转铁蛋白增强靶向性非病毒载体K16GRGDSPC介导外源基因对骨髓基质干细胞的转染和表达

目的:检测转铁蛋白能否增强新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC寡肽介导外源基因对骨髓基质干细胞的转染和表达,优化寡肽载体的转染条件,为下一步利用寡肽载体构建载基因基质材料进行骨缺损修复提供实验依据。方法:实验于2004-10/2005-01在协和医院骨科实验室完成。①用固相合成法合成K16GRGDSPC寡肽并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测。②新西兰大白兔麻醉后无菌条件下自股骨大转子处抽取骨髓2mL,1500g离心收集细胞,加入含体积分数0.2新生牛血清的DMEM混悬细胞于培养瓶中常规培养。48h后更换培养基,除去未贴壁细胞,细胞生长至85%融合后传代。③应用转化生长因子真核表达载体pcDNA3-TGFβ1和增强型绿色荧光蛋白真核表达载体pcDNA3-EGFP,观察转铁蛋白对K16GRGDSPC寡肽介导上述两种质粒转染骨髓基质干细胞的转染及表达效率的影响。结果:①寡肽的分子量和纯度检测:质谱图显示肽平均分子质量为2741.3307m/z,与理论上计算设计合成肽的平均分子质量一致,高压液相色谱仪示合成肽的纯度为94%～95%。②转铁蛋白、寡肽载体、质粒DNA三者形成复合物的电泳鉴定结果:将1μg寡肽载体分别与10μg或20μg转铁蛋白及2μgpcDNA3-TGFβ1混合后电泳,结果显示三者混合物的电泳迁移率均低于不加转铁蛋白的空白对照,且加20μg转铁蛋白较加10μg转铁蛋白的电泳迁移率更低。说明带正电荷的转铁蛋白与寡肽载体和质粒DNA形成了复合物。③转铁蛋白增加K16GRGDSPC寡肽转染效率:2μgpEGFP质粒与6μgK16-GRGDSPC寡肽加5～45μg转铁蛋白转染骨髓基质干细胞,转染效率随转铁蛋白浓度的增加而逐步提高,在25μg时转染效率达到最大,进一步增高转铁蛋白浓度,转染效率并不增加。④转化生长因子β1活性检测结果:体外以6μgK16GRGDSPC寡肽加25μg转铁蛋白介导2μgpcDNA3-TGFβ1转染骨髓基质干细胞,转染72h后测得明显高于未加转铁蛋白的转化生长因子β1的表达量[(64.4±4.3),(48.6±3.5)μg/L,P<0.01]。结论:转铁蛋白能与载体K16GRGDSPC和质粒DNA形成复合物,且显著增强K16GRGDSPC寡肽介导外源基因在骨髓基质干细胞中的转染和表达。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达（英文）

背景:成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。目的:观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。方法:构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。结果与结论:实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

胰岛素样生长因子Ⅱ基因转染骨髓基质细胞后的生物学活性

目的：将人胰岛素样生长因子Ⅱ基因的真核表达载体pcDNA3-胰岛素样生长因子Ⅱ，转染兔骨髓基质细胞，使其在该细胞中瞬时表达，并观察该表达载体促进骨髓基质细胞增殖的生物学活性。方法：实验于2004—08／12在解放军总医院骨科研究所完成。①骨髓基质细胞培养：取4周龄雄性新西兰大白兔1只用于骨髓基质细胞提取。培养的第2代细胞用于实验。②基因转染：将人胰岛素样生长因子Ⅱ基因的真核表达载体pcDNA3-胰岛素样生长因子Ⅱ，转染兔骨髓基质细胞，对照组则为空载体pcDNA3。③转染与非转染骨髓基质细胞胰岛素样生长因子ⅡmRNA表达：采用反转录-聚合酶链反应检测。④转染细胞的增殖状况检测：采用四甲基偶氮唑盐法测定各组吸光度（A）值（A值越大表示细胞增殖越强）。结果：①转染与非转染骨髓基质细胞胰岛素样生长因子ⅡmRNA表达：琼脂糖凝胶电泳的结果显示，未转染和转染pcDNA3质粒的细胞仅出现内参照β-肌动蛋白的条带，而转染的细胞出现胰岛素样生长因子Ⅱ和β-肌动蛋白的两条带。（2）转染细胞的增殖状况：24，48，72h各时间点单纯骨髓基质细胞组和转染胰岛素样生长因子Ⅱ的骨髓基质细胞组细胞增殖均显著高于与对照组（72h：1.233&;#177;0.45，1．575&;#177;0.45，0．482&;#177;0．04，P〈0．01）；转染胰岛素样生长因子Ⅱ的骨髓基质细胞组显著性高于单纯骨髓基质细胞组（P〈0．01）。结论：将具有多重生物学效应的胰岛素样生长因子Ⅱ基因转入软骨组织工程最佳种子细胞-骨髓基质细胞，明确胰岛素样生长因子Ⅱ促进骨髓基质细胞增殖分化效应，并初步证实了其促进种子细胞的成骨活性。     

pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞的体外表达及体内成骨能力

背景：能否通过病毒或者非病毒载体将骨形态发生蛋白2转导到骨髓基质细胞发挥成骨作用？目的：观察真核表达载体pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞后体外表达，同时将MSC转染后但未筛选兔骨髓基质细胞自体回植入肌组织，利用X线观察其成骨情况。设计、时间及地点：观察对比实验。实验于2004—11／2005-04在辽宁医学院骨科研究室完成。材料：6只成年新西兰大白兔，雌雄不拘，体质量2．0～3．0kg。BMP2抗体为美国Sanaka公司产品，pcDNA3-hBMP2由解放军第四军医大学生化教研室蒲勤教授提供，限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司。方法：从大肠杆菌提取超纯质粒pcDNA3-hBMP2，从成年兔股骨抽取骨髓，密度梯度分离法分离培养骨髓基质干细胞，将细胞分成4组；A组：pcDNA3-hBMP2转染进行G418筛选；B组：pcDNA3-hBMP2转染未用G418筛选；C组：给予pcDNA3空载体转染；D组：仅加入脂质体转染试剂Fugene 6。主要观察指标：①应用免疫组织化学法检测转染后瞬时表达。②应用免疫组织化学法检测细胞骨钙素表达，分别应用原位杂交法检测细胞Ⅰ型胶原表达。③转染2周后将B组细胞自体回植入兔后腿肌组织中，移植4周后应用X射线观察成骨情况。结果：①pcDNA3-hBMP2成功转染入骨髓基质干细胞内并100％瞬间表达BMP2。②基因转染4周后，A组细胞骨钙素及Ⅰ型胶原表达高于C组及D组。③B组细胞回植肌组织4周后，X射线可显示新骨形成。结论：pcDNA3-hBMP2能安全有效转染兔骨髓基质干细胞，通过其分泌物BMP2来作用诱导细胞加速分化为成骨细胞。     

转化生长因子β1转染骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的:通过转化生长因子β1基因转染大鼠的骨髓间充质干细胞,观察目的基因的分泌情况及干细胞向软骨细胞分化效果,为构建新型的软骨组织工程学种子细胞提供新思路。方法:实验于2005-10/2006-09在中国医科大学细胞生物实验室完成。实验材料:6周龄Wistar大鼠10只,质粒pcDNA3.1-TGF-β1(由吉林大学徐莘香教授惠赠),转化生长因子β1、Ⅱ型胶原小鼠抗大鼠单克隆抗体(Neomaker公司)。实验分组:分为未经转染的骨髓间充质干细胞(未转染组)、转染空载的骨髓间充质干细胞(转染空载体组)和转染转化生长因子β1的骨髓间充质干细胞(转染转化生长因子β1组)。实验方法:①密度梯度离心法和贴壁分离法相结合分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,免疫荧光法检测细胞表面标志。②质粒pcDNA3.1-TGF-β1扩增、提取、鉴定。③转化生长因子β1基因转染骨髓间充质干细胞。实验评估:①四甲基偶氮唑盐法测定筛选后细胞的增殖活性。②Westernblot检测转染后细胞转化生长因子β1和Ⅱ型胶原蛋白表达。结果:①免疫荧光法检测骨髓间充质干细胞:CD29和CD44表达阳性,CD34和CD45表达阴性。②pcDNA3.1-TGF-β1真核表达载体的酶切鉴定:基因测序与GeneBank cDNA序列相符。③转染基因对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响:基因转染后骨髓间充质干细胞的增殖力变强,转染组的细胞增殖力高于未转染组和转染空载体组。④转化生长因子β1表达:转染后的骨髓间充质干细胞较未转染和转染空载体的骨髓间充质干细胞分泌转化生长因子β1蛋白增加。⑤Ⅱ型胶原的蛋白表达:在转化生长因子β1目的基因转染后的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原蛋白表达较未染和转染空载体的骨髓间充质干细胞增强。结论:应用基因转染技术将转化生长因子β1目的基因导入骨髓间充质干细胞中,在蛋白质水平鉴定转染成功,且骨髓间充质干细胞成软骨分化所需的特异性细胞外基质Ⅱ型胶原明显升高,使骨髓间充质干细胞在保持很强的体外传代增殖能力同时,又能产生、表达转化生长因子β1。     

重组pcDNA3．1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达

目的：将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中，观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达。 方法：实验于2003-08／2004-08在哈尔滨兽医研究所完成。①选取清洁级健康成年家兔1只，兔膝关节软骨切碎后取2．0-2．5kg软骨组织，进行关节软骨细胞的分离与培养。②脂质体与pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物，复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg。用含G418的正常培养液筛选转pcDNA3.1-BMP7质粒μg400mg／L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7DNA质粒的软骨细胞，显微镜观察细胞的形态及活性。③软骨细胞转染后7d和28d，分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达。 结果：①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况：家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶／Ⅱ型胶原酶进行消化，能使细胞与细胞外基质很好地分离。接种24h，部分细胞开始贴壁生长，72h后分裂增殖，7d时细胞融合率为90％～100％。贴壁初期细胞呈圆形或三角形，以三角形为主，每7d传代1次。②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况：转染后的软骨细胞用G418筛选，4d转染效率约15％，阳性克隆细胞七八天融合率约为90％。G418连续筛选28d，阳性克隆细胞仍然存活，细胞融合率为100％。未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞，G418筛选4d时细胞全部死亡。③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果：聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，结果在1．3kb处可见DNA条带，作为对照的软骨细胞未见此DNA条带。④转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果：在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18000的电泳条带。⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Western blot检测结果：可见相对分子质量约为18000的特异性条带。⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果：转染7，28d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光，未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达。⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果：转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7，28d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色，未转染的软骨细胞未见BMP7表达。 结论：用脂质体将pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒转染至兔关节软骨细胞。BMP7在关节软骨细胞中获得表达，为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

成纤维细胞生长因子18对兔骨髓基质干细胞体外增殖的影响

目的：构建可稳定表达成纤维细胞生长因子18蛋白的真核表达载体，在体外观察成纤维细胞生长因子18对兔骨髓基质干细胞体外增殖的影响。 方法：实验于2002—10／2004—03在西安第四军医大学全军骨肿瘤研究所及口腔医学院完成。①将pGEM—T-成纤维细胞生长因子18-3和pSecTag2B表达载体分别用KpnⅠ和NotⅠ酶切后重组pSecTag2B-成纤维细胞生长因子18质粒。（当脂质体介导下转染哺乳动物细胞COS-7，获得稳定表达后用细胞上清刺激骨髓基质干细胞。③通过噻唑蓝检测细胞增殖情况。 结果：①成功构建pSecTag2B-成纤维细胞生长因子18真核表达载体（电泳可见540bp的特异条带）。②转染哺乳动物细胞COS-7用夹心酶联免疫吸附法检测到了成纤维细胞生长因子18蛋白质的稳定表达（夹心酶联免疫吸附方法检测450nm处吸光度值，原液及1：10稀释度细胞上清大于阴性对照组2．1倍以上）。③用细胞上清刺激骨髓綦质干细胞后，实验组骨髓基质干细胞较对照组吸光度值明显增高，在24-72h其增高具有明屁的统计学差异（P〈0．01）。 结论：成纤维细胞生长因子18显著促进兔骨髓基质于细胞体外增殖，提示成纤维细胞生长因子18对于骨髓基质干细胞增殖及分化有调节作用。