实时荧光定量PCR技术在群体感染性腹泻病原体快速筛查中的应用

目的:建立快速筛查感染性腹泻标本的实时荧光定量PCR法,考察其在群体感染性腹泻病原体快速筛查中的应用.方法:采用国家标准的细菌培养法(或传统ELISA法)对2006年丽水地区发生的总计14起共487例群体感染性腹泻标本进行病原体筛查,同时采用实时荧光定量PCR方法对该487例标本进行检测,比较两者的实验结果,并考察实时荧光定量PCR方法的特异性和灵敏度.结果:实时荧光定量PCR检测结果与传统检测方法的符合率为97.54%,除完全符合的278例标本之外,另有7例采用传统方法检测为阴性的标本用实时荧光定量PCR检测显示为阳性.表明实时荧光定量PCR方法具有更高的灵敏度;特异性和灵敏度实验表明实时荧光定量PCR方法的特异性达100%,灵敏度为102拷贝/ml.结论:实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高、检测快速等优点.是一种理想的群体感染性腹泻病原体快速筛查的方法.     

感染性腹泻患者标本中检出GⅡ型诺如病毒

目的为确定引起腹泻的病原体,对腹泻患者标本进行诺如病毒核酸检测。方法应用实时荧光RT—PCR法对5份感染性腹泻患者粪便标本进行GI型和GII诺如病毒RNA检测。结果5份患者粪便标本中,1份检出GII型诺如病毒核酸。结论大连地区的感染性腹泻病例中存在GII诺如病毒感染。     

TaqMan探针实时荧光定量PCR检测聚集性细菌性腹泻病原的初步应用

目的 应用TaqMan探针实时荧光定量PCR,对聚集性细菌性腹泻便标本提取的DNA,进行多项病原初筛检测,结合常规培养以提高工作效率。方法 应用TaqMan探针实时荧光定量PCR对3起聚集性细菌性腹泻便标本提取的DNA进行多项病原检测,初筛阳性者再进行相应阳性病原的常规培养。结果 第1起疫情22件便标本,6件沙门菌核酸阳性中有5件检出鼠伤寒沙门菌;第2起疫情16件便标本,4件肠致泻性大肠杆菌核酸阳性中有1件检出肠致病性大肠杆菌O142∶K86(B)和产耐热肠毒素的肠产毒性大肠杆菌;第3起疫情2件便标本,2件产气荚膜梭状芽胞杆菌核酸阳性中有1件检出产气荚膜梭状芽胞杆菌。TaqMan探针实时荧光定量PCR阳性检出率为30.0%(12/40),常规培养法阳性检出率为17.5.0%(7/40)。结论 TaqMan探针实时荧光定量PCR检测聚集性细菌性腹泻病原,阳性检出率高于常规培养法,有初筛作用,为腹泻疫情的处置提供可靠的病原学检测数据。     

荧光定量PCR技术和分离培养法检测小肠结肠炎耶尔森菌的比较研究

目的比较荧光定量PCR法和分离培养法在检测小肠结肠炎耶尔森菌中特异性和灵敏度的差异。方法从686份婴幼儿腹泻患儿的粪便标本中提取细菌基因组DNA,在进行小肠结肠炎耶尔森菌保守基因fox A和黏附侵袭位点基因ail的实时荧光定量PCR检测的同时,也按常规方法进行菌株分离培养,并对2种方法的检出结果进行比较分析。结果686份标本中,分离培养法检测结果为阳性4份,阴性682份;荧光定量PCR法检测结果为阳性5份,阴性681份。荧光定量PCR法检出的5份阳性标本中,分离培养法结果为4份阳性,1份阴性。结论采用fox A联合ail基因的荧光定量PCR法特异性强,灵敏度高,且操作简便快速,检测成本低,对于监测小肠结肠炎耶尔森菌有重要意义。     

环介导技术在感染性腹泻沙门菌检测中的应用与研究

目的建立并应用环介导等温扩增法(LAMP)检测肠道门诊感染性腹泻中的沙门菌。方法通过在线软件Primer Explorer V5设计针对沙门菌的保守区引物,建立LAMP检测方法,采用荧光定量PCR法、LAMP法和分离培养法,对本院2015年肠道门诊137例患者的粪便标本进行检测。对建立的方法进行特异度、灵敏度试验,与荧光定量PCR法和培养法进行比对。结果 137份标本中,荧光定量PCR法检出28份阳性,LAMP法检出28份阳性,分离培养法检出23份阳性。3种方法的检测结果差异无统计学意义(P0.05)。LAMP对6株沙门菌属扩增的结果均为阳性,而对志贺菌等5株致病菌株扩增的结果均为阴性。LAMP检测方法具有良好的灵敏度和特异度。结论 LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,比荧光定量PCR法更适用于基层疾病预防控制机构,有着较为广泛的发展前景。     

感染性腹泻疫情检测结果分析

目的明确一起感染性腹泻疫情的病原体和来源。方法通过流行病学调查,查明罹患率。采集疑似感染性腹泻患者肛拭子、生活饮用水、空气和环境涂抹拭子,用实时荧光定量RT-PCR法快速检测轮状病毒A群、B群、C群,诺如病毒GⅠ、GⅡ型和肠道腺病毒三种感染性病毒核酸,肛拭子采用细菌培养检测肠道致病菌,生活饮用水检测菌落总数和大肠菌群。结果共采集病例标本21份,生活饮用水2份,厕所空气样2份,环境标本标本厕所蹲位地面墙面、寝室门把手地面等涂抹拭子20份,病例标本13份、环境标本3份为诺如病毒核酸GⅡ型,其他轮状病毒A群、B群、C群,诺如病毒GⅠ型和肠道腺病毒核酸、肠道致病菌检测为均阴性,饮用水菌落总数和大肠菌群检测均未检出。结论该起疫情为诺如病毒感染所致。暴发的可能传播为人与人接触传播和空气气溶胶传播。实时荧光定量RT-PCR法准确快速的检测出诺如病毒GⅡ型病原体,为疫情的处理提供了及时正确的方向。     

实时荧光PCR检测志贺菌特异基因ipaH

目的：建立一种灵敏、快速检测志贺菌的实时荧光PCR方法,研究志贺菌在腹泻病人中的感染情况。方法：针对志贺菌特异性基因ipaH设计引物、探针,应用培养分离的志贺菌进行验证,同时检测360例临床标本并与培养法进行对照。结果：应用实时荧光PCR方法,10株志贺菌检测结果均为阳性,10株非志贺菌结果均为阴性;检测灵敏度达到4 cfu/test。360例临床标本中实时荧光PCR方法检测出29例阳性,培养法检测出12例阳性。结论：实时荧光PCR法检测志贺菌具有灵敏度高、快速方便的特点,可用于检测腹泻病人志贺菌感染。     

实时荧光PCR技术在预防性健康检查沙门菌与志贺菌检测中的应用

目的将实时荧光PCR技术应用于食品及公共场所从业人员肛拭标本的沙门菌与志贺菌检测,评价其作为快速检测方法的适用性。方法采集肠道门诊粪便与肛拭标本分别利用实时荧光PCR法与传统培养法进行平行对照实验,验证实时荧光PCR法的灵敏度与特异度;然后将此法与列联表结合应用于从业人员肛拭标本的检测。结果 515份肠道门诊标本的检测结果表明,实时荧光PCR法阳性率高于培养法(P0.05),沙门菌与志贺菌的灵敏度均为100.00%,特异度分别为98.98%、97.02%。检测2013年采集的从业人员肛拭标本21 590份,检出沙门菌18株,阳性率为0.83‰;未检出志贺菌。实时荧光PCR法检出率高于2014年同期传统培养法检出率。结论实时荧光PCR技术有助于提升预防性健康检查中沙门菌与志贺菌的检出率,而且特异度强、灵敏度高,兼具时效性与客观性,适合基层实验室对从业人员进行沙门菌与志贺菌的快速筛查。     

北京市丰台区首起GⅡ.8诺如病毒暴发疫情的实验室鉴定及基因特征分析

目的对北京市丰台区某小学2014年5-6月间首起GⅡ.8诺如病毒感染性肠胃炎暴发疫情进行病原体鉴定及基因分型,为防控提供科学依据。方法采用实时荧光定量PCR法对12份病例标本进行诺如病毒核酸检测,阳性标本经RT-PCR扩增RNA多聚酶区部分序列,使用Bio Edit及Mega5.2.2软件对扩增序列进行同源性及进化分析。结果20件疫情标本检出12件诺如病毒核酸阳性,阳性率60.00%,序列分析表明为GⅡ.8型。结论此次诺如病毒感染性腹泻暴发疫情可能是由于学生间接触传播导致,是丰台区首次发现由GⅡ.8型诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发疫情,需要加强监测。     

实时荧光定量PCR法在流感病毒暴发疫情病原学检测诊断中的应用

目的对疑似流感病毒患者标本进行病毒核酸检测诊断,探讨实时荧光定量PCR法在流行性感冒检测诊断中的意义。方法采用WHO标准实时荧光定量PCR法对2010年10月本地区采集的8份疑似甲型H1N1流感患者咽拭子标本进行病毒核酸检测。结果 8份咽拭子标本中有6份呈甲型H1N1流感病毒核酸阳性,阳性率75%。结论实时荧光定量PCR法操作相对简单,耗时短,特异性强,灵敏度高,可作为基层疾控中心流感疫情可靠的快速诊断方法。     

应用荧光定量PCR检测阴道加特纳菌

目的:确定荧光定量PCR方法检测细菌性阴道病相关细菌阴道加特纳菌的可行性。方法:采用SYBR Green方法建立了阴道加特纳菌荧光定量PCR方法,评价荧光PCR方法的特异性、灵敏度、重复性;并对568例临床分泌物样本进行检测。结果:本实验所建立的荧光定量PCR方法可准确、特异的检测阴道加特纳菌;该方法的灵敏度可达到1拷贝/μl;194例细菌性阴道病患者分泌物标本中荧光定量PCR法检出116例(59.79%)阴道加特纳菌;而在374例非细菌性阴道病患者分泌物标本中荧光定量PCR法检出35例(9.36%)阴道加特纳菌;荧光定量PCR法检出率明显高于细菌培养方法,差异具有显著性,χ2=24.89,P<0.01。结论:荧光定量PCR方法能够应该用于临床分泌物标本中的阴道加特纳菌的检测。     

2015－2016年株洲市感染性腹泻病原学监测结果分析

目的 了解株洲市感染性腹泻的病原学特征和流行病学特征,为感染性腹泻防控提供参考依据。方法 连续收集2015年5月－2016年4月哨点医院门诊腹泻病例粪便标本,采用实时荧光聚合酶链反应检测病毒核酸,采用传统培养方法检测致病菌,分析病原体构成、季节变化、人群分布。结果 从150例病例粪便标本中检出病原体87例,检出率为58.0%。致病菌检出率为21.3%,集中在夏季,主要为沙门菌(12例)、致泻性大肠杆菌(12例)。病毒检出率为36.7%,集中在秋冬季,主要为轮状病毒A型(28例)、诺如病毒(17例)。性别检出率差异无统计学意义(χ²=0.06,P>0.05)。不同年龄组中的副溶血性弧菌(P=0.001)、诺如病毒(P=0.006)检出率差异有统计学意义。病原体检出主要集中在0~5岁人群(71.3%,62/87)。结论 株洲市感染性腹泻病原体夏季以细菌为主,秋、冬季以病毒为主。0~5岁儿童是感染性腹泻高发人群。     

应用实时荧光定量PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒

目的:对疑似甲型H1N1流感患者标本进行病毒核酸检测确诊,探讨实时荧光定量PCR检测方法在流行性感冒检测诊断中的意义。方法:采用WHO标准实时荧光定量PCR方法对2009年6月～12月萧山地区采集的436份疑似甲型H1N1流感患者咽拭子标本进行病毒核酸检测,并对甲型H1N1流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒和乙型流感病毒进行快速分型。结果:436份咽拭子标本中有144份呈甲型H1N1流感病毒核酸阳性,阳性率33.03%,另检出甲1型流感病毒15份,甲3型流感病毒30份,没有检出乙型流感病毒。结论:实时荧光定量PCR方法操作方便、耗时短、特异性强、灵敏度高,可作为甲型H1N1流感疫情可靠的快速诊断方法。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法检测沙门菌的比较

目的:比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法检测沙门菌的灵敏度与特异性。方法:采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR方法,同时对沙门菌等细菌进行检测。结果:实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达33 cfu/m l,且有很高的特异性,对金黄色葡萄球菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是2种方法中最为快速敏感的方法,适用于临床实验室的快速诊断。     

应用快速培养法与real-time PCR检测儿童肺炎支原体

【目的】探讨肺炎支原体快速培养与实时荧光定量PCR在儿童支原体感染早期快速诊断中的价值,寻求更适合临床应用的肺炎支原体检测方法。【方法】对106例呼吸道感染儿童患者咽拭子标本,同时应用肺炎支原体快速鉴定培养法进行MP培养检测和实时荧光定量PCR检测MP-DNA,并分析两种方法结果。【结果】106例呼吸道感染患儿咽拭子标本中肺炎支原体快速培养阳性31例,检出率是29.3%(31/106),PCR方法阳性28例,检出率是26.4%(28/106)。两种方法检出阳性病例不完全相符。联合检查检出率为46.2%。【结论】两种检测方法各有优、缺点,联合应用可以提高检出率,减少漏诊。     

实时荧光定量PCR在副溶血性弧菌食物中毒检测中的应用探讨

目的:应用荧光定量PCR方法快速筛检副溶血性弧菌等食物中毒病原菌,以提高检测速度,与GB培养法比较,探讨两法的符合性和应用价值。方法:采用高度特异、敏感的实时荧光PCR作为初筛方法,用GB方法进行细菌分离培养,用ATB对分离到的病原菌进行鉴定。结果:21份食物中毒病人大便标本实时荧光定量PCR检出副溶血性弧菌特异性DNA核酸阳性18份,GB细菌培养检出18株副溶血性弧菌,两法的阳性符合率一致,检出率均为85.71%。结论:能用实时荧光定量PCR检测食物中毒中的病原菌。与GB培养法相比明显缩短检测周期,报告检验结果及时率提高,达到快速、及时的目的,在食物中毒事件中能更及时查明病因,对临床治疗、流行病学调查和食物中毒处置发挥积极作用。     

斑点热群立克次体实时荧光定量PCR检测方法的 建立及应用

摘要:目的　探讨实时荧光定量PCR快速检测斑点热群立克次体标本的应用价值。方法　根据斑点热群立克次体外膜蛋白A（OmpA）基因保守序列设计TaqMan特异性探针和引物,进行实时荧光定量PCR方法学评估,并同时运用该法和普通PCR法对对海南省2012年不明原因发热病人157份血标本进行斑点热群立克次体的检测及结果分析。结果　本研究建立的定量标准曲线循环阈值（Ct值）和模板拷贝数呈良好的线性关系（R2值为0.998）。该法能检出斑点热群立克次体阳性标准品—西伯利亚立克次体（R.sibirica）最小浓度为102 copies/μl,灵敏度比普通PCR高100倍。用该法检测斑点热群立克次体DNA,结果为阳性,检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、致泻性大肠埃希菌和副溶血弧菌等其他病原细菌DNA结果均为阴性。采用实时荧光定量PCR法对实验室库存的发热病人血标本DNA进行回顾性检测,结果示阳性2例,检出率为1.2%（2/157）,而普通PCR检测结果均为阴性。结论　实时荧光定量PCR法具有快速、特异和灵敏的优点,在处理突发公共卫生事件中可发挥快速检测的优势,在斑点热诊断中具有重要的临床意义。     

实时荧光PCR用于流感病毒检测的效果分析

目的探讨和研究实时荧光逆转录聚合酶链式反应在流感病毒检测中的应用效果。方法采用实时荧光PCR对617例流感样病例患者的咽拭子标本进行流感病毒核酸的测定,对检测出的阳性标本采用MDCK进行培养并分离,对两种方法的检测结果进行分析,对比特异性及灵敏度。结果本组617例标本中实时荧光PCR共检测出阳性标本152例,阳性率24.6%;细胞培养法在此152例阳性标本中共分离出流感病毒79例,阳性率12.8%,实时荧光PCR检测阳性率显著高于细胞培养法,差异具有统计学意义(P0.05)。结论实时荧光PCR能够快速有效的检测出流感病毒核酸,是实验室快速诊断的有效手段。     

2种核酸扩增荧光方法用于临床痰标本的结核分枝杆菌检测

目的 评价核酸恒温扩增实时荧光法与荧光定量PCR法检测临床痰标本结核分枝杆菌的效果.方法 收集疑似结核病患者的痰标本,分别进行痰标本染色显微镜检查、分离培养菌株鉴定、核酸恒温扩增实时荧光法及荧光定量PCR检测,以培养为金标准获得2种方法的灵敏度和特异性,并比较2种方法的检测效能.结果 收集322例疑似结核病患者样本,经...     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单增李斯特菌的比较

目的：比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法及细菌培养法检测单核细胞增生性李斯特菌的灵敏度与特异性。方法：采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR及传统细菌培养法3种方法,同时对单核细胞增生性李斯特菌等细菌进行检测。结果：实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19 cfu/ml,且有很高的特异性,对英诺克李斯特菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论：实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。