印迹抑癌基因ARHI在浆液性卵巢癌中的表达及甲基化研究

目的研究浆液性卵巢癌组织中印迹抑癌基因ARHI mRNA的表达及其3个CpG岛的甲基化状态,以探讨ARHI基因及其甲基化修饰在卵巢上皮癌发生机制中的作用。方法正常卵巢及浆液性卵巢癌标本各20例,采用半定量RT-PCR方法检测ARHI mRNA表达,采用DNA亚硫酸盐修饰、PCR扩增及甲基化敏感性内切酶方法检测ARHI基因3个CpG岛的甲基化状态。结果ARHI/G3PDH在正常卵巢组织中为0.73±0.09,浆液性卵巢癌中为0.43±0.37(P<0.01)。正常卵巢组织的3个CpG岛均同时扩增出ARHI甲基化和非甲基化产物,呈正常半甲基化状态;浆液性卵巢癌的3个CpG岛则存在不同比例的甲基化异常,其中6例(30%)CpGⅠ、8例(40%)CpGⅡ、5例(25%)CpGⅢ处于高度甲基化状态。在浆液性卵巢癌组织中,8例ARHI基因表达缺失者均存在CpG岛的高度甲基化,其余12例中有5例存在CpG岛的高度甲基化,表达缺失者中CpG岛的高度甲基化率显著增高(P<0.01)。结论印迹抑癌基因ARHI启动子及编码区的3个CpG岛在浆液性卵巢癌组织中存在甲基化异常,并抑制了该基因的表达。     

胃癌中TIMP3基因的甲基化与表达间的相关性分析

目的探讨转移抑制基因TIMP3(金属组织蛋白酶抑制因子-3)在胃癌和胃癌细胞系中启动子甲基化及其蛋白和mRNA表达的特点,并分析两者之间的关联。方法应用MSP法检测TIMP3基因启动子区的甲基化状态;RT-PCR和免疫组织/细胞化学法检测TIMP3基因mRNA和蛋白的表达;观察DNA去甲基化剂(5-aza-2’-deoxycitydine)对人胃癌细胞系(MGC803和HGC-27)细胞系TIMP3基因表达的影响。结果TIMP3基因于胃癌组织中的甲基化频率为17/33(51.5%);四个胃癌细胞系均存在TIMP3基因的甲基化,而MGC803、BGC823和HGC-27仍有该基因的表达或低水平表达;在去甲基化剂的作用下TIMP3基因的表达水平明显上调。结论TIMP3的异常甲基化是其表达下调或沉默的主要原因并存在部分甲基化的倾向。该指标可作为胃癌的敏感性表观遗传学标记物在胃癌的筛查和诊断中应用。     

ASPP1基因启动子CpG岛甲基化检测方法的实验初探

目的：建立ASPP1甲基化状况的检测方法,研究ASPP1基因启动子在HEPG-2肝癌细胞株和成纤维细胞株中的甲基化状况。方法：利用因特网对ASPP1基因启动子的CpG岛进行分析,并设计MSP引物,然后对正常的成纤维细胞和p53野生型肿瘤细胞株HEPG-2的ASPP1 DNA启动子甲基化状况进行检测。结果：MSP分析显示,在正常的成纤维细胞中,ASPP1基因启动子CpG岛未出现甲基化;在p53野生型肿瘤细胞株HEPG-2中,ASPP1基因启动子CpG岛处于甲基化状态。结论：MSP检测ASPP1启动子CpG岛甲基化状况的方法客观、准确、可靠。     

肺癌患者CDH13基因启动子甲基化状态研究

目的应用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测非小细胞肺癌（NSCLC）CDH13基因启动子甲基化情况。方法留取44例非小细胞肺癌患者手术标本及12例非肺癌患者正常肺组织,MSP分析CDH13基因启动子甲基化情况。结果 44例非小细胞肺癌中CDH13基因启动子甲基化阳性率为54.5%（24/44）,12例正常肺组织中未检测到此基因的甲基化（0/12）。CDH13基因甲基化与患者性别及吸烟与否无关;肿瘤分期越晚甲基化的发生率越高。结论原发性非小细胞肺癌中存在着较高比例的CDH13启动子甲基化,提示CDH13在非小细胞肺癌的发生中起着重要作用。     

TERC 基因在肺鳞状细胞癌中的表达

目的：探讨端粒酶 RNA （TERC） 基因在肺鳞状细胞癌组织中的表达.方法：RT-PCR 法检测 TERC 基因水平的表达情况.结果：肺鳞状细胞癌组织中 TERC 基因的表达高于癌旁正常组织.结论：TERC 基因在肺鳞状细胞癌组织中表达上调,表明其可能参与了肺癌的发生发展,为恶性肿瘤的早期诊断和治疗提供理论支持.     

The Expression of TERC Gene in the Spuamous Cell Carcinoma

目的:探讨端粒酶 RNA (TERC) 基因在肺鳞状细胞癌组织中的表达.方法:RT-PCR 法检测 TERC 基因水平的表达情况.结果:肺鳞状细胞癌组织中 TERC 基因的表达高于癌旁正常组织.结论:TERC 基因在肺鳞状细胞癌组织中表达上调,表明其可能参与了肺癌的发生发展,为恶性肿瘤的早期诊断和治疗提供理论支持.     

MDR1甲基化对宫颈癌介入栓塞化疗疗效的影响

目的多重耐药（drug resistance，MDR）是肿瘤化疗失败的主要原因。本研究旨在探讨MDR1甲基化对宫颈癌经皮子宫动脉血管腔内化疗栓塞疗效的影响。 方法选择67例宫颈癌患者接受栓塞化疗，45例正常宫颈组织作为对照。免疫组化检测宫颈癌中P-糖蛋白（P-gp）水平，并与正常组织进行比较。通过使用特异性千碱基裂解法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法分析MDR1基因启动子区16个CpG岛的甲基化状态。 结果P-gp在正常宫颈组织中的阳性表达率为0％ （0/45），介入栓塞化疗前后的阳性表达率分别为61.19％（41/67）和77.61％（52/67）。宫颈癌组织与正常宫颈组织相比有明显差异（χ²=4.2523，0.0392）。化疗前P-gp的阳性表达率与化疗疗效呈负相关（r=-0.340，P=0.005）。正常组织中13个CpG岛的甲基化率显著高于宫颈组织（P<0.05）。在宫颈癌组织中，经皮子宫动脉血管腔内化疗栓塞前6个CpG岛的甲基化率高于化疗后，但1个CpG岛的甲基化率低于化疗后（P<0.05）。化疗前有效化疗的1个CpG岛甲基化率明显高于无效化疗（P<0.05），其他CpG岛相似（P<0.05）。 结论MDR1编码的P-gp表达水平，部分MDR1基因启动子区CpG岛的甲基化状态，与宫颈癌介入栓塞化疗的疗效密切相关。     

5-脱氧杂氮胞苷调控p16基因表达对人宫颈癌HeLa细胞增殖及调亡的影响

目的:探讨甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza-CdR)对人宫颈癌HeLa细胞增殖和调亡的作用及其可能机制。方法:应用不同浓度的5-Aza-CdR处理HeLa细胞,甲基化特异PCR(MSP)法检测处理前后p16基因甲基化状态,应用RT-PCR方法检测p16基因mRNA表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:人宫颈癌HeLa细胞p16基因启动子区呈高甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,p16基因启动子区呈去甲基化状态,其mRNA重新表达,细胞生长受到抑制,细胞凋亡增加。结论:5-Aza-CdR能够逆转p16基因甲基化状态,调控p16基因表达,并有效抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖和诱导细胞调亡。     

高同型半胱氨酸血症致血管平滑肌细胞增殖的机制初探

 目的 探讨高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, HHcy)致血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖在动脉粥样硬化发病中的机制.方法 整体水平实验:82例研究对象分为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)组54例,对照组28例.荧光生化法检测血浆总同型半胱氨酸(total homocysteine, tHcy)水平,甲基化特异的 PCR(Methy-specific PCR,MSP)法检测雌激素受体α(estrogen receptor-α ,ER-α)启动子区CpG岛的甲基化状态.细胞水平实验:体外培养的人脐动脉VSMC,用不同浓度同型半胱氨酸(homocy steioe, Hcy)处理,MTT法观察Hcy对平滑肌细胞生长的影响,MS-PCR法和Rt-PCR法检测ER-α基因启动子区甲基化程度及mRNA的表达.结果 整体水平实验中,AS患者中甲基化率为70.4%,对照组甲基化率为28.6%,差异具有统计学意义(P<0.05).细胞水平实验中,MTT结果显示Hcy对VSMC具有明显促增殖效应.Hcy显著增加ER-α基因启动区的甲基化修饰,并使ER-αmRNA的表达进行性减少.结论 Hcy通过干扰DNA的甲基化修饰,使ER-а基因高甲基化可能是高同型半胱氨酸血症促使VSMC增殖,并引起动脉粥样硬化的重要机制.     

非小细胞肺癌MAGE—3基因的表达

为探讨以MAGE 3基因编码的肿瘤抗原作为靶点对非小细胞肺癌 (NSCLC)患者进行免疫治疗的可能性 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测 3种人肺癌细胞系和 5 6例NSCLC标本及相邻正常肺组织标本MAGE 3mRNA的表达。结果显示 ,3种人肺癌细胞系均表达MAGE 3mRNA ;5 6例NSCLC标本中 ,30例表达MAGE 3mRNA ,其中鳞状细胞癌的表达率明显高于腺癌的表达率 (P <0 .0 1) ,而相邻正常肺组织均不表达MAGE 3mRNA。MAGE 3mRNA在NSCLC中呈高比例表达 ,提示该基因编码的肿瘤抗原可以作为对NSCLC患者进行免疫治疗的攻击靶点。     

P27基因甲基化在鼻咽癌发生发展中的作用

目的探讨P27基因甲基化在鼻咽癌发生发展中的作用。方法运用甲基化特异性PCR技术对5个鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2、TWO3、HNE1、HONE1)和1个正常鼻咽上皮细胞株(NP69),54例鼻咽癌组织和20例正常鼻咽上皮组织的P27基因启动子区甲基化状态进行检测。半定量反转录PCR法检测加入甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine)后CNE1和CNE2中P27基因转录表达的变化,分析鼻咽癌组织中P27基因甲基化与临床因素的关系以及去甲基化对P27基因转录表达的影响。结果正常鼻咽上皮细胞株NP69及20例正常鼻咽上皮组织中均未检测到P27基因甲基化;5个鼻咽癌细胞株中P27基因甲基化频率为80%(4/5),54例鼻咽癌组织中P27基因甲基化频率为63%(34/54),二者与正常鼻咽上皮细胞株及正常鼻咽上皮组织比较差异均有统计学意义(P<0.01),进一步分析发现P27基因甲基化状态与患者年龄、性别、T分期、N分期、TNM分期、病理类型等临床因素均无相关性(P>0.05),经5-氮-2-脱氧胞苷处理后CNE1和CNE2中P27基因的转录表达增加。结论P27基因甲基化与...     

Methylation analysis of circadian clock gene promoters in forensic autopsy specimens

DNA methylation in gene promoter regions influences gene expression. Circadian clock genes play an important role in the formation of a biological clock and aberrant methylation of these genes contributes to several disorders. In this study, we examined forensic autopsy specimens to determine whether DNA methylation status in the promoter regions of nine circadian clock genes (Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2, Bmal1, Clock, Tim, and Ck1e) is related to a change in acquired diathesis and/or causes of death. Methylation-specific PCR and direct sequencing methods revealed that the promoters of Per1, Cry2, Bmal1, Clock, and Ck1e were unmethylated in all the forensic autopsy specimens, while the promoters of Per2, Per3, Cry1, and Tim were partially methylated. Methylation status varied between individuals and between tissues in the same patient. A detailed analysis of methylation patterns in the Cry1 promoter region revealed that the patterns also varied between individuals and the Cry1 promoter had highly methylated patterns in two cases that had been exposed to methamphetamine. These results suggest that the methylation status of clock gene promoters varies between individuals. Methamphetamine use may influence methylation in the Cry1 gene promoter region and disturb circadian rhythmicity.     

被动吸烟所致小鼠肺癌中Angiopoietin-3基因过表达及其意义的初步探讨

目的 初步寻找新的与肺癌相关的基因,为全面揭开肺癌发病机制、进一步诊断和治疗肺癌提供依据.方法 （1）通过基因表达芯片筛选被动吸烟致小鼠肺癌中异常表达的基因;（2）荧光实时定量PCR验证部分基因芯片结果;（3）应用western blotting分析方法检测小鼠肺组织中Angiopoietin-3（Ang-3）基因的蛋白表达量变化.结果 实时荧光定量PCR结果显示Ang-3基因的mRNA相对表达量在肺癌组（30.6544±15.2245）明显高于在正常对照组（1.0469±0.3441,P〈0.05）.Western blotting结果进一步表明吸烟导致Ang-3基因蛋白高表达（1.2724±0.1493）,尤其是在肺癌组织中（1.5901±0.1189）明显高于正常肺组织中（0.9054±0.0523）,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 Ang-3基因在被动吸烟所致小鼠肺癌的发生、发展中发挥一定的作用.     

凋亡抑素启动子介导肿瘤特异性TRAIL在宫颈癌Hela细胞中的表达

目的:探讨凋亡抑素(survivin,SVV)启动子调控的TRAIL肿瘤细胞内特异表达在宫颈癌治疗中的应用意义。方法:提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR方法,用带有IL-2信号肽基因序列的引物扩增TRAIL基因,克隆入真核表达载体pGL-Basic/surp中SVV启动子的下游,构建肿瘤特异性分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL。转染宫颈癌Hela细胞及正常人肝细胞(7702),RT-PCR鉴定转染细胞中的TRAIL表达。结果:RT-PCR扩增得到了613bp的cDNA片断,pGL-Basic/surp/TRAIL经酶切及测序鉴定与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致;转染细胞RT-PCR鉴定结果显示,Hela细胞中可扩增出600bp基因片段,而7702细胞中未见该特异性扩增条带。结论:重组真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL能够高效、特异性地表达于Hela细胞中,其成功构建为特异性肿瘤基因治疗提供了可行的理想工具。     

肺腺癌多药耐药细胞株特异表达的新基因cDNA片段在肺癌组织中表达的研究

目的　检测人肺腺癌多药耐药细胞株特异表达的新基因cDNA片段在多种肺癌组织及其相应癌旁正常组织中的表达情况。方法　分别运用原位杂交技术和Northernblot方法检测该基因cDNA片段在肺癌组织中的表达及定位情况。结果　组织原位杂交和Northernblot的检测结果均显示 ,在 12例肺腺癌组织中有 6例表达阳性 (5 0 % ) ,在其他肺癌组织及其癌旁正常组织中无表达 ,差异有统计学意义 (P <0 0 5或P <0 0 1)。图像分析显示 ,该基因在肺腺癌组织的相对表达量显著高于其癌旁正常组织 (P <0 0 5 )。结论　新基因片段在部分肺腺癌组织有表达 ,可能与临床上部分肺腺癌化疗效果不佳及MDR的产生有关。