幽门螺杆菌vacA—ctxB融合基因原核表达载体的构建

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)致细胞空泡毒素抗原(Vauolating cytotoxin antigen A,vaeA)毒性片段与霍乱毒素(Cholerae toxin,Ctx)B亚单位(ctxB)基因的原核表达载体,为进一步表达VCTB重组蛋白,制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础.方法:通过比较国内H.pylori代表株的vacA基因毒性亚单位,找出高度同源性片段,按基因文库中提供的vacA基因和ctxB基因序列设计引物.以H.pylori基因组DNA为模板,PCR扩增vaeA毒性片段基因,克隆至质粒pQE30中,获得重组质粒pQE30-vacA.以pET32(α)+-ctxB质粒为模板PCR扩增ctxB目的基因.再将纯化的ctxB基因片段插入pQE30-vacA中,构建含双基因的表达质粒pQE-vctB,构建的表达质粒pQE-vctB转化大肠杆菌Top10,培养后,提取纯化重组质粒pQE-vctB,内切酶双酶切鉴定.结果:扩增的vacA DNA片段约为723 bp,ctxB基因的DNA片段约为372bp,与预计长度相符合.构建的表达质粒pQE-vctB酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因片段相符.测序结果vctB融合基因由1092bp组成,编码364个氨基酸残基的多肽,与基因文库相符.结论:含vacA和ctxB融合基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达VCTB重组蛋白奠定了基础.     

幽门螺杆菌黏附素基因babA2的克隆表达及定位

目的: 克隆并表达H.pylori黏附素babA2基因. 方法: 提取H.pylori染色体基因,用PCR方法扩增babA2基因,将其克隆至表达载体pET-22b( ),并在BL21(DE3)大肠杆菌中表达及定位分析. 结果: 分离得到了2.2 kb的babA2基因片段,在37℃诱导表达3 h后,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%,其中分泌表达占周质总蛋白的22.7%,可溶性表达占上清的15.0%,包涵体占沉淀的86.7%. 结论: H.pylori babA2基因的克隆与表达为H.pylori黏附机制研究及疫苗的研制打下了基础.     

幽门螺杆菌尿素酶基因ureB植物双元表达载体的构建

目的:构建含有人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)ureB基因的植物表达载体.方法:采用高保真PCR技术从质粒pMED-ureB中扩增出ureB基因,构建质粒pUC18-ureB,再将pUC18-ureB酶切,将ureB基因与质粒pBI121连接.结果:构建的PBI121-ureB经PCR、酶切鉴定和测序分析证明,插...     

硫化氢对幽门螺杆菌感染GES-1细胞CSE,NF-κB及IL-8 mRNA表达的影响

目的: 观察硫化氢(hydrogen sulfide,H₂S)对幽门螺杆菌(H. pylori)感染的GES-1细胞CSE,NF-κB及IL-8 mRNA表达及其形态学的影响,探讨其对H. pylori所致胃黏膜细胞炎症的作用及机制。方法: 将GES-1细胞培养24 h后分为对照组(不加H. pylori及NaHS)、H. pylori组、NaHS组(又分为4个亚组,分别加入 50,100,200或400 μmol/L NaHS)和H. pylori+NaHS组(又分为4个亚组,分别加入H. pylori与50,100,200或400 μmol/L NaHS),每组分别培养3,6,及12 h,用RT-PCR法检测各组GES-1细胞CSE,NF-κB 及IL-8 mRNA表达,并分析其相关性。结果: H. pylori组CSE,NF-κB及IL-8 mRNA表达均较对照组增加(P<0.05),200 μmol/L NaHS组和400 μmol/L NaHS组CSE表达较对照组降低(P<0.05);而NaHS各组NF-κB和IL-8 mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);NaHS各组、H. pylori+200 μmol/L NaHS组及H. pylori+400 μmol/L NaHS组CSE,NF-κB及IL-8 mRNA表达均较H. pylori组降低(P<0.05);H. pylori组、H. pylori+200 μmol/L NaHS组及H. pylori+400 μmol/L NaHS组CSE,NF-κB及IL-8 mRNA表达之间均呈正相关(P<0.05)。结论: H. pylori诱导GES-1细胞NF-κB和IL-8 mRNA表达,并上调CSE mRNA表达;200和400 μmol/L NaHS能抑制H. pylori感染诱导的GES-1细胞NF-κB和IL-8 mRNA表达,改善H. pylori感染所致的细胞形态学变化,对细胞起保护作用。     

幽门螺杆菌flaA基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：观察幽门螺杆菌(H．pylori)flaA基因在大肠杆菌中的表达。方法：用PCR方法扩增flaA基因,然后插入原核表达载体pMAL-c2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果：特异PCR和酶切鉴定证实flaA基因克隆入表达载体,并以融合蛋门形式MBP-FLA高效表达,约占细胞总蛋白的28％。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清和小鼠H.pylori全菌抗体发生特异反应。结论：成功构建了能高效表达H．pylori FlaA蛋白的重组质粒,为H．pylori多价基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因的克隆及生物信息学特征预测

目的:构建表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H. pylori)NCTC 11637 IV型分泌系统cagX(HP0528)全长编码基因的原核表达载体。方法:用PCR方法从H.pylori基因组DNA中扩增cagX编码基因片段,将cagX克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,再将其定向插入pET32a( )载体中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果,并进行序列测定和生物信息学预测。结果:克隆幽门螺杆菌NCTC 11637cagX基因全长1569 bp(基因库登录号为EF608160),编码522个氨基酸,融合蛋白的相对分子质量约为80.5 kD。与基因库公布的其他H. pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为96%~99%。预测结果显示H. pylori11637,26695,J99间二级结构有一定差异,但抗原性相同。结论:成功克隆并表达了H. pyloriNCTC 11637cagX基因,并对其生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

CagA Gene Expression in Helicobacter pylori and Its Relationship with Metronidazole Resistance in Guizhou Province

目的:探讨贵州地区上消化道疾病患者幽门螺杆菌(H pylori)细胞毒素相关蛋白(CagA)基因的表达及其与甲硝唑( MTZ)耐药的相关性.方法:从上消化道疾病患者胃黏膜分离50株H pylori,经聚合酶链反应(PCR)检测CagA基因,E-test法检测MTZ耐药情况,测序并应用BLAST分析MTZ敏感株(MTZS)与耐药株(MTZR) CagA基因的分子差异.结果:50株H pylori中有92％的菌株表达CagA,其阳性表达率在消化性溃疡患者与慢性胃炎患者无差异;50株H pylori对MTZ总耐药率为54％,CagA阳性及阴性菌株耐药率分别为54.3％及50.0％(P>0.05);基因测序结果显示MTZS及MTZR两组间CagA基因突变无统计学差异.结论:贵州地区CagA阳性菌株与上消化道疾病密切相关,但与疾病的严重程度无明显关系,CagA基因表达及基因变异与MTZ耐药性之间无明显关系.     

胃癌组织中P38的表达与幽门螺杆菌感染的关系

目的:研究胃癌组织中的P38的表达与H.pylori感染的关系。方法:采用免疫组化S-P法检测P38的表达,用改良Giemsa染色、快速尿素酶试验和H.pylori-IgG检测H.pylori感染情况。结果:P38在胃癌组织中的表达阳性率为67.5%,在高-中分化腺癌、低分化腺癌、粘液腺癌和未分化癌中的表达阳性率无统计学差异(P<0.05)。在H.pylori阳性患者中P38的表达阳性率为71.42%,明显高于H.pylori阴性患者中的阳性率(33.33%,P<0.05)。单指标血抗H.plori-IgG与P38表达呈正相关(P<0.05)。结论:人胃癌组织中P38的表达与H.pylori感染有关,H.pylori感染可能通过P38信号传导途径诱导胃上皮细胞的凋亡。     

幽门螺杆菌对胃癌细胞线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ表达的影响

目的观察幽门螺杆菌(H.pylori)作用于胃癌细胞后线粒体编码基因COXⅠmRNA及蛋白的表达变化,探讨H.pylori致胃癌的分子机制。方法H.pylori培养滤液分别作用于胃癌细胞4、8和12 h后,收集细胞,应用RT-PCR和W estern b lot法检测各时相点COXⅠ基因和蛋白表达变化。结果H.pylori培养滤液作用4 h后,线粒体COXⅠmRNA的表达开始降低,8 h下降更明显,12 h下降速度减缓。各时相点的表达量明显低于对照组(P<0.05)。COXⅠ蛋白表达呈现出相同的趋势,各时相点的表达量明显低于对照组(P<0.05)。结论H.pylori可下调胃癌细胞线粒体编码基因COXⅠmRNA及蛋白的表达,影响线粒体功能。     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆、表达及抗体制备

目的:构建表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori) NCTC 11637 IV型分泌系统cagM(HP0537)全长编码基因的原核表达载体,分析其抗原性并制备抗体.方法:应用PCR技术从H.pylori基因组扩增 cagM基因片段,TA克隆后测序分析,并构建表达载体pET-28a(+)-cagM,转化 E.coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE及鉴定表达蛋白,表达蛋白以 Ni2+-NTA 柱进行纯化,用软件分析其抗原性后,免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价.结果:测序结果表明cagM基因全长1 131 bp(基因库登录号为GU269568),编码376个氨基酸,与基因库中已知菌株J99,26695和G27的氨基酸同源性为98%～99%;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明,在43 700处发现一条新生条带,Ni2+-NTA柱纯化后为单一条带,软件分析表明其抗原性较强,免疫家兔制备的多克隆抗体效价为1∶ 1.6×105.结论:首次成功克隆并表达了H.pylori pNCTC 11637 cagM基因,并制备了其抗体,为以后进一步研究其生物学功能以及H.pylori相关疾病的检测与治疗奠定了基础.     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

人Leptin的高效表达、纯化及生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV200-OB转化宿主菌E.coli JM109,热诱导获得目的蛋白的表达.经SDS-PAGE鉴定分析,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上,且以包涵体的形式表达.通过包涵体分离,Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层析及Hypersil C18柱反相色谱纯化,获得纯度在95%以上,内毒素含量小于10EU/Mg的高纯度的重组人Leptin.Western-blot鉴定表明,纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异结合;蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致.纯化产物经复性处理,其分子中Cys96和Cys146形成二硫键.体内活性检测显示,纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB/c小鼠的进食和体重增长,提示其具有明显的生物学活性.     

gp350胞外段基因表达载体的构建与表达

目的 构建gp350与C3d融合基因表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 以pGEX-gp350为模板,经PCR获得长846bp的gp350胞外段(25-870),将该扩增片段插入pSG.SS.C3d3.YL载体,构建pSG.SS.gp350.C3d3.YL表达质粒.经限制性内切酶鉴定和DNA序列测定证实后,将该质粒转染Hela细胞,检测其体外表达.结果 免疫细胞化学分析结果表明转染细胞有目的 分子的表达. 结论 构建的重组载体可在真核细胞内正确表达,这为基于gp350的鼻咽癌预防性疫苗下一步的动物实验奠定了基础.     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

maspin/pEFIRES-N表达载体的构建及应用

目的构建maspin/pEFIRES-N表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法 PCR扩增maspin基因全长,将表达载体pEFIRES-N用EcoRⅠ XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,稳定转染到肝癌高转移细胞株mHCC-97中进行表达,检测稳定转染前后maspin表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到pEFIRES-N表达载体,并在肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达,抑制了肝癌MHCC-97细胞增殖及浸润.结论成功构建了maspin/pEFIRES-N表达载体,能在真核细胞中表达.     

凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体的构建及表达

目的:构建凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livin。方法:设计合成扩增Livinα和Livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞Livinα和Livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达Livinα或Livinβ蛋白。结论:成功构建Livinα和Livinβ真核表达载体。     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

小鼠GITR真核表达载体的构建及表达

目的:构建小鼠GITR(mGITR)的真核表达载体,转染COS-7 细胞表达小鼠GITR 蛋白.方法:用TRIzol 试剂抽提小鼠脾细胞总RNA,经RT-PCR 扩增出GITR 全长基因,构建真核重组载体pIRES2-EGFP-mGITR,经鉴定后采用脂质体介导DNA 法转染COS-7 细胞.结果:从小鼠脾细胞中成功扩...     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.