Mago nashi：—个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的运用免疫学方法筛选日本血吸虫(中国大陆株)童虫cDNA文库，寻找血吸虫新基因，并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Mago nashi样蛋白基因。方法用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫eDNA文库，随机挑取阳性重组克隆进行测序，以获得血吸虫基因，并通过BLAST程序进行比较及同源性分析，根据分析结果设计合成引物，用PCR法扩增出日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因(SiM)编码序列，将其克隆入pGEM—T载体和pBKCMV载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果本研究共挑取7个阳性克隆，通过测序获得了5个有表达序列标签(Expressed Sequenee Tag.EST)价值的序列，并进行了同源性分析；用PCR法扩增出大小为441bp SjM开放阅读框，重组质粒pGEM—SiM和pBKCMV-SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。结论本实验获得了5个有EST价值的序列，并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

日本血吸虫Mago nashi基因RNA干扰系统的构建及鉴定

目的构建针对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的RNA干扰的表达载体。方法设计及化学合成日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的短发夹结构的寡核苷酸,通过退火成双链DNA片段,将其与经限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切的pSUPER质粒连接,构建表达shRNA的重组质粒。结果经酶切及测序证实针对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的RNA干扰的表达载体pSUPER构建成功。结论成功构建针对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的RNA干扰的表达载体,为进一步研究对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因RNA干扰作用及该基因功能奠定基础。     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

目的　免疫法筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,S j) 15d肝期童虫cDNA表达文库 ,并进行鉴定 ,以获得S j疫苗候选抗原分子。方法　采用紫外线照射致弱尾蚴免疫的兔血清 ,对S j中国大陆株 15d肝期童虫cDNA文库进行免疫学筛选 ,选取部分阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列分析 ,将结果通过Internet送入NCBIGenBank进行同源性比较 ,并将发现的新基因送入GenBank登录。结果　对大约 10 4个噬菌斑进行了初筛 ,共获得 4 9个阳性克隆 ,复筛了其中的 12个克隆 ,获得 8个持续阳性反应克隆。对 6个克隆的核苷酸序列测定及同源性分析表明 ,2个为编码S j线粒体的基因 ,另外 4个为S j未知基因 ,新基因序列已被GenBank接受 ,并获得进入编号。 结论　从S j肝期童虫cDNA文库中筛选到一批S j基因 ,其中部分为未知基因 ,为血吸虫新的疫苗候选分子的研究提供了材料。     

日本血吸虫Mago nashi基因的表达及其抗体的制备

目的 获得日本血吸虫Mago nashi(SjMago)基因的原核表达蛋白并制备多克隆抗体.方法 以童虫cDNA文库为模板,PCR方法扩增该基因,将其亚克隆人原核表达载体pET28a(+)中,IPTG诱导表达重组蛋白,用含重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用Western blot和ELISA法鉴定抗体的特异性和效价.结果 成功重组SjMago基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达相对分子质量约17×103的目的蛋白,免疫家兔获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测多克隆抗体的效价为1∶40 960,Westernblot证实有特异性目的蛋白条带存在.结论 成功获得了原核表达的SjMago基因,制备出特异性的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础.     

日本血吸虫Mago nashi蛋白编码基因功能的研究

目的研究日本血吸虫Mago nashi蛋白编码基因在虫体生殖器官发育方面的功能。方法体外PCR法合成Mago nashi双链RNA(dsRNA),将SjMago nashi基因dsRNA产物和阴性对照lacZ基因dsRNA产物分别电击转染至机械脱尾的日本血吸虫童虫体内,将部分电击转染的童虫作体外培养,在培养后第1、3和5天以TRIzol法同时提取其总RNA和总蛋白。实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测Mago nashi基因和蛋白表达产物。电击转染的童虫注射入6只BALB/c小鼠体内,每鼠约1 000条,6周后取出虫体,盐酸卡红染色,在激光共聚焦显微镜下观察虫体内部各器官形态特征,测量虫体相关指标。结果在电击转染后的第1、3和5天,SjMago nashi dsRNA组目的基因的转录水平较阴性对照组分别下降了22%、69%和80%,蛋白质水平较阴性对照组分别下降了12%、39%和56%。激光共聚焦显微镜观察发现,SjMago nashi dsRNA组中的雄虫睾丸内有较多精子,呈泛雄性化表现,而雌虫的卵巢和卵黄腺无明显特征变化。与阴性对照组相比,SjMago nash...     

东方田鼠天然抗体相关的日本血吸虫抗原基因筛选和克隆

目的　研究东方田鼠对日本血吸虫感染天然抵抗力的蛋白分子基因。　方法　用未感染日本血吸虫的东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫成虫 c DNA文库 ,将阳性重组子克隆及测序。利用软件和互联网对核酸序列进行分析 ,确定目的基因。　结果　筛选出编码东方田鼠天然抵抗力相关的 7种蛋白分子基因 :三磷酸甘油醛脱氢酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、热休克蛋白、 2 2 .6 k Da膜相关抗原、副肌球蛋白、细胞色素 C及组织蛋白酶 B。　结论　东方田鼠对日本血吸虫的天然抵抗力可能有许多蛋白分子参与。     

日本血吸虫（中国大陆株）成虫表达序列标签的获取及新基因的发现

运用表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST）技术快速、经济地发现日本血吸虫（中国大陆株）新基因。方法 随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库单个重组克隆进行部分测序以获得EST,获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GenBank数据库进行比较及同源性分析。结果 本研究共随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库单个重组克隆200个,获得了76个有EST价值的序列,其中7.9%为日本血吸虫已知序列,5.3%为日本血吸虫同源序列。曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占有EST价值的序列的22.4%,未知序列占59.2%。在获得的76个有EST价值的序列中,66个成功在GenBank dbEST中登录。通过同源性分析,发现了一些令人感兴趣的基因。结论 EST方法有助于快速、经济地发现日本血吸虫（中国大陆株）成虫新基因。     

日本血吸虫抗原cDNA基因的鉴定和分析

采用3种不同的方法（融源表达、平板裂解法和PCR检测）对日本血吸虫抗原CDNA克隆进行鉴定和分析，8个免疫筛选阳性克隆均能在大肠杆菌Y1089中表达．表达产物分子量为140－150kDa，抗原cDNA基因经限制性内功酶消化后，琼能糖凝胶电泳显示为700－900bp，PCR检测亦得出类似的结果。表明上述三种方法均能有效地鉴定日本血吸虫抗原cDNA基因。     

日本血吸虫（中国大陆株）若干酶类基因的发现

目的 运用表达序列标签（EST）技术,从日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj)cDNA文库中分离、鉴定出有潜在应用价值的血吸虫基因序列。方法 应用EST方法,从日本血吸虫cDNA文库中随机挑选出单个重组克隆,PCR扩增出插入片段,并进行PCR产物直接测序;将获得的序列资料与EBI和GenBank进行BLASTn和BLASTx同源性检索,对可能的酶类基因序列进行分析。结论 采用EST策略,可获得日本血吸虫（中国大陆株）若干酶类基因序列EST,为进一步的cDNA全长坟和克隆奠定基础。     

日本血吸虫钙调神经磷酸酶B基因的获得和分析

目的　从日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新的蛋白基因 ,为日本血吸虫病的防治提供侯选疫苗和药物靶点。方法　构建日本血吸虫成虫cDNA文库 ,挑取重组阳性克隆进行测序 ,对部分序列进行步移法测序获取全长cDNA ,并进行生物信息学分析和登录。结果　获得了 1个日本血吸虫新基因 -钙调神经磷酸酶 (Calcineurin ,CaN)基因B(AY2 2 0 75 1) ,长 12 6 6bp ,编码 16 9个氨基酸 ,含有 2个“EF -hand”Ca+2 结合区域 ,与曼氏血吸虫CalcineurinB有 84 %的同源性。结论　步移法测序和生物信息学技术相结合有利于发现日本血吸虫新基因     

日本血吸虫(中国大陆株)Cathepsin L基因的克隆、表达及其免疫保护功能的研究

目的开展日本血吸虫组织蛋白酶L(SjCL)功能研究,为研发血吸虫病抗病疫苗提供基础。方法应用RT-PCR技术分离、克隆日本血吸虫中国大陆株组织蛋白酶L保守功能域编码基因,并在大肠杆菌系统中表达,应用免疫亲和层析法纯化组织蛋白酶L重组抗原,用该基因纯化重组表达产物进行小鼠免疫保护实验。结果获得了672 bp的血吸虫组织蛋白酶L保守功能域cDNA序列,成功构建了原核表达载体pET28a( )-SjCL,并在大肠杆菌中进行了表达,经免疫亲和层析获得了高纯度的SjCL融合蛋白,以该纯化物免疫小鼠,结果实验组减虫率为36.04%,肝组织减卵率为34%,粪卵减少率达49%,与对照组进行方差分析,差异均显著。结论获得日本血吸虫组织蛋白酶L保守功能域cDNA克隆,其原核表达产物免疫小鼠对抗血吸虫感染具有一定的保护性。     

日本血吸虫尾蚴cDNA文库的构建及分析

目的　构建日本血吸虫尾蚴 c DNA文库。　方法　从日本血吸虫尾蚴中提取总 RNA,运用“SMART c D-NA文库构建试剂盒”构建文库。　结果　所建文库的初始滴度为 1.8× 10 7pfu/ ml,经 1次扩增后的滴度为 2 .5× 10 7pfu/ ml,插入子的平均长度为 1.0 75 kb,重组率为 94 .4 % ,并从该文库中调出了日本血吸虫保守基因 TPI和 JF2的全长 c DNA片段。　结论　构建了日本血吸虫尾蚴 c DNA文库     

日本血吸虫卵壳蛋白前体基因Sj423的克隆表达及分析

据日本血吸虫菲律宾株编码卵壳前体蛋白的一段230bp的序列设计PCR引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出日本血吸虫中国大陆株相应的基因片段、然后根据测序结果设计一系列引物,用5’RACE和3’RACE法扩增出该基因cDNA的5’和3’端,再根据测序结果设计全长引物,用RT-PCR方法扩增出大小为423bp的片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株卵壳前体蛋白基因的完整阅读框,对相应基因组区段测序证实该基因没有内含子(GenBank登录号:AF519182)。将其克隆到表达载体pET28c(+)中,在大肠杆菌中获得表达,融合表达产物分子量约为20.9 kD。Real-ti me PCR结果显示该蛋白在尾蚴感染宿主后第23d即卵壳形成时高表达。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。     

日本血吸虫组织蛋白酶L2基因扩增及克隆

目的　体外扩增日本血吸虫中国大陆株组织蛋白酶L2 (SjCL2 )的编码区基因序列 ,将其克隆到真核表达质粒pcDNA3中 ,为进一步对其进行功能研究奠定基础。方法　用TRIZOL分离日本血吸虫成虫RNA ,RT -PCR扩增目的基因 ,将扩增产物定向克隆到真核表达载体 pcDNA3中。 结果　RT -PCR特异性扩增出SjCL2编码区基因序列 ,其片段大小为1kb左右 ,经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pcDNA -SjCL2中含有所扩增的基因序列。 结论　RT -PCR扩增的SjCL2编码区基因序列与预期长度相符合 ,成功构建了含SjCL2编码区基因的真核表达质粒pcDNA -SjCL2。     

一个定向克隆的日本血吸虫基因表达库

作者应用定向克隆的方法，将从日本血吸虫成虫mRNA合成的cDNA片段，重组入噬菌体λgtllSfi－Not的EcoRⅠ和NotⅠ双酶切点之间。所构成的基因表达文库的库容量为3．13×106重组子。经含有IPTG及X－Gal的颜色选择平皿测定，重组效率为100％。应用抗体探针法已从一部分文库中筛选出25个阳性克隆。从阳性克隆的进一步分析以及应用特定基因引物的PCR扩增，目前已分离出4个具疫苗保护潜能的蛋白编码基因，从而表明文库的质量比较满意。