五种出血热病毒重组酶聚合酶等温扩增方法的建立

目的 建立五种出血热相关病毒,即扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒和黄热病毒的一步法重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术,为病原体的确定提供现场快速检测方法.方法 通过基因组序列分析,选择每种病毒的特异核酸片段作为检测靶基因,针对靶基因序列设计RPA检测的引物和探针;取系列稀释的模板基因进行RPA检测,确定其灵敏性;取出血热相关病毒核酸为模板进行RPA检测,确定其特异性;验证不同温度反应条件(37~42℃)对检测结果的影响.结果 五种出血热病毒的RPA反应体系均可有效扩增靶基因,灵敏性为1.5×102~1.5×103copies/反应,与其他出血热相关病毒的核酸无交叉反应;RPA实验在37~42℃均可实现靶基因的有效扩增.结论 建立了五种出血热病毒的RPA等温扩增体系,该体系反应快速,温度范围宽,适用于现场快速检测.     

吗啡依赖模型大鼠脑cDNA文库的构建

目的:构建吗啡依赖模型大鼠脑cDNA文库.方法:建立大鼠吗啡躯体依赖模型后,取鼠脑进行总RNA的抽提、mRNA的纯化,以mRNA为模板合成第一链cDNA后用LD-PCR方法合成双链cDNA,用限制性内切酶SfiⅠA、B分别双酶切双链cDNA与pTRG载体,连接后的cDNA文库转化XL1-Blue MRF′ Kan 超级感受态并收菌,完成cDNA文库构建.结果与结论:PCR结果显示,cDNA片段连接效率＞90%,cDNA插入片段在1 kb左右.吗啡依赖大鼠脑cDNA文库总容量为3.05×106,满足下一步细菌双杂交文库筛选要求.     

人骨形态发生蛋白12基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建及制备人骨形态发生蛋白12(BMP12)基因重组腺病毒,证明其可感染脂肪组织来源干细胞并表达蛋白。方法:将包含有BMP12cDNA全长序列的BMP12-pED6质粒用限制性内切酶EcoRI进行酶切,得到一个1260bp大小的含有BMP12cDNA的目的基因片段。将目的基因片段插入质粒pcDNA3.1后,用KpnI和PmeI进行双酶切,插入pAdtrack-CMV。插入目的基因片段的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP12用PmeI进行酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1一起电转化入感受态BJ5183菌株。用PCR及多种酶切方法鉴定重组体。最终将线性化的重组质粒利用脂质体转入293A细胞中进行病毒包装。BMP12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中扩增而得到复制,并通过CsCl梯度离心法得以纯化。Elisa法检测Ad-BMP12感染脂肪组织来源干细胞后BMP12的蛋白表达。结果:pAdtrack-CMV-BMP12经酶切证实有1260bp的插入片段。酶切及PCR鉴定证实BMP12基因重组腺病毒载体构建成功。GFP(green fluorescent protein)表明重组腺病毒扩增成功并制备出高滴度重组病毒。该重组病毒可成功感染脂肪来源组织干细胞并表达BMP12蛋白。结论:BMP12基因能够重组于腺病毒载体,可以进行有效扩增,产生高浓度的重组腺病毒,从而用于BMP12基因治疗的研究。     

扩增我国登革2型病毒全长cDNA分子的融合PCR方法

目的：建立扩增登革2型病型基因组全长cDNA的融合PCR法，为深入探讨病毒基因的结构与功能提供有效的技术途径，方法：根据我国登革2型病毒D2－43株列设计引物，首先采用长链RT－PCR技术扩增病毒基因组5‘及3‘半分子，然而以阗分子采用融合PCR法将两个半分子建成全长cDNA分子，为进一步证实所构建全长cDNA分子的特异性，再以融合PCR产物为模板扩增5‘非编码区序列，与pGEM-T载体连接，在377A型自动测序仪进行序列分析，结果：通过对逆转录反应及PCR扩增条件的优化，建立了制备大片段cDAN及构建全长cDNA分子的融合PCR方法，扩增的我国登革2型病毒的5‘及3‘半分子的半度均为5kb左右，采用融合PCR方法制备的全长cDNA长约11kb，与预期大小一致，非编码区测序结果表明扩增产物为D2－43所特有，结论：所建立的融合PCR方法是构建登革闰因组全成cDNA的有效技术。     

一株西尼罗病毒基因组cDNA亚克隆的构建与鉴定

目的：构建我室保存的一株西尼罗病毒引进毒株（CH-01）基因组全长cDNA的亚克隆，为进一步构建该毒株的感染性全长cDNA克隆奠定基础。方法：根据CH-01病毒株基因组序列中含有的特异性酶切位点，利用DNAstar及Olig06软件设计5对引物。以感染细胞中的病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的5个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-Teasy载体，通过片段间共有的酶切位点进行连接，最终获得基因组5′和3′半分子，并分别通过序列测定加以鉴定。结果与结论：已构建出西尼罗病毒CH-01株基因组的5′和3′半分子，经酶切鉴定和序列测定表明所获得的cDNA克隆为该株病毒的特异性序列。     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.     

登革病毒NS1基因的平端PCR产物的快速克隆

用ＰＣＲ产物进行克隆已广泛用于分子生物学的各个领域。ＰＣＲ产物的克隆主要通过两个途径：其一，在引物的３’末端加上限制性内切酶的识别序列，使扩增片段产生粘性末端，再连接到有相应末端的载体中去。但是，由于许多限制酶对处在ＤＮＡ片段末端的识别序列的作用效率远较处于内部的序列为低。因此，该方法在实际应用中常常不能获得满意的结果。其二，用ＰＣＲ产物进行平端连接，这种方法无需酶切，可适用于任何扩增产物，故应用较广。但由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有不依赖模板的末端转移酶活性而导致扩增片段３’端带有腺苷酸残基，而使…     

SARS冠状病毒BJ01株基因组全长cDNA的构建与鉴定

目的:构建我国自行分离的SARS冠状病毒BJ01株基因组全长cDNA分子,为阐明SARS病毒致病的分子机制奠定基础。方法:采用分段克隆的方法对病毒全基因组进行分段扩增和克隆,然后将全基因组各cDNA片段分别进行体外连接获得全长cDNA分子,并对其接头序列进行PCR扩增和测序鉴定。结果与结论:获得了SARS病毒BJ01株基因组全长cDNA分子,对其接头处序列的测定结果表明,该全长cDNA分子为SARS病毒BJ01株的特异序列。     

斜带石斑白细胞cDNA文库的构建

用Tripure试剂盒提取斜带石斑白细胞总RNA ,反转录合成第一链cDNA ,进行长距离PCR ,蛋白酶K消化 ,SfiI酶切 ,通过CHROMASPIN - 40 0柱 ,回收大于 5 0 0bp的cDNA ,与λTripIEx2载体连接 ,体外包装后构建了斜带石斑细胞的cDNA文库。库容 1 .6 5× 1 0 6 ,重组频率 82 % ,扩增后滴度 7.5× 1 0 9pfuml- 1。插入片断长度 5 0 0～ 2 30 0bp ,最多的是在 75 0～ 1 0 0 0bp范围。本文库可作为筛选斜带石斑细胞因子基因的重要资源     

天然冬虫夏草 冬虫夏草菌丝及发酵液游离氨基酸的种类及含量测定

目的对天然冬虫夏草、冬虫夏草菌丝及发酵液样品进行24种游离氨基酸的分析;进一步了解三者游离氨基酸的种类和含量,为它们的应用研究提供可用的信息及参考。方法采用安捷伦1200HPLC,C18反相柱梯度分离,邻苯二甲醛-芴甲酯（OPA—FMOC）柱前自动衍生化,利用已知浓度氨基酸标准品进行外标法定量,根据已知浓度氨基酸标准品的峰面积与样品峰面积之比计算出游离氨基酸的含量。结果分析结果表明在24种游离氨基酸的测定中,天然冬虫夏草含有19种,冬虫夏草菌丝含22种,发酵液含23种,三者所缺少的游离氨基酸种类互不相同。三者游离氨基酸的含量有着明显差别和变化,其原因是由于天然冬虫夏草是在野外天然生长,冬虫夏草菌丝和发酵液是人工发酵培养,处于不同的温度和环境条件的原故。结论天然冬虫夏草,冬虫夏草菌丝及发酵液的游离氨基酸的种类和含量并不等同,建议临床配合使用。     

人工冬虫夏草菌丝体对糖尿病大鼠睾丸的保护作用

目的观察人工冬虫夏草菌丝体对糖尿病大鼠睾丸的保护作用。方法21只Wistar鼠随机分为正常对照组、糖尿病组和治疗组。采用四氧嘧啶腹腔注射复制糖尿病动物模型。金水宝胶囊治疗8周后,测血清葡萄糖、胰岛素、睾酮,以及睾丸高能磷酸化合物、线粒体丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、ATP酶。结果糖尿病组与对照组比较,睾丸线粒体膜发生脂质过氧化,出现能量代谢障碍,ATP酶活性下降。使用金水宝治疗后,睾丸各项测定指标明显改善。结论人工冬虫夏草菌丝体对糖尿病大鼠睾丸有保护作用。     

金水宝对支气管哮喘患者免疫功能的影响

目的：探讨虫草菌酚酚对支气管哮喘患者免疫功能的影响。方法选支气管哮喘患者60例,随机分成两组：治疗组患者在常规治疗的基础上加用金水宝胶囊治疗。观察患者的临床效果。结果哮喘患者T细胞亚群Th1／Th2、Th2／Treg比例失衡;金水宝胶囊可在一定程度上纠正Th1／Th2、Th2／Treg比例失衡,降低血清IgE水平。结论金水宝胶囊能调动自身的免疫,改善哮喘患者临床症状。     

虫草制剂通过TGF-β/Snail信号通路拮抗糖尿病小鼠肾小管上皮细胞间充质转分化

目的探讨虫草制剂对糖尿病小鼠肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)的影响及转化生长因子β(TGF-β)/锌指转录因子(Snail)信号通路表达情况。方法将18只C57BL/6j小鼠随机分为正常对照组(6只)、糖尿病模型组(12只)。糖尿病小鼠模型制成后,随机分为糖尿病组(6只)(常规饲料喂养正常饮水)和虫草菌液治疗组(6只)(每日给予0.54 g/kg发酵冬虫夏草菌粉提取液)。治疗6周测定各组小鼠体质量、血糖、尿蛋白肌酐比(PCR)等生理指标变化;取肾组织光镜下观察胶原含量;免疫组化或免疫印迹技术检测E-钙粘素(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1及Snail 1蛋白表达。结果免疫组化及肾组织胶原纤维(Masson)染色显示,与正常对照组比较,糖尿病组及虫草菌液治疗组肾组织E-Cadherin的表达均明显下降,α-SMA的表达均明显上升,胶原成分明显增多,差异均有统计学意义(P<0.05);与糖尿病组比较,虫草菌液治疗组E-Cadherin下降幅度、α-SMA上升幅度、胶原成分均减少,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹结果显示,与对照组比较,糖尿病组肾组织TGF-β1及Snail1蛋白表达水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);与糖尿病组比较,虫草菌液治疗组TGF-β1及Snail1蛋白表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论虫草制剂可能通过下调TGF-β/Snail信号通路表达抑制糖尿病小鼠肾小管上皮细胞EMT,减轻肾组织纤维化。     

Radiation mitigation effect of cultured mushroom fungus Hirsutella Sinensis (CorImmune) isolated from a Chinese/Tibetan herbal preparation -Cordyceps Sinensis

PURPOSE: This study was carried out to test the hypothesis that the anti-oxidant and growth promoting properties of the cultured mushroom fungus Hirsutella sinensis (CorImmune) of Cordyceps sinensis mitigate radiation injury in mice. MATERIALS AND METHODS: BALB/c mice received total body irradiation (TBI) followed by treatment with CorImmune. The effect of CorImmune on lymphoid tissue, spleen and blood cells as well as survival and hematopoietic recovery was compared to normal saline treated controls. RESULTS: CorImmune administered beginning 2 hours after a lethal dose of TBI significantly improved survival: 55% in the CorImmune group vs. 0% in the saline control (p < 0.0001). It increased normal leukocyte levels in a dose-dependent fashion. Animals treated with sub-lethal TBI and monitored for blood leukocyte recovery exhibited a return to normal baseline 3 weeks after TBI injury. In contrast, only 50% returned to normal baseline in the saline control group (p < 0.01). CorImmune also stimulated immune lymphocyte proliferation by nearly two-fold in a (3)H-thymidine incorporation assay compared to controls (p < 0.01). CONCLUSIONS: CorImmune significantly increased animal survival after a lethal dose of radiation, accelerated leukocyte recovery and stimulated immune lymphocyte proliferation. We conclude that CorImmune is effective as a radiation mitigator when administered after radiation injury.     

不同级别人工蛹虫草腺苷含量的比较

目的测定不同级别人工蛹虫草中腺苷含量。方法按照《中国药典）2005年版一部冬虫夏草项下含量测定方法,比较3个级别的蛹虫草腺苷含量。结果3个级别的AI蛹虫草以腺苷含量为评价指标,均符合药典规定,一级蛹虫草样品的平均含量为（9．73×10^-2）％,二级蛹虫草样品腺苷平均含量为（13．0×10^-2）％,三级蛹虫草样品腺苷平均含量为（20．3×10^-2）％,显著高于一级、二级蛹虫草样品。结论提示将人工蛹虫草按生长性状分级是否合适值得进一步探讨。     

超声对华支睾吸虫感染所致胆道梗阻的诊断价值

目的 探讨华支睾吸虫感染所致胆道梗阻的超声影像特点及其诊断价值.资料与方法 回顾性分析43例华支睾吸虫感染患者的胆道梗阻声像图表现,并与胆总管病变引起的胆道梗阻作比较.结果 43例华支睾吸虫感染所致胆道梗阻患者均表现为肝内胆管轻至中度扩张,以次级胆管明显,胆管壁增厚,回声增强,胆囊肿大,胆总管轻度扩张,扩张程度与肝内胆管不成正比.胆总管病变引起的胆道梗阻其肝内胆管扩张程度与胆总管成正比.结论 华支睾吸虫感染所致胆道梗阻超声表现具有特征性,超声可作为该病的有效诊断方法.     

北虫草提取物影响冷应激大鼠脑组织cAMP水平与AC活性的实验研究

目的探讨北虫草提取物对冷应激大鼠不同脑组织区域环磷酸腺苷（cAMP）水平与腺苷酸环化酶（adenylate cyclase,AC）活性的影响。方法采用4℃暴露3h应激方式,持续应激4周,建立大鼠冷应激模型,用酶联免疫吸附实验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）法检测脑皮质,脑干和丘脑下部cAMP含量和AC活性的改变。结果冷应激实验组与正常对照组比较大鼠脑皮质、脑干,丘脑下部cAMP含量和AC活性明显下降,虫草提取物能明显拮抗冷应激引起的cAMP含量和AC活性降低。结论北虫草提取物对冷应激大鼠脑组织不同区域cAMP含量和AC活性有明显的改善作用,提示持续冷应激会导致中枢神经系统功能障碍。而虫草提取物表现出的上调cAMP含量和AC活性作用可能与增强冷应激大鼠脑组织不同区域交感神经-肾上腺-靶细胞信号传导网络之间的功能有关,确切的调控机理尚需进一步深入实验研究。     

超临界CO2萃取-分子蒸馏对当归的提取分离

目的 对当归的亲脂性化学成分进行研究。方法 采用超临界CO2萃取当归中亲脂性成分，用分子蒸馏对提取物进行分离，用GC-MS联用技术分离鉴定各自的化学组成，计算其相对含量。结果 超临界CO2萃取物得率2．15％，从中鉴定出3N-丁基邻羟甲基苯甲酸内酯等31种成分；萃取物经分子蒸馏的得率为15．8％，从中鉴定出35种成分。结论 超临界CO2萃取和分子蒸馏可用于当归亲脂性成分的提取，提取物与传统方法提取的当归挥发油成分有显不同。     

基于血浆药理学的鳖甲超微粉抗肝纤维化作用研究

目的用血浆药理学方法,体外观察鳖甲超微粉含药血浆抗肝纤维化作用。方法采用体外肝纤维化细胞模型,以大鼠含药血浆对HSC-T6细胞增殖的影响为指标,采用效应动力学方法,确定大鼠给药方案和采血时间,并优选体系中血浆添加量。制备鳖甲超微粉和普通粉含药血浆,MTT法检测含药血浆对HSC-T6细胞增殖的影响,ELISA法测定含药血浆对HSC-T6细胞胶原分泌的影响。结果鳖甲超微粉和普通粉含药血浆对HSC-T6细胞增殖和Ⅰ型胶原合成均有显著抑制作用（P〈0.01）,超微粉组的抑制作用强于普通粉组,且有显著性差异（P〈0.01）。结论鳖甲超微粉碎后可提高其抗肝纤维化疗效。