体金法、上转发光法、实时荧光PCR法、分离培养法4种方法检测不同水产品中霍乱弧菌的检测效果。结果胶体金法、上转发光法、实时荧光PCR法、分离培养法检测水产品中霍乱弧菌,每种方法的检测时间和检测成本各不相同,方法的敏感性不同,但特异性无差异。结论在进行水产品中霍乱弧菌监测时,可以将4种方法有机结合,先选择1种~2种快速方法进行初筛。其中上转发光法是比较理想的快速筛查方法,对筛出的阳性标本再用分离培养法进一步确证和溯源分析,可以大大提高霍乱弧菌的检测效果,更加有效地防控霍乱疫情。     

O139群霍乱弧菌荧光纳米颗粒试纸条的研制

目的本研究旨在建立一种准确、快速、简便的O139群霍乱弧菌检测方法。方法以荧光纳米颗粒为标记物,采用双抗体夹心法模式制备O139群霍乱弧菌免疫层析检测试纸条。在紫外灯下观察试纸条上质控线和检测线上的荧光信号强度作为结果判定依据。结果用所制备的O139群霍乱弧菌荧光纳米颗粒检测试纸条对9属20种105株菌进行检测,所有20株O139群霍乱弧菌检测结果呈阳性,其余85株非O139群霍乱弧菌均呈阴性反应;用该试纸条检测人工污染的海鱼样品,灵敏性为3.5×104CFU/mL。用自制试纸条和标准法同时检测77份样品(均为水产品),两种方法的总符合率为85.7%。结论O139群霍乱弧菌荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功为O139群霍乱弧菌的快速检测提供了一个极好的检测方法,便于野外检测的开展,具有广阔的应用前景。     

安徽省2009年霍乱疫情溯源实验分析

目的对2009年发生在安徽省境内的2起霍乱疫情进行溯源及2起疫情菌株的遗传相关性分析,为防控霍乱提供依据。方法应用血清学及常规细菌学方法对菌株进行鉴定,聚合酶链式反应（PCR）方法检测霍乱毒力基因,脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）对霍乱菌株进行分子分型。结果所分离3株菌均是霍乱弧菌O139且具有肠毒素（CT）和毒素共调菌毛（TCP）毒力基因;PFGE分成2个型。SZ分离株的pattern在福建、广东、湖南、江浙和重庆出现过。该pattern的菌株在霍乱数据库占已有O139菌株的12.7%;。H1、H2的pattern与辽宁分离株具有相同的pattern。该pattern的菌株在霍乱数据库中目前仅有1株。结论 3株试验菌株均是产毒株,具有致病性;首例病人分离株与该病人所食甲鱼分离株PFGE带型一致,分子流行病学分析,甲鱼可能是首起疫情的传染源之一,与第二起疫情无相关性。     

O139霍乱弧菌快速检测试纸条临床效果评价

目的 评价O139霍乱弧菌快速检测试纸条的临床使用效果。方法 采集腹泻病人及霍乱病人的密切接触者粪便标本，分别做O139霍乱弧菌快速检测试纸条和常规细菌分离培养，以后者为金标准，计算O139霍乱弧菌快速检测试纸条的灵敏度和特异度。结果 O139快速检测试纸条的灵敏度为100％，特异度为95．20％，约登指数为0．95，阳性预测值为46．67％，阴性预测值为100％。结论 O139霍乱弧菌快速检测试纸条可做为一种筛检方法在临床推广使用。     

脉冲场凝胶电泳分型技术在追溯O139霍乱传染来源中的应用

目的分析四川省2004年7起因聚餐暴发霍乱疫情的分离菌株之间,及其与常规监测中从外环境、水产品中分离的霍乱弧菌之间的分子分型特征和遗传相关性,查找霍乱传染来源.方法利用聚合酶链反应检测霍乱毒力基因（ctxAB）,用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对菌株进行分子分型,所得结果以BioNumerics V4.0软件UPGMA方法进行聚类分析.结果所试72株O139群霍乱弧菌中所有4株从河水分离的菌株ctxAB阴性,其余均具有ctxAB,为产毒株.对其中的67株菌以Not I酶切后PFGE可分为16个型别.从甲鱼分离的O139群霍乱弧菌与同期流行的O139群霍乱弧菌优势PFGE型别一致,并且也为产毒株.7起暴发中分离的菌株型别各不相同.结论2004年四川省O139霍乱暴发感染来源复杂,提示并非因为菌株在该地持续存在而引起,但甲鱼可能是2004年度霍乱聚餐暴发的主要传染来源之一.     

湖南省2012年霍乱弧菌病原学特征分析

目的了解2012年湖南省不同地区不同时间各疫情菌株的病原学特征,分析比较各疫情分离株之间以及与常规监测分离株之间的遗传相关性,为追溯传染源提供依据。方法利用生化鉴定系统进行菌株鉴定,血清学方法生物分型,PCR方法检测毒力基因和脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)进行分子分型。结果 2012年从湖南省疫情和监测样品中分离的17株O139群霍乱弧菌均带毒力基因,均为产毒株。在进行PFGE分子分型的17株菌中,有2起疫情酶切图谱完全相同,而该2起疫情与其他的3起疫情以及这3起疫情之间的酶切图谱不完全相同。结论湖南省2012年从甲鱼中分离的O139群霍乱弧菌毒力基因携带率高,是疫情频发的一个重要原因。从病人和食品中分离的菌株具有高度同源,进一步证实该疫情为食源性传播。分子分型图谱相似率100%的2起疫情传染来源一致,而其他各起疫情之间关联性很小或者没有,传染来源均不同。     

近红外免疫层析、胶体金及实时荧光PCR法在A群轮状病毒临床样本检测中的应用

目的评估近红外免疫层析法、胶体金法及实时荧光PCR法在A群轮状病毒临床样本检测中的应用效果。方法采用自主研发的免疫层析试纸条和商品化胶体金及实时荧光PCR试剂盒,检测112份腹泻儿童粪便样本中的A群轮状病毒,比较3种方法的检测结果。结果实时荧光PCR法检测轮状病毒阳性率最高,为77.68%;其次为近红外免疫层析法,阳性率为66.96%;胶体金法阳性率最低,为61.61%。与实时荧光PCR法相比,近红外免疫层析法检测灵敏度为83.91%、特异度为92.00%;胶体金法检测灵敏度为73.56%,特异度为80.00%。在25份实时荧光PCR法检测为阴性样本中,近红外免疫层析法检测出2份阳性,两者符合率为85.71%。结论近红外免疫层析法检测A群轮状病毒的灵敏度高于胶体金法,略低于实时荧光PCR法。