大肠杆菌poly(A)化mRNA cDNA文库的构建与鉴定

目的构建和鉴定大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库。方法应用限制性显示PCR技术构建大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库,筛选、收集cDNA片段,并进行测序。根据测序结果进行初步的生物信息学分析和结果验证。结果构建了大肠杆菌poly(A)化mRNA的限制性cDNA文库,并对其中66个基因片段进行了分析。结论所构建的大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库片段重复性低,质量高。     

人肝脏高凝状态相关基因的筛选

目的 筛选人肝脏高凝状态（PTS）相关基因的全长cDNA序列。方法 采用差异筛选法对本室建立的PTS大鼠肝脏差异表达基因消减cDNA文库进行筛选；以获得的差异cDNA克隆为模板，采用PCR方法扩增目的片段；以PCR产物作探针，用噬菌斑原位杂交法筛选人肝脏cDNA文库，经初筛、二筛和三筛后，将获得的阳性克隆转入E．coli BM 25．8，使λTripIEx环化成质粒pTripIEx，经酶切鉴定后进行DNA测序。结果 从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条全长cDNA序列，经序列测定及生物信息学分析发现，其中3条的表达产物分别为纤维蛋白原、纤维蛋白原相关蛋白、10号染色体开放阅读框架104mRNA；另1条与氨基甲酰磷酸合成酶1同源。结论 以PTS大鼠肝脏差异表达基因cDNA为探针，从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条PTS相关cDNA全长序列。     

二烯丙基二硫诱导HT-29细胞差异表达cDNA文库的构建

目的:构建二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人结肠癌HT-29细胞差异表达cDNA文库,以期寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因。方法:用120μmol/L的DADS处理人结肠癌HT-29细胞,从DADS处理组及对照组HT-29细胞中提取poly A+RNA,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交(SSH)技术构建DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA消减文库,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果:成功构建具有高消减效率的DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,文库扩增得到了500个克隆,随机挑取100个制备质粒,酶切分析均得到150~1 300 bp大小插入片段,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段。结论:建立了DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,为进一步寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因奠定了基础。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库的构建与初筛

目的构建高凝状态(prothrom botic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库并进行初步筛选。方法从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取po ly A mRNA,分别以po ly A mRNA为模板,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成400~600 bp大小的片段。以PTS大鼠cDNA作为T ester,对照大鼠cDNA为D river,进行抑制性消减杂交。将消减杂交第二次PCR产物cDNA克隆至pM D 18-T载体上,然后转化细菌,获得PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。用巢式PCR扩增法制备“正向”和“反向”消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与G enB ank DNA数据库中的DNA序列进行同源性分析。结果成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库,初步筛选发现两条PTS差异表达cDNA片段。结论成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。     

恒河猴(Macaca mulatta)肝脏cDNA文库的构建

目的 构建正常恒河猴的肝脏组织cDNA表达文库,以筛选恒河猴的相关基因并提供其作为医学研究动物模型的遗传学依据.方法 提取正常恒河猴肝脏组织总RNA,纯化的mRNA反转录合成cDNA,连接EcoR Ⅰ接头,经XhoⅠ酶切并用CHROMA SPIN-400分离cDNA,将大于500 bp的cDNA片段连接于λ ZAP表达载体,体外包装后转染至XL1-Blue MRF'宿主菌中,再扩增文库.对cDNA文库的滴度、重组率和插入片段的大小进行检测.结果 初始文库的库容量为1.2×106 pfu,初始文库和扩增文库的滴度分别为1.1×106 pfu/mL、 7.7×109 pfu/mL,重组率分别为99.3%、98.2%,插入片段平均长度分别为2.0 kb、2.3 kb.结论 成功构建了恒河猴肝脏组织的cDNA表达文库,为同种和异种移植以及移植相关药物临床前研究奠定了良好的基础.     

Construction and Significance of Directional Expression cDNA Library from Human NB4 Cells

Acutepromyeloidleukemia (APL)characterizedbythetranslocationt(15 ;17)isuniquelysensitivetothedifferentiation inducingeffectsofall trans retinoicacid (ATRA) .ATRAinducescompleteclinicalre missionsinmostofthepatientswithAPL .However ,chronicdailyoraladminis…     

CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的:对人CGGBP1蛋白进行原核表达及纯化,为进一步研究CGGBP1的生物功能奠定基础.方法:构建原核表达载体pRSET A/CGGBP1.在大肠杆菌BL21中诱导表达人CGGBP1蛋白,经Ni2 -NTA亲和层析纯化,利用链酶亲和素磁珠鉴定所表达纯化的蛋白能否和d(CGG)29重复序列双链DNA特异性结合.结果:诱导后表达得到CGGBP1蛋白,纯化得到的可溶性表达产物CGGBP1蛋白可以和d(CGG)29重复序列双链DNA特异性结合.结论:表达并纯化得到可溶性CGGBP1蛋白,为进一步研究CGGBP1的结构与功能奠定了必要的基础.     

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达，为进一步的研究该基因的功能奠定基础。方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列，构建重组原核表达载体pGEX／MDEF，转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段，经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列，它编码含40个氨基酸的蛋白质，预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cDNA，在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。结论 成功构建了家蝇幼虫defensin基因原核表达载体，且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化，以及研究其生物活性提供了材料。     

Construction and expression of the fusion vector of His-tagged human ARPC2 gene]

OBJECTIVE: To construct the expression vector of His-ARPC2 fusion protein and obtain its expression and purification in E. coli. METHODS: ARPC2 cDNA codon region was amplified by PCR from human liver cDNA library and cloned into pET-14b vector following the routine procedures. After identification by enzyme digestion, PCR and sequencing, the positive clones were transformed into BL21 (DE3) competent cells, and the expression of His-ARPC2 fusion protein was induced with IPTG and further purified by Ni-NTA affinity chromatography. RESULTS: The constructed His-ARPC2 fusion protein vector was highly efficiently expressed in E. coli. With Ni-NTA affinity chromatography, a purified His fusion protein with relative molecular mass of approximately 36 000 was obtained. CONCLUSION: The expression vector of His-ARPC2 fusion protein is constructed, expressed and purified under non-denaturing conditions, which may significantly facilitate future study of the physiological functions of ARPC2 and characterization of its interaction proteins.     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的 :采用消减抑制杂交技术 ,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况 ,分离食管癌相关基因片段 ,构建食管癌的消减cDNA文库。方法 :以食管癌癌组织为测试子 (tester) ,以正常食管粘膜组织为驱赶子 (driver) ,用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体 ,经蓝白斑筛选后 ,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒 ,构建食管癌消减cDNA文库。结果 :用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段 ,经蓝白斑筛选 ,得到 2 2 0个白色克隆 ;再用PCR方法快速筛选出 10 0个两端分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R的阳性重组质粒 10 0个 ,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论 :构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因 ,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆 ,对于消减文库的构建具有重要意义     

应用抑制性消减杂交技术筛选脂肪细胞分化相关基因

目的:利用脂肪分化细胞模型筛选与脂肪细胞分化相关的差异性表达基因。方法:采用抑制性消减杂交技术,以诱导分化后的人前体脂肪细胞系SW872总RNA为Tester,诱导分化前的人前体脂肪细胞系SW872为Driver,将消减杂交获得的DNA片段与pGM-T载体连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,并与GenBank数据库进行同源性分析,获得差异性表达基因。结果:扩增消减cDNA文库获得135个白色克隆,随机挑选64个进行测序,共获得34个阳性克隆基因。结论:本研究成功构建了脂肪细胞分化差异性表达基因的消减cDNA文库,筛选出了与脂肪细胞分化相关的差异表达基因。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的克隆、表达及重新折叠

目的 :人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF relatedapoptosisinducingligand ,TRAIL)基因经扩增后 ,克隆在大肠杆菌中表达并重新折叠并获得有活性的TRAIL蛋白。方法 :用PCR的方法从人胎盘cDNA文库中扩增TRAIL基因 ,经序列分析鉴定 ,再克隆到原核表达载体 pET11a ,经E .coliBL2 1(DE3)表达 ,电泳鉴定后 ,柱层析纯化 ,重新折叠 ,流式细胞术等方法检测其促凋亡活性。结果 :得到了TRAIL基因 ,并构建了可在大肠杆菌中表达的载体 pET11 TRAIL1(含TRAILcDNA序列 418 933)及可在真核细胞中表达的载体pLNCX TRAIL2 (含TRAILcDNA序列 88 933)。取前者在E .coliBL2 1(DE3)中表达 ,经纯化 ,重新折叠得到了复性的TRAIL蛋白。检测其对人白血病细胞株Jurkat有诱导凋亡的作用。结论 :从人胎盘cDNA文库中扩增TRAIL基因 ,在大肠杆菌中表达、重新折叠、纯化后 ,经检测得到了有活性的TRAIL蛋白     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6的反式调节基因研究

目的：筛选、克隆新基因HCBP6转染肝癌细胞后的反式调节基因，探索HCBP6基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法：应用酵母双杂交技术和生物信息学(bioinfonnatics)技术，筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的基因。构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3．1(-)-HCBP6，应用抑制性消减杂交技术对重组表达质粒pcDNA3．1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究，将富集的二次PCR产物与T／A载体连接，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果：消减文库扩增后得到30个阳性克隆，菌落PCR分析显示，其中24个克隆含有200—1000bp插入片段。对插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得11种蛋白编码基因。结论：应用SSH技术成功筛选了HCBP6对肝癌细胞的反式调节基因，本实验结果对初步探索新基因的功能提供重要的信息，为进一步阐明HCV核心蛋白与HCBP6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据。     

GST-hCAP融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的人c-Cbl相关蛋白(GST-hCAP)融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达.方法:从COS-1细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hCAP基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-hCAP,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-hCAP构建成功,用Western blot方法也证实了GST-hCAP融合蛋白的表达.结论:成功地构建了GST-hCAP原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化CAP及研究其结构与功能提供了前提基础.     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

骨肉瘤cDNA文库的构建和筛选

目的 研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在骨肉瘤发生、发展中的作用,构建SAOS-2细胞cDNA文库,寻找与BMP-2相关作用蛋白.方法 从骨肉瘤细胞系SAOS-2中提取总RNA,进而分离poly(A) RNA,用poly(A) RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组.通过文库片段,线形化的pGADT7-Rec和诱饵质粒pGBKT7/HA-BMP-2共转化酵母AH109菌株在文库构建的同时进行与BMP-2相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线形化的pGADT7-Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选.最后用Far-Western blotting法进一步从体外论证BMP-2相互作用蛋白.结果 构建了具有基因多样性和库容量足够大的骨肉瘤cDNA文库,双链cDNA片段的长度大小范围为250～5000 bp.共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105.接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106.筛选到四个与BMP-2相互作用的阳性克隆.结论 此文库的多样性和库容量均符合筛选需求.可用于骨肉瘤相关基因的进一步筛选.