从恶性胸腔积液体外诱导成熟树突细胞

背景与目的:树突细胞(dendriticcells,DCs)具有激活初始T细胞、引发抗原特异性免疫反应的特性。本研究拟用体外培养的方法,从肺癌患者恶性胸腔积液中诱导出功能健全的DCs。方法:取16例肺癌患者胸腔积液500～1000ml,用密度梯度离心辅以免疫磁珠分选的方法,分离出DCs前体细胞,加入IL鄄4、GM鄄CSF、TNF鄄α诱导出DCs。用电镜和光镜观察培养的DCs,用流式细胞仪检测DCs的表面分子。将不同培养时间的DCs和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumorinfiltrativelymphocytes,TILs)作混合淋巴细胞反应,了解DCs对TILs的激活作用。结果:在体外能诱导出恶性胸腔积液来源的功能健全的DCs,电镜和光镜分析表明,这类DCs具有成熟DCs的典型形态;当DCs体外培养到第48h时,表面分子的表达率与培养0h、24h、92h、192h的DCs比较相对较高;DCs可使TILs细胞扩增。结论:可从肺癌患者恶性胸腔积液中诱导具有成熟功能的DCs。     

恶性胸腔积液来源树突状细胞的纯化培养研究

[目的]建立体外恶性胸腔积液来源树突状细胞(DCs)的纯化方法,观察DCs的形态学.[方法]从肺癌患者胸腔积液中分离、纯化出DCs前体细胞,加入IL-4、GM-CSF、TNF-α诱导出DCs.用电镜和光镜观察培养的DCs,并用流式细胞仪检测DCs的表面分子.[结果]在体外诱导出恶性胸腔积液来源的功能健全的成熟DCs,电镜和光镜分析表明具有DCs的典型形态;高表达HLA-ABC、HLA-DR、CD86,较高表达CD80、CD54,也表达CD83,CD-la;当DCs体外培养到第48h时,表面分子的表达率相对较高.『结论]肺癌患者恶性胸腔积液来源的DCs经过纯化及48h的培养后,不仅在形态上成熟,而且高表达特异性表面分子.     

人脐血来源的树突状细胞的体外培养扩增

目的　研究人脐血来源的树突状细胞 (DCs)体外培养扩增 ,并检测其功能。方法　应用Ficoll Hypaque离心获得界面细胞 ,贴壁培养 2h ,获得单个核细胞 ,体外以重组hGM CSF( 5 0ng/ml) hIL 4( 10ng/ml) hTNF α( 5 0ng/ml)诱导培养 14天。在DCs发育过程中 ,在光镜下观察其生长情况 ,应用流式细胞仪检测DCs表型。采用MTT法检测DCs活化的T细胞对肿瘤细胞的杀伤性。结果　第 6天体外培养的DCs由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞 ,随着培养时间的延长 ,此类细胞数量增多 ,第 12天为形态不规则的毛刺状 ,为典型树突状细胞形态。流式细胞仪检测表明 ,成熟DCs高水平地表达HLA DR、CD 80、CD83、CD 1a、CD 11c、CD12 3。被激活的T细胞对 2种来源于不同组织的肿瘤细胞均产生了明显的杀伤性。结论　人脐血经rhGM CSF rhIL 4 hTNF α体外诱导培养 ,能诱导出DCs。     

恶性胸腔积液来源树突状细胞对自体肿瘤 浸润性淋巴细胞的作用

 目的探讨恶性胸腔积液来源DCs（dentritic cells,DCs）对自体肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltration lymphocytes, TILs）增殖及杀伤肿瘤细胞能力的影响。方法用体外培养方法从16例肺癌患 者恶性胸腔积液来源分离单个核细胞,再用密度梯度离心辅以免疫磁珠分选细胞,用白细胞介素4（IL-4 ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、粒-单核细胞刺激因子（GM-CSF）等诱导出DCs,用流式细胞仪和电子 显微镜鉴定分离DCs;用IL-2、植物血凝素诱导同一患者胸腔积液单个核细胞中的TILs,用HEA-125磁珠分 选纯化肿瘤细胞,3H-TdR渗入法检测DCs对TILs增殖能力;MTT法检测TILs对肿瘤细胞杀伤活性。结果从肺 癌患者恶性胸腔积液单个核细胞中可诱导成熟DCs,电镜和光镜观察结果显示,这类DCs具有典型的DC形态 ,高表达HLA-ABC、HLA-DR、CD86,较高表达CD80、CD54,也表达CD83、CD1a。DCs可明显促进TILs增殖能 力（增加约1.7倍）。以TILs本身为对照,DCs激活的TILs对肿瘤细胞杀伤活性明显增加［从（31.80± 14.05）%提高到（51.89±13.27）%,P<0.05］。结论肺癌患者恶性胸腔积液单个核细胞中可诱导成熟DCs ,这种DCs可刺激自体TILs扩增,增加TILs杀伤肿瘤细胞的活性。     

恶性胸腔积液来源的树突状细胞IFN-γ、IL-10的表达

目的检测恶性胸腔积液来源树突状细胞(DCs)及其培养上清中干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-10(IL-10)的表达,评估对淋巴细胞的影响。方法收集15例肺癌患者的恶性胸腔积液,密度梯度离心后贴壁获取DCs前体,以粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导培养DCs,流式细胞仪分析表型,ELISA法检测DCs培养上清中IL-10和IFN-γ的浓度。结果体外诱导培养后获得了典型形态的DCs,高表达CD83、HLA-DR和CD1a,成熟DCs上清中IFN-γ浓度明显增高,而IL-10浓度显著降低。结论恶性胸腔积液来源的DCs可能促进Th1反应。     

CIK的体外增殖及体内外杀瘤活性的实验研究

目的:从人骨髓造血前体细胞体外培养扩增树突状细胞(dendritic cells,DCs),测定其表型及T细胞刺激活性.方法:采用Mini-MACS分离技术,从正常人骨髓、脐血分离CD34~ 造血干细胞,体外以重组hGM-CSF,hTNF-α,hIL-3诱导培养2周,流式细胞术检测扩增细胞的表面表型及细胞内IL-12的表达,体外同种混合淋巴细胞反应检测扩增DCs的T细胞刺激活性.结果:从正常人骨髓、脐血分离得到高纯度(>90%)的CD34~ 造血干细胞,经重组hGM-CSF,hTNF-α的共同诱导培养,扩增得到大量DCs,加人hIL-3可以进一步增加DCs产量;FACS检测表明,扩增的DCs表达HLA-DR,CD40,CD54,CD80,CD86分子,细胞内有hIL-12的P35,P40亚基的表达;与外周血单核细胞培养生成的DCs相比,由CD34~ 干细胞扩增的DCs具有更强的激发同种T细胞增殖的能力.结论:人CD34~ 干细胞体外经诱导培养,可以生成大量功能成熟的DCs,从而为进一步开展DCs的基础及临床研究打下了基础.     

脐血来源树突状细胞的体外扩增、鉴定及冻存

目的研究脐血来源树突状细胞（DCs）的体外扩增、鉴定和冻存。方法用Ficoll分离获得脐血单个核细胞，以重组hGM—CSF、hIL-4及hTNF-α体外诱导培养14d。在DCs发育过程中，在光镜和电镜下观察其生长情况，应用流式细胞仪检测DCs表型。采用台盼蓝拒染法测定DCs增殖水平，MTT法检测DCs活化的T细胞对肿瘤细胞的杀伤性。同时用二甲亚砜作为保护剂，DCs经过-20℃和-80℃降温，在-196℃液氮保存，然后40℃水浴复苏。结果第6天体外培养的DCs由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞，随着培养时间的延长，此类细胞数量增多，第14天为形态不规则的毛刺状，为典型树突状细胞形态。流式细胞仪检测表明，成熟DCs高水平地表达HLA—DR、CD80、CD83、CD1a、CD11c。被激活的T细胞对2种来源于不同组织的肿瘤细胞均产生了明显的杀伤性。冻存DCs和新鲜DCs的生物活性无明显差异。结论脐血单个核细胞细胞经hGM—CSF＋hIL-4＋hTNF—α体外培养，能诱导出DCs，为进一步开展DCs的实验研究与临床应用奠定了基础。     

淫羊藿苷促进脐血来源树突状细胞的分化与成熟

目的：研究淫羊藿苷（icariin,ICA）体外对脐血单个核细胞来源树突状细胞的分化、成熟及免疫活性的影响。方法：无菌条件下采集脐血,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,用GMCSF、IL4诱导树突状细胞（dendritic cells, DCs）,第5天后将DCs分为3组（ICA组、TNFα组和阴性对照组）并作相应处理。倒置显微镜和透射电镜下观察DCs形态,流式细胞术检测DCs表面分子CD1a、CD80、CD83和CD86的表达情况,ELISA法检测DCs培养上清中IL12和IFNγ的水平,MTT法检测DCs刺激T细胞增殖的能力。结果：ICA刺激后,脐血单个核细胞来源DCs呈现典型的成熟DCs形态学特征。ICA组DCs表面CD1a、CD80、CD83和CD86表达水平较对照组均明显上调（P<0.05）,且CD86的表达水平显著高于TNFα组（P<0.05）。ICA组DCs上清中IL12、IFNγ的水平及诱导T细胞增殖的能力较对照组DCs明显增高（P<0.05）,但与TNFα组DCs无显著差异。结论：ICA可刺激脐血单个核细胞来源DCs的分化和成熟,增强DCs的免疫学活性。     

肺癌胸腔积液树突状细胞培养与鉴别及其抗肿瘤作用的观察

目的:证实肺癌胸腔积液中存在树突状细胞(DCs)的前体细胞,体外培养可以获得成熟的DCs,并探讨DCs对自体癌细胞的杀伤作用.方法:通过Ficoll淋巴细胞分离液对15例肺癌患者的恶性胸腔积液进行密度梯度离心,以两步贴壁法分别获得DCs的前体细胞和自体癌细胞.前者加入粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(rhIL-4)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)培养.显微镜观察细胞形态,流式细胞仪鉴定DCs表型.MTT法检测DCs对自体癌细胞的杀伤作用.结果:体外培养9d后获得大量成熟的DCs,具有典型树突状形态,且高表达HLA-DR[(84.2±6.3)％]、CD80[(75.8±8.8)％]、CD83[(58.0±9.4)％]和CD86[(83.3±7.5)％];MTT法结果显示,DCs对自体癌细胞有较强的杀伤作用,当效靶比为20∶1时杀伤率为(50.62±7.51)％.结论:肺癌恶性胸腔积液中的DCs前体细胞经诱导培养后可转化为功能健全的成熟DCs,成熟的DCs对自体癌细胞有直接杀伤作用,为恶性胸腔积液的免疫治疗提供理论依据.     

脐血CIK细胞的体外增生及其抗肿瘤效应

 【摘要】　目的　研究脐血CIK细胞体外增生活性及对肿瘤细胞的杀伤活性，为CIK细胞在肿瘤过继免疫治疗中的应用提供实验依据。方法　脐血经密度梯度离心获得单个核细胞，以CD3单抗、重组人白细胞介素-2（rhIL-2）、重组人白细胞介素-1（rhIL-1）和重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）为诱导剂制备多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）。并设只加IL-2诱导成的LAK细胞和未加细胞因子的脐血单个核细胞（CBMNC）作为对照。培养前后分别用显微镜观察细胞形态，流式细胞术测定细胞表型的改变，锥虫蓝拒染法测定细胞增生水平，四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定对肺癌细胞的杀伤活性。结果　实验发现，通过细胞因子的联合，可大量诱导出高活性的CIK细胞，CIK细胞在培养的第5天开始增生，第14天达到高峰，增生的细胞表型以CD+3 CD+56细胞为主。而LAK细胞的增生高峰出现在第7天，随后增生不明显；CBMNC表型无明显变化，增生不明显。CIK细胞针对肿瘤细胞的体外杀伤活性高于LAK细胞和CBMNC。结论　在体外细胞因子的联合作用下脐血能成功地诱导出大量的CIK细胞。脐血CIK细胞体外扩增快，杀伤活性强，对肿瘤细胞的作用优于传统的LAK细胞，为肿瘤的过继性免疫治疗提供了一个新的方向。