氯通道阻断剂对NMDA诱导培养海马神经元凋亡的保护作用

NMDA受体的激活在缺血性脑损伤神经元死亡中起重要作用。本研究利用NMDA诱导大鼠培养海马神经元凋亡．模拟建立缺血性脑损伤的细胞模型,观察了3种氯通道阻断剂对神经元凋亡的保护作用。离体培养12d的SD大鼠海马神经元．在NMDA处理前和处理后使用氯通道阻断剂,对神经元的存活率影响不同,仅NMDA处理前给药才有保护作用。SITS对NMDA诱导神经元凋亡的保护作用最强并有浓度依赖性．D1DS次之,NPPB没有明显的保护作用。结果表明．SITS和D1DS可阻断NMDA的毒性效应．作用机制可能与NMDA的效应和氯通道活动均被阻断有关。     

缺血损伤对大鼠海马神经元形态及密度的影响

应用Ｎｉｓｓｌ法和Ｇｏｌｇｉ法观测了正常大鼠（１组）及脑缺血３０ｍｉｎ，６０ｍｉｎ，９０ｍｉｎ大鼠（２，３，４组）的海马神经元的形态及密度，结果表明，缺血后海马内大部分神经元出现胞体严重空泡化，树突结节化，树突棘脱落，随着缺血时间延长，各种变化加剧，３，４组海马的神经元密度明显小于１，２组（Ｐ〈０．０１），而在Ｉ组与Ⅱ组之间Ⅲ组与Ⅳ组之间均无显著差异（Ｐ〉０．０５）。本文对神经元的缺血损伤机理，神     

氯胺酮对缺氧大鼠海马神经元钙激活钾通道的作用

目的 研究氯胺酮对缺氧马神经元钙激活钾通道（KCa通道）的作用,以揭示氨胺酮抗缺血性脑损伤的电生机机制。方法 应用膜片钳制技术记录缺氧海马神经元上的单通道电流活动,经P－clamp软件进行微机采样、储存数据和数据的分析处理。结果 氨胺酮对缺氧海马神经元KCa通道具有明显激活作用：增加通道开放概率P0,缩短通道关闭时间。结论 氯胺酮对海马神经元KCa通道的作用可能为氯胺酮治疗脑缺血损伤的另一种重要机制。     

氯通道阻断剂NPPB拮抗离体灌注大鼠心脏钙矛盾处理引起的心肌损伤

目的观察氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸（NPPB）对钙矛盾处理造成离体灌注大鼠心脏功能障碍和心肌细胞死亡的影响。方法钙矛盾处理由3 min无钙液、30 min有钙液接替灌注完成,实验同步记录左室压,并检测心肌损伤面积的大小。结果与正常对照组相比,钙矛盾组左室舒张末压（LVEDP）显著抬高,左室发展压（LVDP）、心室变化速率（dp/dt）为0,心脏几乎不存在活性组织;于无钙液灌注前2 min、无钙液灌注期和复钙后前5 min给予20μmol/LNPPB处理后,10例心脏的心肌损伤面积均显著缩小,其中4例LVDP大于2 mm Hg,LVEDP有降低趋势、dp/dt有升高趋势;与正常对照组相比,20μmol/L NPPB处理的对照心脏于灌流结束时左室功能、心肌损伤面积没有显著改变。结论 NPPB具有减轻钙矛盾处理引起的心肌损伤,保护心功能作用,提示氯通道参与是钙矛盾处理引起的心肌损伤。     

NO在大鼠海马慢性应激损伤中的作用

目的 探讨NO在海马慢性应激损伤中的作用。方法 采用微量注射法、Nissl染色法和生化检测观察海马微量注射N—硝基左旋精氨酸(L—NNA)对慢性应激大鼠海马神经元数量、NO和丙二醛(MDA)含量、一氧化氮合酶(NO6)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。结果 海马内微量注射L—NNA对慢性应激引起的海马神经元数量减少，NO和MDA含量增多，NOS活性增高及SOD活性下降有明显改善作用。结论 NO参与了慢性应激对海马的损伤，可能与其产生的自由基损害有关。     

短暂性脑缺血再灌注损伤对老年大鼠海马脑组织水通道蛋白4表达及神经元凋亡的影响

目的 探讨短暂性脑缺血再灌注损伤对老年大鼠海马脑组织水通道蛋白4表达及神经元凋亡的影响.方法 健康老年Wistar大鼠160只按Pnsinelli方法建立四动脉阻断法全脑缺血模型,随机分为脑缺血1 min组、脑缺血3 min组、脑缺血5 rain组和假手术组,每组40只.每组又按再灌注时间分为再灌注12 h、1 d.2 d.3 d和7 d 5个亚组,每个亚组8只.应用干湿重法计算脑含水量、组织病理学染色观察神经元微观结构,免疫组化方法观察AQP4的表达,TUNEL法检测神经元凋亡.结果 缺血1 rain及3 min组各再灌注时间点脑组织含水量及AQP4表达与假手术组比较差异无统计学意义(P0.05),而缺血5 min组各再灌注时间点脑组织含水量及AQP4表达与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05).假手术组及缺血1 min组有少量神经元凋亡,缺血3 min及缺血5 min后海马区神经元凋亡明显增加.神经元凋亡在缺血后再灌注12 h即有表达,在1 d达高峰,持续至第3天开始下降.结论 老年脑对缺血再灌注损伤的敏感性增加,短暂的脑缺血即可造成老年大鼠脑组织的水肿和AQP4表达及神经元凋亡的增加,神经元的凋亡较脑水肿或AQP4表达对缺血更为敏感;再灌注后神经元凋亡高峰出现得早,持续时间长.     

全脑缺血大鼠海马CA1区神经元凋亡和神经生长因子的保护作用

目的：研究大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区P75NTR、Bcl-2、Bax表达及细胞凋亡的变化及神经生长因子（NGF）对它们的影响，进一步探讨该区神经元短暂脑缺血后产生凋亡及NGF对神经元保护作用的可能机制。方法：通过四血管闭塞法建立大鼠全脑缺血-再灌注模型，侧脑室注射NGF，免疫组织化学法检测P75NTR、Bcl-2、Bax表达的情况，TUNEL法检测神经元凋亡。结果：对照组海马CA1区无P75NTR、Bcl-2阳性染色和凋亡细胞，可见少量Bax表达，再灌注后该区Bcl-2始终阴性表达，Bax则表达增加，出现P75NTR阳性表达和细胞凋亡；在NGF给药组，再灌注后海马CA1区Bcl-2出现阳性染色，而Bax及P75NTR的表达则明显降低，细胞凋亡亦明显减少。结论：再灌注后海马CA1区P75NTR、Bax的表达增加可能是神经元产生凋亡的机制之一，NGF抑制脑缺血后细胞凋亡的作用可能是通过对其受体的调节，从而调节Bcl-2和Bax的表达来实现的。     

nNOS在缺血性老年大鼠海马及皮层神经元中的表达及超微结构变化

目的 研究神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS)在血性老年大鼠海马及皮层神经元中的作用并观察其超微结构变化。方法建立老年大鼠脑缺血动物模型,在不同的时间点进行nNOS免疫组化染色和透射电镜观察。检测海马及皮层神经元nNOS的观察其受损情况。结果 缺血30min后再灌注12h组nNOS活性显著升高。而假手术组、缺血30min即刻取材、再灌流1h,96h组nNOS几乎无表达;6h少量表达;24h和48h组中量表达;再灌流超过24h组神经元损伤较重。结论 NO在脑缺血发生中对海马及大脑皮层神经元具有毒性作用。     

尼可刹米对新生大鼠海马神经元钠通道的影响

目的:观察尼可刹米对新生大鼠海马神经元电压依赖性钠通道的影响.方法:制备大鼠海马脑组织切片,灌流含5 mg/L尼可刹米的人工脑脊液,应用全细胞膜片钳技术记录给药前、给药后10 min脑组织切片海马神经元电压依赖性钠电流,绘制给药前后钠通道的钠电流一测试电压(I-V)曲线、稳态激活曲线和稳态失活曲线.结果:尼可刹米在脑电位-50-+20 mV范围内增大钠电流.尼可刹米使钠通道稳态激活曲线中钠通道半数激活电压由(-34.6±3.07)mV变为(-37.63±3.37)mV(t=3.38,P=0.02),曲线向超极化方向变化;尼可刹米使钠通道的稳态失活曲线中钠通道半数失活电压由(-43.36±3.06)mV变为(-33.24±2.05)mV(t=6.13,P=0.002),曲线向去极化方向变化.结论:增加电压依赖性钠电流可能是尼可刹米兴奋中枢神经元的作用机制之一.     

钙激活钾通道及ATP敏感性钾通道在海马神经元缺氧超极化中的作用

研究缺氧超极化缺氧海马神经元中的电生理机制,以提示缺氧超极化在脑损伤中的作用。方法：应用膜片钳制技术的细胞贴附式膜片记录缺氧海马神经元的单通道电流活动,经p-CLAMP软件进行采样储存数据和数据的分析处理。结果：缺氧引起钙激活钾通道（KCa通道）和ATP敏感性通道（KATP通道）的激活,增加通道的开放概率。结论：缺氧超极化可能是缺血性脑损伤早期的重要代偿机制。     

TRPC离子通道参与硝普钠诱导海马神经元凋亡

目的 探讨TRPC离子通道在一氧化氮供体硝普钠(SNP)诱导原代培养海马神经元凋亡中的作用.方法 原代培养的海马神经元作为空白对照组,实验组分为3组,分别为原代培养神经元中加入SNP;SNP TRPC通道阻断剂组;SNP TRPC通道激活剂组.细胞处理24 h后MTT比色法检测各组细胞存活率,Hoechest33342荧光染色观察细胞凋亡.结果 SNP处理24h,神经元存活率为67.4％;与空白对照组有显著差异(P<0.05),SNP TRPC阻断剂组神经元存活率分别为102％、92.7％,与SNP组有显著差异(P<0.05);而SNP TRPC激活剂组神经元存活率为56.9％.与SNP组有统计学差异(P<0.05);单纯给予TRPC阻断剂或激动剂对神经元存活率无明显影响.荧光显微镜下观察.空白对照组神经元胞核均匀蓝染;SNP处理组胞核明显固缩、凝聚,可见凋亡小体;SNP TRPC激动剂组可见大量凋亡细胞;而SNP TRPC阻断剂组胞核均匀蓝染.结论 TRPC离子通道参与SNP诱导海马神经元凋亡.     

TEA敏感型钾电流在gp120引起的海马神经元损伤中的作用

目的:探讨gp120对TEA敏感型钾电流的作用以及该电流在gp120引起神经元损伤中的作用。方法 :分离怀孕18d SD大鼠胎鼠的海马神经元作为实验对象,分为对照组和gp120处理组,利用全细胞膜片钳的方法记录外向延迟钾电流的变化,通过MTT和TUNEL的方法分别观察gp120处理后神经元的活力和凋亡情况。Western blot观察Kv2.1钾通道的蛋白表达变化以及在TEA敏感型钾电流中的贡献度。结果:gp120能引起外向钾电流明显增大,具有浓度依赖性,其中TEA敏感型成分参与了外向钾电流的增大。此外,MTT和TUNEL实验发现,gp120能引起神经元活力的下降和凋亡,而钾通道抑制剂TEA能缓解由gp120引起的细胞损伤。进一步实验表明,gp120可上调TEA敏感型成分中Kv2.1钾通道的表达,且其特异性抑制剂Gx TX-1E能显著抑制神经元中TEA敏感型钾电流成分。结论:TEA敏感型钾电流参与了gp120引起的神经元损伤过程,其重要组成成分Kv2.1通道蛋白上调,提示该通道蛋白可能参与了gp120引起的细胞损伤。     

大鼠海马锥体神经元延迟整流钾电流的发育变化

目的 研究大鼠海马锥体细胞延迟整流钾电流(Ik)在出生后不同发育阶段的变化.方法 采用膜片钳全细胞记录模式比较3个不同年龄组,即出生后7～10天(P7-10组)、25～30天(P25-30组)和56～60天(P56-60组)Wistar大鼠急性分离的海马锥体神经元Ik的变化及通道动力学和药理学特征.结果 随着动物的发育,Ik的电流密度上调,由p-10的(32±13)pA/pF逐渐增加到P25-30的(54±20)pA/pF和P56-60的(70±18)pA/pF.随年龄增大,Ik的激活曲线左移,其半数最大激活电位(V1/2)由-12.2mV逐渐增加到-17.8 mv,而斜率因子无明显变化.四乙铵(TEA)可剂量依赖性地抑制Ik,其中P7-10组的Ik对低浓度的TEA(2和5mmol/L)较P25-30及P56-60组更敏感.结论 在大鼠海马锥体神经元的发育过程中Ik逐渐增加,并伴有通道激活动力学和药理学特性的改变.上述变化可能与海马锥体神经元的成熟以及认知功能的日益完善有关.     

Orexin-A对体外培养的大鼠海马神经细胞凋亡的影响

目的:研究Orexin-A对体外培养的海马神经细胞凋亡的影响及其可能机制.方法:取体外培养的大鼠海马神经细胞分为7组,分别给予0,1.0,10.0,100.0 nmol/L及1.0、10.0、100.0 μmol/L的Orexin-A培养.另取大鼠海马神经细胞,预先加入Orexin-A受体(OX1R)阻断剂SB334867,然后同法分组及处理.观察海马神经细胞的形态学变化;采用Western Blot、逆转录PCR(RT-PGR)法检测OX1R蛋白和mRNA的表达;原位末端标记染色评价细胞凋亡率;Fura-2/AM荧光比值成像技术测定游离钙离子浓度[Ca2+]i.结果:随着Orexin-A浓度的增大,海马神经细胞凋亡增加(F=137.49,P＜0.01),同时呈剂量依赖性地触发[Ca2+]i的升高(F=961.44,P＜0.01),但是OX1R蛋白及mRNA的表达无明显变化.SB334867可以部分阻断这种现象.结论:大剂量Orexin-A对体外培养的海马神经细胞有促凋亡作用,其机制可能与增加了细胞内Ca2+浓度蓄积有关.     

脑神康胶囊对缺氧复氧损伤大鼠海马神经元凋亡的影响

目的观察脑神康胶囊对缺氧复氧损伤大鼠海马神经元凋亡及其Bcl 2、Bax mRNA表达的影响。方法随机将原代培养大鼠海马神经元分为对照组、损伤组、中药低、中、高浓度组。对照组正常培养,损伤组及中药组建立缺氧复氧损伤模型,中药各浓度组于复氧时换以不同浓度含药血清的培养液,采用MTT法测各组细胞存活率,采用流式细胞仪检测凋亡率,采用RT PCR法检测Bcl 2和Bax mRNA的表达并计算两者比值。结果损伤组细胞存活率及Bcl 2 mRNA表达明显下降(P均＜0.01),凋亡率及Bax mRNA表达显著升高(P均＜0.01),Bcl 2/Bax降低(P＜0.01);中药各浓度组较损伤组细胞存活率及Bcl 2 mRNA表达均升高(P均＜0.01),凋亡率及Bax mRNA表达降低(P＜0.01,P＜0.05),Bcl 2/Bax增加(P＜0.01),且呈明显的剂量依赖性。结论脑神康胶囊对海马神经元缺氧复氧损伤有明显的保护作用,其作用机制可能与其调节凋亡相关蛋白、减少凋亡密切相关。     

大鼠海马神经元癫(癎)模型中神经元凋亡及caspase 3基因的表达

目的:探讨体外培养大鼠海马神经元癫(癎)模型中神经元丢失的分子机制.方法:制备大鼠海马神经元癫(癎)样放电细胞模型,以膜片钳全细胞记录对模型放电进行检测,采用RT-PCR法克隆大鼠全长caspase 3 cDNA,采用原位杂交和流式细胞术检测模型中caspase 3基因表达和神经元凋亡情况.结果:成功克隆获得大鼠全长caspase 3 cDNA,其序列与文献报道一致.模型组海马神经元癫(癎)样放电3 h后caspase 3基因表达开始增多,6 h后凋亡细胞开始明显增加,两者均较对照组明显增加.结论:癫(癎)样放电可能启动神经元caspase 3表达,继而介导神经元凋亡.     

Akt信号途径参与二氮嗪预处理抑制缺氧复氧损伤大鼠海马神经元的凋亡

目的 探讨二氮嗪(DZ)预处理能否通过上调Akt信号增强Bcl-2表达、抑制Bax表达发挥抗凋亡作用.方法 离体培养9～10 d SD大鼠海马神经元分为正常对照组(A组)、缺氧组(B组)、缺氧+DZ 100 μmol/L组(c组)、缺氧+DZ 100 μmol/L+5-羟癸酸100 μmol/L组(D组)、缺氧+DZ 100 μmol/L+LY294002 50 μmol/L组(E组),自缺氧前2 d开始,神经元接受DZ预处理,每天1次,每次1 h.每次实验,每组16孔或2皿细胞,实验重复3次.比较缺氧4 h复氧48 h各组海马神经元的活力、凋亡率、Akt、Bcl-2和Bax蛋白的表达程度.结果 缺氧复氧后C组吸光度值较B、D、E组显著增高(P＜0.05);其他缺氧各组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).C组凋亡率较B、D、E组显著减低(P＜0.05).C组Akt、Bcl-2表达较B、D、E组强烈(P＜0.05),Bax表达则减弱(P＜0.05).B、D、E组问比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DZ可经Akt信号通路上调Bcl-2/Bax蛋白比值而抑制缺氧复氧损伤大鼠海马神经元的凋亡.     

大鼠癫癎持续状态后海马神经元凋亡的研究

目的：通过美解眠诱导鼠癫癎持续状态后观察海马神经元的细胞凋亡现象。　材料和方法：给ＳＤ大鼠腹腔注射美解眠（２０ ｍ ｇ／ｋｇ）,２４ ｈ 后在光镜和电镜下观察大鼠海马神经元的形态学改变,并以ＤＮＡ 末端标记法（ＴＵＮＥＬ）检测海马神经元的凋亡。　结果：ＳＤ大鼠注射美解眠后出现典型的癫癎发作,光镜和电镜下可观察到海马神经元有典型的细胞凋亡现象,包括细胞体皱缩、胞质浓缩、染色质凝聚成块状、有边集现象, 同时有少量凋亡小体形成。ＴＵＮＥＬ检测发现海马结构内可见ＴＵＮＥＬ染色阳性细胞,其分布不均匀,有区域性差异,以ＣＡ３ 区最为多见。致癎组海马ＣＡ３ 区ＴＵＮＥＬ阳性细胞数的平均百分率（７５．１４％ ）与对照组（９．４％ ）相比有极显著性差异（Ｐ＜ ０．０１）。　结论：癫癎发作可诱导大鼠海马神经元发生凋亡。     

缺血再灌注致心律失常大鼠模型钙调蛋白介导的L型离子通道电流的变化

目的：探讨缺血再灌注致心律失常大鼠钙调蛋白（CaM）的变化及其对L型离子通道电流的影响。方法：选取健康SD大鼠48只,以单盲法随机分为4组（n=12）;空白组不做任何处理,模型组以左冠状动脉前降支结扎法制备缺血再灌注致心律失常模型,干预组在制备缺血再灌注致心律失常模型前肌注钙调蛋白抑制剂W-7（100μmol／kg）,假手术组仅进行开胸手术和动脉套线,无结扎。模型制备成功后,取大鼠心脏组织,以免疫印迹法检测L型钙离子通道主要亚型CaV1．2功能决定性亚单位α1C和CaM的表达水平;同时分离大鼠心肌细胞,以膜片钳技术进行L型离子通道电流（ICa,L）测定。结果：模型组大鼠心肌组织的a1C、CaM的表达水平,以及ICa,L均高于空白组和假手术组,差异具有统计学意义（P〈0．05）;较模型组相比,干预组CaM的表达水平和ICa,L均有降低,差异具有统计学意义（P〈0．05）;I—V曲线有所上移,a1C的表达水平比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：ICa,L过激所致Ca抖内流和细胞超载为缺血再灌注后心肌损伤和心律失常的重要因素之一,CaM在该病理过程中能够发挥不依赖于L型离子通道表达水平的调节作用,可作为其临床治疗的新靶点。