柯里拉京对神经胶质瘤U251细胞及其干细胞增殖的影响

目的探讨柯里拉京对神经胶质瘤U251细胞及其干细胞增殖影响。方法使用免疫磁珠法从胶质瘤U251细胞系中分离、培养U251干细胞,不同浓度(0、25、50、100μg/ml)柯里拉京对U251细胞及其干细胞干预不同时间(24 h、48 h、72 h),观察其形态学变化。CCK-8法检测柯里拉京干预前后细胞增殖变化,实时荧光定量RT-PCR技术测定柯里拉京干预前后Livin、Caspase-3及Caspase-7 m RNA表达的变化规律。结果 U251细胞及其干细胞存活率随培养液中柯里拉京浓度升高和干预时间延长而降低(P0.05);同等条件下U251干细胞存活率低于U251细胞(P0.05)。柯里拉京抑制了Livin基因表达并能诱导Caspase-3、Caspase-7基因表达,且对U251干细胞基因抑制(或诱导)作用强于U251细胞(P0.05)。结论柯里拉京能抑制胶质瘤细胞及其干细胞增殖,降低Livin基因表达并诱导Caspase-3、Caspase-7基因表达,启动凋亡信号通路,且对胶质瘤干细胞增殖抑制程度及基因抑制(或诱导)作用强于胶质瘤细胞,但其具体抗肿瘤机制还未明确,还需深入研究。     

血清剥夺法分离U87细胞系中的胶质瘤干细胞

背景：细胞周期分析已证实,90%以上的干细胞处于G0静止状态,因此采用不含任何生长因子和其他相关营养添加剂的血清剥夺培养基更适合筛选分离肿瘤干细胞。 目的：应用血清剥夺法培养胶质瘤U87细胞,并筛选鉴定该细胞系中的胶质瘤干细胞。 方法：将U87细胞培养在只含有DMEM和L-谷氨酰胺的培养基中培养6 d,筛选出胶质瘤干细胞,接着更换为神经干细胞培养基,观察细胞肿瘤球的形成过程;将肿瘤球接种于血清培养基,观察其在体外的分化特点;免疫荧光鉴定血清剥夺后尚存的细胞、增殖形成的肿瘤球细胞和分化细胞。 结果与结论：应用血清剥夺的方法成功地筛选出了表达CD133的肿瘤干细胞,并能增殖形成肿瘤球;肿瘤球可多向分化,子代细胞表达胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶。说明U87细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的胶质瘤干细胞。     

恶性胶质瘤细胞株U251中肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

目的:从恶性胶质瘤细胞株U251中分离、培养并鉴定肿瘤干细胞。方法:将U251细胞置于含EGF、bFGF、LIF及B27的无血清培养基中培养,形成悬浮生长的细胞球后经免疫磁珠分离获取CD133阳性细胞,采用单细胞克隆法继续在上述培养液中培养。应用细胞免疫荧光染色对肿瘤干细胞及其分化细胞进行鉴定。结果:在恶性胶质瘤细胞株U251中成功分离出肿瘤干细胞,在上述无血清培养液中呈悬浮生长,具有很强的自我更新与繁殖能力,免疫荧光染色显示该细胞表达CD133,诱导分化后可分化成为神经元与星形胶质细胞。结论:体外培养的恶性胶质瘤细胞株U251中存在脑肿瘤干细胞,并能将其分离、培养及诱导分化。     

不同病理级别脑胶质瘤的肿瘤干细胞体外分离培养和增殖分化

目的探讨不同病理级别的人脑胶质瘤的肿瘤干细胞在体外分离培养和增殖分化的情况。方法通过对不同病理级别手术切除的胶质瘤新鲜标本在体外无血清培养基中分离培养和体外增殖分化进行观察研究和分组比较它们的增殖能力。结果在无血清培养基中,Ⅰ级胶质瘤的肿瘤干细胞不能形成克隆球;Ⅱ级胶质瘤的肿瘤干细胞可形成中等克隆球;只有Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤的肿瘤干细胞才能形成大型克隆球。在血清培养基中,Ⅰ级胶质瘤干细胞增殖缓慢、分化较晚;Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤的肿瘤干细胞增殖迅速、快速进入分化期;Ⅱ级胶质瘤肿瘤干细胞增殖分化介于两者之间。分组比较,发现在不同培养基中和不同病理级别胶质瘤干细胞各组之间在增殖和分化能力上均存在统计学差异(P<0.01)。结论胶质瘤的肿瘤干细胞在生物特性上存在多样性。Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤的肿瘤干细胞易于分离培养,增殖分化能力较强;Ⅰ级胶质瘤的肿瘤干细胞增殖分化缓慢,有助于动态观察脑肿瘤干细胞自我更新和增殖分化的过程,是一个较好的观察研究对象。     

TMZ对胶质瘤U251细胞及其干细胞TNF-α影响的体内研究

目的利用胶质瘤细胞及其干细胞制作裸鼠脑内种植瘤模型,动物水平研究替莫唑胺对胶质瘤细胞及其干细胞裸鼠脑内种植瘤肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响。方法免疫磁珠法分选CDl33+干细胞,脑立体定向制作裸鼠脑内种植瘤模型,不同浓度替莫唑胺干预,观察裸鼠生长行为学变化、肿瘤的病理学特征,荧光实时定量逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测TNF-α表达。结果肿瘤组织的病理学观察发现干细胞较U251细胞具有更高的侵袭性。RT-PCR检测发现,干细胞中TNF-αmRNA表达量显著高于U251细胞(P0.01)。替莫唑胺(TMZ)对U251细胞及其干细胞TNF-αmRNA的表达产生抑制作用。60μmol/L TMZ干预时,干细胞TNF-αmRNA表达量显著低于U251细胞(P0.01)。结论胶质瘤干细胞较U251细胞具有更强的化疗耐药性,这可能是胶质瘤化疗耐药的机制。     

PEX基因对C6胶质瘤干细胞增殖作用影响的研究

目的探讨PEX基因对大鼠C6胶质瘤干细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用传统的血清培养基培养C6胶质瘤细胞系,再取其单细胞悬液悬浮培养于无血清培养基中传代培养。采用免疫荧光染色分离鉴定脑肿瘤干细胞(BTSCs),应用本实验室成功构建的重组子pDsRed2-C1-PEX以脂质体为介导转染体外培养的BTSCs.RT-PCR验证真核表达载体在BTSCs中的表达。MTT法观察PEX对BTSCs增殖活性的影响,并用流式细胞仪检测胶质瘤干细胞的细胞周期变化。结果成功培养出BTSCs并成功转染,PEX在BTSCs中高表达并且其对体外培养的BTSCs的增殖有明显抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期显示:BTSCsPEX转染组细胞周期G0/G1期细胞百分数明显升高为81.10%,S期细胞百分数明显降低为12.04%,差异有统计学意义(P0.05)。结论 PEX基因可以在BTSCs中表达,并且能直接抑制体外培养的BTSCs的生长增殖。     

Rap2a在胶质瘤中的表达及其意义

目的探讨Rap2a在胶质瘤中的表达及其意义。方法应用Western blot检测Rap2a在胶质瘤组织中的表达情况;在胶质瘤细胞U251、U87中转染Rap2a质粒,应用细胞克隆形成实验和Ed U实验检测过表达Rap2a对U251、U87细胞增殖的影响;应用流式细胞术检测过表达Rap2a对U251、U87细胞周期的影响。结果 Rap2a在胶质瘤组织中呈低表达;过表达Rap2a抑制了U251、U87的增殖;过表达Rap2a明显使细胞U251、U87的细胞周期阻滞在G0/G1期。结论 Rap2a的蛋白表达水平在胶质瘤组织中表达下调,过表达Rap2a抑制胶质瘤细胞的增殖能力。     

替莫唑胺对胶质瘤干细胞抗凋亡与多重耐药基因及细胞周期的影响

目的 分析替莫唑胺(TMZ)对胶质瘤U251细胞及其干细胞livin、MRP基因表达及细胞周期的影响.方法 分离培养U251细胞及其干细胞后,不同浓度的TMZ(0、25、50、100、200、400 μmol/L)干预72 h,CCK-8检测细胞增殖变化趋势,流式细胞术(FCM)检测细胞周期变化,RTPCR技术检测livin、MRP1、MRP3 mRNA表达.结果 本研究成功从U251细胞中分离出U251干细胞;与未干预组相比,25 μmol/L的TMZ干预U251细胞及其干细胞后其增殖率分别为0.952±0.011(t=-8.219,P=0.001)、0.937±0.029(t=-3.822,P=0.019)和100 μmol/L的TMZ干预U251细胞及其干细胞后其增殖率分别为0.750±0.018、0.887±0.039(t=5.480,P=0.005);正常情况下,livin基因在U251细胞及其干细胞中的表达量分别为(0.411 ±0.025)×10-3、(0.571 ±0.040)×10-3(t=-3.348,P=0.004),MRP1基因的表达量分别为(0.295 ±0.018)×-3、(0.481 ±0.034)×10-3(t=-8.439,P=0.001),MRP3基因的表达量分别为(1.128±0.117)×10-3、(0.963±0.059)×10-3(=2.176,P=0.095);200 μmol/L的TMZ干预U251细胞及其干细胞后livin mRNA表达量在分别为(0.020±0.002)×10-3(t=27.123,P =0)、(0.066 ±0.007)×10-3(￡=21.345,P =0);200 μmol/L干预后MRP1 mRNA表达量为(0.556±0.041)×10-3 (t=-10.214,P=0.001)、(0.609 ±0.044)×10-3(t=-3.98,P=0.016);200 μmol/L干预MRP3 mRNA表达量为(1.397±0.192)×10-3(t=-2.073,P=0.107)、(1.496 ±0.302)×10-3(t=-2.993,P=0.040);100 μmol/L干预后细胞周期U251细胞G2/M期百分比为11.353 ±0.516、39.1±1.2(t=-37.1,P=0)和U251干细胞S期百分比为21.1±1.0、30.2±1.7(t=-8.07,P=0.001).结论 替莫唑胺能有效降低U251及其干细胞中livin基因的表达,并使细胞分裂周期停滞,降低细胞增殖率,促进细胞凋亡.MRP1和MRP3可能分别是原发胶质瘤与复发胶质瘤耐药的主要原因之一.     

人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中NOTCH-1信号通路的调控

背景：研究发现NOTCH-1信号通路在神经干细胞或神经前体细胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用。 目的：探讨NOTCH-1信号通路在人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中的调控作用。 设计、时间及地点：开放性实验,于2005-01/2007-03在解放军第三军医大学新桥医院完成。 材料：人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织由解放军第三军医大学新桥医院神经外科提供。U251胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学新桥医院神经外科吕胜青副教授惠赠;CHG-5胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学西南医院病理研究所卞修武教授、姚晓红博士惠赠。 方法：取人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织、U251及CHG-5胶质瘤细胞株,采用免疫磁珠法分选获得CD133+脑胶质瘤干细胞,加入DMEM/F12无血清培养基进行增殖培养,形成细胞克隆后,加入含体积分数为10%胎牛血清的培养液,2 h后行抗CD133和抗巢蛋白免疫荧光双标染色。 主要观察指标：人脑胶质瘤干细胞的生长和鉴定,采用WST-8法、免疫组化实验、流式细胞仪、免疫荧光双标实验检测NOTCH-1信号通路蛋白的表达。 结果：在无血清培养基中,细胞呈悬浮生长,培养24~48 h可见单个细胞开始分裂生长,形成肿瘤球,将肿瘤球转入含胎牛血清的培养基后,4 h周边细胞伸出突起并逐渐分化,24 h后肿瘤球迁移出的细胞增多,形成单细胞层。肿瘤球能同时表达干细胞标志物CD133和巢蛋白,CD133+脑胶质瘤干细胞核浆比例达2/3~3/4,突起少,胞浆中线粒体等细胞器较少,核糖体丰富,未见胶质丝等分化结构,符合干细胞超微结构特点。NOTCH-1蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达明显强于正常成人脑组织（P < 0.01）,在CD133+ U251及CHG-5胶质瘤细胞中有很强的表达,在GFAP+和MAP2+ U251及CHG-5胶质瘤细胞中的表达强弱不等,在MBP+ U251及CHG-5胶质瘤细胞中呈弱表达或不表达。在脑胶质瘤干细胞增殖过程中能检测到较强的NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1 mRNA及NOTCH-1,HES-1蛋白表达;而在细胞分化时NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1 mRNA和HES-1蛋白表达逐渐减弱。 结论：NOTCH-1信号通路的关键蛋白分子NOTCH-1在人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中均有表达,而在正常成人脑组织中仅微弱表达。NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1和HES-1的表达强弱可能参与了胶质瘤干细胞增殖和分化的调控。     

人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性

背景：有研究者提出，脑内存在少量正常的神经干细胞能够向肿瘤组织迁移。这需要对从胶质瘤体外培养得到的肿瘤干细胞与正常的神经干细胞进行鉴别。 目的：从人脑胶质瘤组织中分离脑胶质瘤干细胞进行体外培养，并对其干细胞特性加以鉴定，观察脑肿瘤干细胞的生长特性。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于2007-02/12在解放军第四军医大学细胞工程研究中心完成。 材料：7份肿瘤标本来源于胶质瘤患者，间变性星形细胞瘤标本3份，多形性胶质母细胞瘤标本4份。 方法：将获取的胶质瘤细胞置于含2%B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、左旋谷胺酰氨、胰岛素、青霉素和链霉素生长因子的无血清DMEM/F12培养基中，重新悬浮为单细胞悬液，以1×108 L-1接种于含有B27、表皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中培养分离培养肿瘤干细胞球。取第5代的肿瘤干细胞球，离心后除去原培养基，用含有体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养基接种于放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的小平皿中，观察肿瘤干细胞分化情况。 主要观察指标：利用细胞免疫荧光及组织免疫组织化学法检测脑肿瘤干细胞在细胞培养或组织切片中CD133及巢蛋白表达。 结果：在胶质瘤中存在一定量的细胞能在无血清培养基中存活并悬浮生长，并增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球，细胞核较大，核质比例高，具有肿瘤细胞的特性，与原肿瘤组织标本的苏木精-伊红染色比较，肿瘤干细胞分化后的子代细胞中大部分与胶质瘤细胞相似。原代及传代脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白和CD133。 结论：人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞，并能在体外将其分离培养，能够自我更新增殖、诱导分化，表达神经干细胞标志物CD133。     

Evi1基因对胶质瘤细胞株U87/U251增殖、侵袭的影响

目的探讨Evi1基因在不同级别胶质瘤组织中的表达,以及调控该基因对胶质瘤细胞株U87和U251细胞增殖、细胞周期和侵袭影响,为靶向癌基因治疗胶质瘤提供客观依据。方法首先通过实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测人脑不同级别胶质瘤组织以及U87和U251细胞株中Evil基因的表达水平。用合成的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰下调U87和U251细胞Evi1基因表达作为干扰组,同时设空白和阴性对照组。qRT-PCR检测转染前后Evi1基因在U87和U251细胞中的表达和转染效率。CCK-8法检测实验组细胞的增殖能力,流式细胞仪分析Flow Cytometer(FCM)其细胞周期。Transwell以及划痕试验检测各组U87和U251的侵袭和迁移能力。以及用qRT-PCR分析下调Evi1基因后U87和U251细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达水平。结果 Evi1基因在胶质瘤组织中呈现高表达,且随着胶质瘤级别程度增加其表达水平亦上升,其中Ⅲ和Ⅳ级的胶质瘤组织以及U87、U251细胞Evi1基因表达明显高于非瘤脑组织(均P0.05)。通过siRNA下调Evi1基因后,胶质瘤细胞株U87和U251的增殖减缓(均P0.05),其侵袭和迁移能力明显下降(均P0.01),并能阻滞其细胞周期G1期(P0.05)。干扰组U87和U251细胞MMP2表达水平明显降低(均P0.01)。结论 Evi1基因在胶质瘤中呈高表达,干扰U87和U251细胞Evi1基因可抑制胶质瘤的增殖和侵袭。     

隔蛋白7对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响

目的 检测SEVT7对胶质瘤细胞系U251的细胞周期、增殖、侵袭以及凋亡的影响.方法 流式细胞术分析转染SEPT7对细胞周期的影响,Western blot检测细胞周期因子表达变化,MTT法和Annexin V法评价SEFT7对U251细胞的增殖活性和凋亡的影响,Martrigel三维立体培养分析转染SEPT7后U251细胞侵袭能力的变化.结果 SEPT7使U251细胞G0/G1期阻滞,S期细胞比例(SPF)降低,增殖活性和侵袭能力明显受到抑制,并可诱发细胞凋亡.结论 SEPT7抑制U251细胞侵袭、增殖,促进凋亡.结果 提示,SEPT7是对胶质瘤具有抑制作用的基因.     

I型γ-分泌酶抑制剂对恶性胶质瘤细胞株增殖及凋亡的影响

目的 探讨I型γ-分泌酶抑制剂(GSI-I)对U87、U251胶质瘤细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用.方法 应用GSI-I作用于U87、U251胶质瘤细胞,通过MTT法观察GSI-I对上述两种细胞的增殖抑制作用,通过流式细胞仪检测GSI-I对该两种细胞细胞周期的影响及诱导凋亡的作用.结果RT-PCR及实时定量荧光RT-PCR结果显示,GSI-T可明显抑制胶质瘤细胞中Notch通路的活性,主要体现为Notch通路的靶基因Hes-1表达明显下调.MTT检测结果显示2.5μmol/L及以上浓度的GSI-I对U87及U251胶质瘤细胞有明显的增殖抑制作用.与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且该抑制作用呈剂量依赖型增加.流式细胞检测结果显示GSI-I主要使U87胶质瘤细胞的细胞周期阻滞在G1期而抑制细胞增殖,对于U251胶质瘤细胞则主要通过诱导凋亡来抑制增殖.结论 GSI-I可明显抑制U87及U251胶质瘤细胞的增殖并诱导凋亡,为恶性胶质瘤的临床治疗提供了理论参考依据.     

简化无血清培养基分离U2-OS人骨肉瘤细胞系肿瘤干细胞

背景：已有实验应用成分复杂的无血清培养基从骨肉瘤组织中分离出干细胞样肿瘤细胞。 目的：应用简化的无血清培养基在U2-OS人骨肉瘤细胞系中分离培养出骨肉瘤干细胞并对其作肿瘤干细胞的相关检验。 设计、时间及地点：干细胞体外培养实验,于2006-02/2007-02在兰州大学第二医院骨科研究所完成。 材料：U2-OS人骨肉瘤细胞系购自中科院上海生命科学研究院细胞库。无血清培养基为在DMEM/F12培养基中添加重组表皮生长因子(20 μg/L)和重组成纤维生长因子(20 μg/L),L-谷氨酰胺(2 mmol/L),胰岛素(4 U/L),青霉素G(1×l05 U/L),链霉素(100 mg/L)。 方法：取在含血清培养基中贴壁生长的U2-OS细胞,接种于含有表皮生长因子和成纤维生长因子的简化无血清培养基中,形成悬浮生长的骨肉瘤细胞球后观察其增殖、分化能力。用免疫细胞化学染色法检测间充质干细胞标志CD44、CD105蛋白在骨肉瘤细胞球中的表达。反转录-聚合酶链反应法检测U2-OS细胞及其肿瘤干细胞中胚胎多能干细胞管家基因Oct 3/4 mRNA的表达。 主要观察指标：①悬浮细胞球的形成。②肿瘤干细胞增殖活性。③肿瘤干细胞的侵袭能力。④CD44、CD105蛋白在骨肉瘤细胞球细胞中的表达。⑤肿瘤干细胞中Oct 3/4 mRNA的表达。 结果：U2-OS人骨肉瘤细胞系中有极少数的细胞能在简化无血清培养基中增殖形成骨肉瘤细胞球,具有很强的增殖分化能力,其表面具有间充质干细胞的膜分子CD44、CD105,表达胚胎干细胞管家基因Oct 3/4 mRNA。 结论：U2-OS细胞系中存在肿瘤干细胞,简化无血清培养基可用于分离培养骨肉瘤干细胞。     

下调RNF138基因对胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡及细胞周期影响的研究

目的探讨RNA干扰下调胶质瘤细胞株高表达基因RNF138对胶质瘤细胞株U251体外增殖、凋亡以及细胞周期的影响。方法构建下调RNF138基因的siRNA,通过慢病毒转染导入胶质瘤细胞株U251,设立阴性干扰对照组及空白对照组,荧光显微镜观察转染效率;实时荧光定量PCR检测敲减效率;运用Cellomics仪器连续检测U251体外增殖情况;流式细胞仪检测U251凋亡及细胞周期变化情况。结果慢病毒载体高效、稳定转染U251细胞,靶向RNF138的siRNA有效抑制RNF138基因表达,使RNF138mRNA表达减少60%,U251体外增殖明显减缓,凋亡明显增加,细胞阻滞在G2/M期。结论 RNA干扰抑制RNF138基因表达可以明显抑制胶质瘤细胞株U251体外增殖,促进其凋亡,影响细胞周期,阻滞细胞分裂。     

CREPT对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制

目的 探讨肿瘤高表达细胞周期相关蛋白（CREPT）对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响及可能机制。方法 体外培养人胶质瘤细胞株U373、U251、A172、U87-MG、SHG44,并构建过表达或沉默CREPT的U251细胞;免疫印迹法检测蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 U251细胞CREPT蛋白表达水平最高,SHG44细胞最低。沉默CREPT后,U251细胞增殖、侵袭和迁移能力明显下降（P<0.05）,p-Wnt和p-β-catenin蛋白表达水平下降（P<0.05）。过表达CREPT后,U251细胞增殖、侵袭和迁移能力明显增强（P<0.05）,p-Wnt和p-β-catenin蛋白水平明显升高（P<0.05）。Wnt/β-catenin通路抑制剂KYA1797K可逆转过表达CREPT对细胞增殖、侵袭和迁移的影响（P<0.05）。结论 CREPT可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭和迁移。     

表皮生长因子受体拮抗剂靶向抑制胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂-吉非替尼对人脑胶质瘤细胞的增殖抑制作用,为胶质瘤干细胞靶向治疗研究作准备。方法荧光定量PCR检测人脑胶质瘤细胞U251、GBM、SHG44及神经干细胞、脑肿瘤干细胞中EG-FR基因的表达。选择不同浓度的吉非替尼作用于U251细胞48h,MTT法检测药物对细胞的抑制率;流式细胞仪分析吉非替尼作用U251细胞后细胞增殖周期和细胞凋亡比率的变化。结果U251和脑肿瘤干细胞中都高表达EGFR。吉非替尼对U251细胞有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性,IC50为19.0μM。以12.7μM、19.0μM和25.3μM吉非替尼处理U251细胞,随着药物浓度的增加,G0-G1期细胞比例和细胞凋亡率都逐渐升高。结论EGFR在U251细胞和脑肿瘤干细胞中都高表达,其拮抗剂吉非替尼对U251的细胞增殖有显著的抑制作用,为靶向治疗胶质瘤干细胞的研究开拓了思路。     

恶性胶质瘤中干细胞分离与细胞周期检测

目的从多形性胶质母细胞瘤组织标本中分离、培养、鉴定胶质瘤干细胞,并检测其所处的细胞周期。方法采用逐步递减培养基中血清含量的方式从多形性胶质母细胞瘤组织标本中获得悬浮生长的肿瘤球,应用免疫荧光染色检测胶质瘤干细胞及其分化细胞表面标志物的表达,免疫组化检测裸鼠颅内移植瘤表型。免疫磁珠分选多形性胶质母细胞瘤组织标本中的CD133阳性细胞后立即检测细胞周期。结果在多形性胶质母细胞瘤组织标本中成功分离出胶质瘤干细胞,在无血清培养液中呈悬浮生长,具有很强的自我更新与繁殖能力,免疫荧光染色显示该细胞表达CD133和巢蛋白,诱导分化后可分化成为神经元、星形胶质细胞与少突胶质细胞,裸鼠颅内移植后可重现亲本肿瘤表型。位于其中的胶质瘤干细胞大多处于G0～G1期。结论多形性胶质母细胞瘤组织中存在胶质瘤干细胞,相对处于静止状态。     

miR-106a抑制胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡

目的胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,具有较高的病死率。现有的研究表明miR-106a在多种肿瘤中表达上调,并发挥着致癌性作用,但miR-106a在胶质瘤中的表达和作用却并不清楚。方法不同级别胶质瘤组织和胶质瘤细胞系(T98G,SHG44,U87,U251,U373)内的miR-106a水平通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定。转染miRNA寡聚核苷酸后的U87和U251细胞的增殖能力和细胞周期分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和流式细胞仪测定,并且通过膜联蛋白/碘化丙啶(annexin V/PI)双染法测定了miR-106a对胶质瘤细胞的凋亡影响。结果miR-106a在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系内表达水平相对正常脑组织显著下降,并且miR-106a表达水平与胶质瘤病理级别负相关。胶质瘤细胞转染miR-106a后,可检测到过表达的miR-106a可显著抑制胶质瘤细胞的增殖能力,阻滞细胞周期于G0/G1期,同时诱导胶质瘤细胞凋亡增加。结论 miR-106a可阻滞胶质瘤细胞细胞周期、抑制增殖和诱导凋亡。     

CD133阳性人脑胶质瘤干细胞增殖特点分析

目的体外培养、分选出胶质瘤干细胞,观察其生长方式并检测其细胞周期。方法体外原代无血清培养(添加EGF、FGF、B27等因子)人胶质瘤细胞和U87细胞株,观察其增殖分裂及多向分化,CD133流式分选后用碘化丙啶法检测其细胞周期。结果细胞出现2种分裂方式:对称分裂、不对称分裂。对称分裂后细胞一般不再增殖,而不对称分裂者逐渐形成细胞球。分选后细胞周期检测发现CD133+细胞中G0/G1期比例高而CD133-中G2/M期比例高(P0.01)。结论不对称分裂是干细胞主要增殖方式,而肿瘤干细胞可分为静止群和活跃群,且静止群较多,可能是胶质瘤难以根治和易复发的原因之一。