伏马菌素B1对人外周血单个核细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的影响

目的：探讨伏马菌素B1（FB1）对体外培养的人外周血单个核细胞表面（HPBMc）HLA-I分子表达的影响。方法：采用流式细胞术（FCM）、Western blot及半定量RT-PCR方法，研究不同浓度FB1（10和50μmoL／L）处理后人外周血单个核细胞表面HLA-I分子表达的变化。结果：FCM定量分析结果表明，经FB1处理24h后，两组FB1处理细胞HLA-I的平均荧光强度均较对照组降低（P〈0．05），但是在两个处理组之间无统计学意义。Westernblot也证实了上述结果。在mRNA水平上，分别检测了HLA-I分子3个等位基因HLA-A，HLA-B，HLA—C的表达情况。结果显示，FB1处理后，HLA—A、HLA-B mRNA的表达均没有明显影响，仅HLA-C mRNA的表达较对照组降低。结论：10和50μmol／L FB1处理24h可抑制人外周血单个核细胞表面HLA-I分子的表达。     

TAP1真核表达载体的构建及其对GES-1细胞HLA-I分子表达的影响

目的:构建抗原加工相关转运蛋白TAP1真核表达载体,并观察其对HLA-I分子表达的影响。方法:采用基因重组技术,构建含人TAP1基因全长的pcDNA3.1/V5-His-TAP1真核表达质粒,并采用细胞转染、RT-PCR、Western blot以及流式细胞术(FCM)观察TAP1转染对胃黏膜上皮(GES-1)细胞HLA-I分子表达的影响。结果:以人外周血单个核细胞总RNA为模板,经RT-PCR反应获得人全长TAP1基因,以pcDNA3.1/V5-HisB为载体,经酶切、连接、转化等基因重组技术,构建了含人TAP1基因全长的pcDNA3.1/V5-His-TAP1质粒,并经测序结果证实。以GES-1作为靶细胞进行转染,经RT-PCR和Westernblot证实,转染后TAP1基因表达明显增加,细胞适于所构建的TAP1质粒的转染。进一步检测了TAP1转染对GES-1细胞HLA-I类分子表达的影响。结果发现,TAP1转染组HLA-A、HLA-B、HLA-C(重链)在mR-NA水平表达明显增加,β2m(轻链)mRNA水平无明显影响。FCM及Western blot检测结果表明,TAP1转染可以上调HLA-I蛋白的表达。结论:成功构建了TAP1真核表达质粒,细胞转染后TAP1表达的增加,可引起细胞表面HLA-I分子表达的相应增加,从而证实了TAP1在HLA-I抗原表达以及抗原递呈途径中的重要作用。     

强的松对小儿原发性肾病综合症患者PBMC HLA表达的调节作用

目的: 初步探讨糖皮质激素对外周血单个核细胞(PBMC)人类白细胞抗原(HLA)表达的调控作用.方法: 肾病综合征(NS)患儿PBMC体外经IFN-γ联合PHA 刺激诱导活化,用不同浓度强的松干预,采用流式细胞术检测其PBMC组成性、活化后和强的松处理后HLA-Ⅰ/Ⅱ类分子和HLA-DR7分子的表达量并与正常对照组进行分析比较.结果: (1)体外培养NS患儿及正常人PBMC组成性表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子和HLA-DR7分子,且NS患儿高于正常人(尤以HLA-Ⅱ类分子突出,为正常人的11.78倍,P＜0.01);(2)体外经 IFN-γ联合PHA活化后HLA-Ⅰ/类分子和DR7分子表达增加(P＜0.01);(3)经不同浓度强的松处理后,HLA-Ⅰ/类分子和DR7分子比活化后表达减少(P＜0.01);(4)经不同浓度强的松预处理后,与活化组比较HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子和HLA-DR7表达减少(P＜0.01),对NS患儿的抑制率要高于正常人,并且HLA-Ⅱ类分子表达的抑制作用表现出剂量依赖性(P＜0.01).结论: NS患儿体内存在异常活化的T细胞;糖皮质激素对IFN-γ诱导活化的PBMC HLA表达有抑制作用.     

中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA 分型及与疾病进展分析

目的:分析中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA-A、HLA-B、HLA-C 基因频率以及HLA 基因分型与疾病进展关系。方法:序列特异性引物的PCR 扩增(PCR-sequence specific primer typing,PCR-SSP)对310 名随机中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA-A、HLA-B、HLA-C 基因进行分型,采用HIV Molecular Immunology Database 中HLA Analysis Tools 方法计算等位基因频率。结果:在北京男男同性恋艾滋病感染者队列中,HLA-A*1101(34.52%)基因频率最高,其次为HLA-A*0201(31.94%)、HLA-C*0102(27.10%)以及HLA-A*2402(26.45%)。根据艾滋病感染者1 年内CD4 细胞计数变化来判断感染者是否为快速进展者,结果发现快速进展者134 例,非快速进展者176 例。快速进展者中存在低水平的HLA-B*4403(快速进展者1.12%,非快速进展者为4.27%,P = 0.0276),HLA-B*1511(非快速进展者5.98%,快速进展者2.25%,P =0.0282),HLA-B*5701(非快速进展者2.56%,快速进展者0.37%,P =0.0491)表达,而HLA-C*0304 则在快速进展者中高表达(非快速进展者4.56%,快速进展者8.96%,P =0.0319)。结论:本研究获得了中国北京男男同性恋艾滋病感染者HLA-A、HLA-B、HLA-C 基因的等位基因分布频率数据,并发现HLA-B*4403、HLA-B*1511、HLA-B*5701 与延缓艾滋病疾病进展有关,而HLA-C*0304 则与加速艾滋病疾病进展相关。     

鹰嘴豆芽素A通过PPARα/γ抑制脂多糖诱导猪外周血单个核细胞炎性细胞因子的分泌

目的:研究鹰嘴豆芽素A对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导猪外周血单个核细胞分泌炎性细胞因子的影响。方法:用鹰嘴豆芽素A(50,100μmol/L)处理猪外周血单个核细胞,采用ELISA方法检测其对LPS刺激后细胞分泌肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)的影响,并用RT-PCR法检测这些细胞因子mRNA的表达,用Western blot法检测核因子κB(Nuclear factorκB,NF-κB)由细胞浆移位至细胞核内情况以判断NF-κB活性变化;同时分别用过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α的拮抗剂MK886和PPARγ的拮抗剂GW9662与鹰嘴豆芽素A共同处理猪外周血单个核细胞,观察鹰嘴豆芽素A在PPARα或PPARγ的活性被抑制时对NF-κB活性的影响。结果:鹰嘴豆芽素A能显著降低LPS诱导猪外周血单个核细胞的TNF-α、IL-6的分泌和mRNA的表达;同时鹰嘴豆芽素A显著抑制了LPS诱导猪外周血单个核细胞NF-κB的激活,而此抑制作用均被MK886或GW9662减弱。结论:鹰嘴豆芽素A可通过PPARα和PPARγ抑制LPS诱导猪外周血单个核细胞NF-κB的活化,从而下调LPS诱导的TNF-α、IL-6的生成。     

巨细胞病毒感染细胞的免疫原性分析

目的:检测细胞感染巨细胞病毒后诱导免疫应答的能力.方法:将巨细胞病毒感染人胚肺成纤维母细胞(HELF),抗体标记细胞表面HLA-A2分子,流式细胞术(FCM)检测感染细胞HLA-A02表达强度;将感染的HELF、荷载外源性多肽的自身PBMC以及未感染的HELF,分别与PBMC共同孵育,FCM检测CD8+T细胞内IFN-γ的表达作为应答指标.结果:感染细胞HLA-A分子表达强度较未感染组降低78.24%±19.72%.感染并荷载外源性多肽的HELF诱导产生的刺激应答率,高于单纯巨细胞病毒感染的HELF和荷载多肽的未感染HELF所诱导应答比率.结论:尽管巨细胞病毒下调MHC Ⅰ分子表达,但可能不减弱细胞递呈外源多肽的能力,并足以诱导产生免疫应答.     

维吾尔族妇女宫颈癌人乳头状瘤病毒感染与人类白细胞抗原Ⅰ类基因表达缺失的关系及其意义

目的 研究维吾尔族妇女宫颈癌中人乳头状瘤病毒(HPV)感染和人类白细胞抗原Ⅰ类(HLA-Ⅰ)家族基因HLA-A、B和C表达的关系,探讨HPV感染和HLA-Ⅰ类家族基因表达缺失在宫颈癌演进过程中的作用.方法 收集维吾尔族妇女宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ和宫颈鳞癌患者的新鲜组织标本共78例,提取总RNA,采用半定量RT-PCR方法鉴定HLA-A、B和C基因的mRNA表达水平.提取组织DNA,采用HPV通用引物和HPV分型芯片确定HPV亚型.结果 HLA-A、B和C基因的总体mRNA表达缺失率随着宫颈病变的加重而增加,在宫颈炎组织内为1/12,在CIN及宫颈鳞癌分别占70.0%(14/20)和84.8%(39/46),在恶性程度高的低分化癌组织中高达90.6%(29/32),并与高危型HPV16感染呈正相关(r=0.803,P＜0.01).结论 HLA-Ⅰ类基因的表达缺失是维吾尔族妇女宫颈癌发生的重要标志,而HPV16感染可能是HLA-Ⅰ分子表达缺失的前提条件.     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人外周血单个核细胞TAP-1表达的抑制作用

目的: 探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)对人外周血单个核细胞 (PBMC)中TAP- 1表达的影响。方法: 采用流式细胞仪(FCM)和半定量RT- PCR方法, 从蛋白和mRNA水平上分析不同浓度的DON对体外培养的人PBMC中TAP- 1分子表达的影响及量 效关系。结果: FCM定量检测表明, 用不同浓度的DON处理, 均可一定程度地抑制人PBMC中TAP -1蛋白的表达, 且二者呈显著的负相关 (r= -0. 865,P<0. 01)。半定量RT -PCR检测显示, 不同浓度的DON处理均可抑制人PBMC中TAP -1mRNA的表达。结论: DON可剂量依赖地抑制体外培养的人PBMC中TAP- 1蛋白和其mRNA的表达, 对阐明食管癌高发区被DON污染的粮食与食管癌发生的关系具有重要的意义。     

T-bet基因shRNA真核表达载体的构建及其功能的初步研究

目的:构建靶向Th1细胞特异性转录因子T-bet的小发卡结构RNA(shRNA)的真核表达载体,并评价其功能,为开展T-bet相关性疾病的免疫干预研究奠定基础.方法:设计并合成靶向T-bet的shRNA序列,构建真核表达载体,并转染DC2.4细胞;MTT法检测转染后DC2.4细胞增殖能力,用Realtime PCR和Western blot分别从基因及蛋白水平检测转染前后DC2.4细胞T-bet表达水平变化;Realtime PCR检测IFN-γ的mRNA;流式细胞术(FCM)检测细胞表面CDS0、CD86与MHC Ⅱ类分子表达情况.结果:构建的T-bet靶向shRNA真核表达载体,能够显著抑制DC2.4细胞T-bet的表达,且转染后DC2.4细胞增殖受到抑制,CDSO、CD86及MHC Ⅱ类分子表达下调,IFN-γ mRNA水平显著下降.结论:成功地构建了T-bet shRNA真核表达载体,转染DC2.4细胞后能有效地抑制其T-bet、IFN-γ的表达,影响其抗原提呈功能.     

系统性红斑狼疮病人环孢素A受体mRNA的表达

目的探讨静止期、活动期系统性红斑狼疮病人(SLE)外周血单个核细胞(PBMC)环孢素A受体(CyP) mRNA表达及糖皮质激素对其表达的影响,为临床应用环孢素A辅助治疗该病提供理论依据.方法采用逆转录PCR方法,经凝胶图像半定量分析,检测患者外周血单个核细胞CyP mRNA的表达.结果 SLE病人外周血单个核细胞存在有CyP mRNA的表达,静止期较正常人差异无显著性(p>0.05)意义,但在活动期CyP mRNA的表达较正常人和静止期病人明显降低(p<0.01),地塞米松处理后,活动期病人CyP mRNA的表达水平显著上升(p<0.01).结论 SLE病人有CyP mRNA的表达,但活动期明显下降,糖皮质激素可改善CyP mRNA的表达.     

HLA-A*0201/Kb及MAGE-3基因共转染B16细胞的制备及其在MAGE-3肿瘤疫苗评价中的作用

目的:为了用HLA-A2.1转基因鼠制备荷瘤模型以评价肿瘤疫苗的免疫效果,制备共表达HLA-A*0201/Kb嵌合基因和MAGE-3的B16黑色素瘤细胞.方法:采用基因共转染的方法,将HLA-A*0201/Kb和MAGE-3转染到B16黑色素瘤细胞(B16-HLA-MAGE-3),利用RT-PCR、流式细胞术(FCM)和Western blot检测了HLA-A*0201/Kb和MAGE-3在B16黑色素瘤中的表达;通过测定CTL活性和体内抑瘤实验证实肿瘤抗原MAGE-3可以在B16-HLA-MAGE-3中得到有效加工处理和提呈.结果:RT-PCR、FCM和Western blot检测到HLA-A*0201/Kb和MAGE-3在B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤中的表达;LDH的方法观察到MAGE-3疫苗免疫小鼠脾细胞对B16-HLA-MAGE-3细胞的特异性CTL反应,抑瘤实验也证实,B16-HLA-MACE-3细胞在免疫小鼠体内生长明显受到抑制.结论:MAGE-3基因在B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤细胞中得到表达,并被有效的加工处理、提呈给特异性CD8 T细胞;B16-HLA-MAGE-3细胞可以用来制备荷瘤模型,且该方法适合利用转基因小鼠用于人表位疫苗的体内评价.     

TXNIP/NLRP3炎性小体通路在COPD患者机体炎症反应中的作用研究

目的:探讨TXNIP/NLRP3炎性小体通路在COPD患者发病机制中的可能作用。方法:选取2017年11月至2018年5月住院的40例COPD患者为急性加重期组,其经过治疗进入稳定期后纳入稳定期组,40例健康体检者为对照组。荧光定量PCR法测定外周血单个核细胞中TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA水平,Western blot法检测外周血单个核细胞中TXNIP及NLRP3蛋白表达水平。结果:(1)COPD患者急性加重期组NLRP3、TXNIP的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组(P0. 05)和稳定期组(P0. 05); COPD患者稳定期组的NLRP3 mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组(P0. 05)。(2)相关性分析:急性加重期组NLRP3 mRNA表达量与FEV1%pred、FEV1/FVC负相关;急性加重期组和稳定期组的NLRP3 mRNA、TXNIP mRNA表达量均与CAT评分正相关。结论:TXNIP/NLRP3炎性小体通路参与COPD患者的机体炎症反应。     

急性髓细胞性白血病患者外周血单个核细胞CD28 mRNA的表达

背景：大量研究显示,肿瘤患者外周血T细胞表面共刺激分子CD28蛋白表达存在差异,提示共刺激通路异常可能与恶性肿瘤的发生进展有关。 目的：观察急性髓细胞性白血病外周血单个核细胞共刺激信号分子CD28 mRNA在中的表达。 方法：急性髓细胞性白血病患者80例,其中M0型7例,M1型6例,M2型18例,M3型15例,M4型17例,M5型9例,M6型8例。并根据急性白血病疗效标准将80例患者分为完全治愈组、缓解组、未缓解组。采用Taqman探针实时荧光定量PCR检测80例患者及76名健康人群外周血单个核细胞CD28 mRNA的表达。 结果与结论：急性髓细胞性白血病外周血单个核细胞M1,M3和M4亚型中的CD28 mRNA表达量低于健康人群 (P< 0.05);急性髓细胞性白血病未缓解组中CD28 mRNA低于健康人群 (P < 0.05),完全治愈组和缓解组中CD28 mRNA表达与健康人群差异无显著性意义。说明急性髓细胞白血病患者外周血单个核细胞存在CD28 mRNA表达缺陷,并与临床分期、病情进展及预后有关。     

巨细胞病毒特异性免疫应答体外检测系统的建立

目的 以巨细胞病毒(CMV)感染的成纤维母细胞为抗原提呈细胞,建立CMV特异性细胞免疫应答的体外检测模型.方法 将CMV-AD169、RV-TB40E-4突变株分别感染人胚肺成纤维母细胞(HELF),流式细胞仪(FCM)检测感染细胞HLA-A * 0201表达强度;将感染的HELF、荷载外源性多肽的自身外周血单个核细胞(PBMC)以及未感染的HELF分别与PBMC共同孵育,FCM检测CD8+ T细胞内IFN-γ的表达作为应答指标.结果 CMV-AD169感染细胞HLA-A * 0201表达强度较未感染组降低78.24%±19.72%,而突变株病毒不影响其表达,而且对AD169感染的HELF无应答的PBMC却对突变株病毒感染的细胞显示出了强阳性应答.AD169感染并荷载外源性多肽的HELF产生的刺激应答率,是感染的HELF和荷载多肽的未感染HELF所诱导应答比率的总和.结论 CMV-AD169下调MHG Ⅰ分子表达,但不减弱细胞提呈外源多肽的能力.RV-TB40E-4是US2-6/US11基因被删除的CMV突变株,不抑制MHC Ⅰ分子表达,从而代表了一种更适宜研究CMV特异性免疫应答的工具.     

MICA基因研究进展及与疾病的关系

MICA基因在人类位于6p HLA-Ⅰ类基因区HLA-B位点着丝粒端的46kb左右,其组成、表达和产物与HLA-Ⅰ类基因不同。该基因包含6个外显子,编码的蛋白分子结构域与经典的Ⅰ类分子α链相似,包括3个胞外结构域:α1、α2和α3,加上跨膜区和胞质区,不含β2m。MICA大量表达于上皮细胞和纤维母细胞的表面,在T、B细胞表面不表达,但在大多数上皮性肿瘤细胞表面都有表达。MICA分子与其配体NKG2D受体结合后可以激活NK细胞、Vδ1γδT细胞等,参与天然免疫应答。现已发现MICA与某些肿瘤和免疫相关性疾病(如白塞氏病、1型糖尿病)存在关联,并且在肿瘤和某些疾病的发展中起着重要作用。     

维生素D3对人外周血单个核细胞CCR5 mRNA表达的影响

目的观察不同浓度1α,25-(OH)2-D3对外周血单个核细胞CCR5 mRNA表达的影响及时间效应,旨在探讨1α,25-(OH)2-D3治疗疾病的可能机制。方法应用反转录-聚合酶链反应技术分别检测不同浓度(1×10-5、1×10-6、1×10-7 mol/L)1α,25-(OH)2-D3对外周血单个核细胞CCR5 mRNA表达的影响,同时检测每个浓度作用不同时间(6、12、24、48 h)对外周血单个核细胞CCR5 mRNA表达的影响。结果不同浓度1α,25-(OH)2-D3作用不同时间,对人外周血单个核细胞CCR5 mRNA表达均有不同程度抑制作用,呈现一定的浓度和时间依赖性,当浓度为1×10-5 mol/L的1α,25-(OH)2-D3处理人外周血单个核细胞48 h后该作用达高峰(P<0.05)。结论 1α,25-(OH)2-D3可在转录水平抑制CCR5表达,这可能是1α,25-(OH)2-D3治疗疾病的作用机制之一。     

人外周血活化淋巴细胞中Survivin蛋白表达的分子机制研究

目的:探讨活化淋巴细胞中Survivin蛋白诱导表达的信号转导通路、分子级联反应和生物效应,揭示Survivin蛋白表达调控的分子机制.方法:用PHA和rhIL-2刺激培养人外周血单个核细胞,附加JAK抑制剂-AG490的处理,以Western blot检测Survivin和相关蛋白的表达;以流式细胞术(FCM)分析细胞周期和细胞分裂增殖.结果:刺激培养的细胞按照时序先后出现的分子和细胞学反应为:Stat3和Stat5磷酸化→CyclinD3、CyclinE蛋白水平上调→细胞进入S期及Survivin蛋白起始表达→细胞有丝分裂及Survivin蛋白表达水平增加.AG490对于上述反应均呈现明显的抑制作用,但对周期抑制蛋白P21和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平没有影响.结论:Survivin蛋白的表达依赖JAK-Stat信号转导通路的早期活化,通过上调CyclinD3和CyclinE周期蛋白水平,启动细胞周期的运行,诱导Survivin蛋白的周期时相依赖性表达,参与细胞有丝分裂与增殖.     

北方汉族人群HLA-A2亚型分布及p53的合成肽体外诱导CTL反应

目的 研究北方汉族人群中HLA-A2亚型的分布及树突状细胞提呈基于p53基因合成肽体外诱导特异性T杀伤细胞(CTL)反应的影响.方法 利用PCR-SSP技术分析北方汉族人群中HLA-A2基因型及其亚型的分布,并在适当A2亚型背景下,选择与HLA-A201分子具有高亲和性的2个来自p53蛋白及1个来自HBV核心抗原的蛋白合成多肽,将其分别负载到经体外GM-CSF+IL-4刺激增殖的人脐带血树突状细胞(DC)上,诱导自身外周血单个核细胞(PBMC)多肽特异性CTL反应.结果 200例北京正常个体中共有53例HLA-A2型,其中以A201及A207亚型分布最多,亚型分布较分散;在GM-CSF+IL-4刺激下获得的典型DC培养后期加入TNF-α,可增加其HLA-Ⅰ类及Ⅱ类分子的表达;多肽p53149～157,p53264～272,HBVc18～27均可诱导出HLA-A201分子限制的自身PBMC肽特异性的CTL,然而,只有p53264～272经多次刺激才诱导出HLA-A207分子限制的肽特异性CTL.结论 北京人群HLA-A2基因型分布具有独特性;从人脐带血获得的DC肽疫苗可以使自身p53蛋白多肽抗原打破机体的外周耐受状态而诱导出CTL反应;HLA-A2分子个别位置上氨基酸的差异可显著影响其提呈抗原多肽的能力.     

早期自然流产过程转化生长因子-β1的异常表达

目的 探讨自然流产患者外周血单个核细胞和胎盘组织转化生长因子-β1(TGF-β1)的异常表达.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,半定量检测30例早期自然流产患者、25例正常妊娠妇女、25例正常未妊娠妇女外周血单个核细胞内TGF-β1mRNA表达;采用免疫组织化学技术检测绒毛和蜕膜组织内TGF-β1表达强度.结果 早期自然流产患者、正常妊娠妇女、正常未妊娠妇女3组研究对象外周血单个核细胞表达TGF-β1mRNA相对含量分别为21.5±9.4%、95.7±12.9%、87.0±13.8%,组间比较均有显著性差异(P＜0.05);自然流产组合体滋养层细胞表达TGF-β1显著低于人工流产组(P＜0.01).结论 正常早期妊娠妇女外周血单个核细胞TGF-β1mRNA表达水平较正常未妊娠妇女显著升高,提示TGF-β1对妊娠维护起重要作用;早期自然流产患者外周血单个核细胞TGF-β1 mRNA表达水平及绒毛合体滋养细胞层表达TGF-β1强度均较正常妊娠妇女显著下降,其低水平表达可能与自然流产相关.