重组鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂类淀粉样沉淀分析

目的利用具有天然N-末端的重组鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(chicken cystatin,cC)在毕赤酵母中高效分泌表达,研究淀粉样沉淀倾向。方法通过在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33中甲醇诱导表达cC能与刚果红特异性结合特性和硫磺素T荧光分析聚积方法研究聚集的特性。结果重组cC形成的类淀粉样蛋白的聚集量有明显增加,30 d时,紫外分光光度检测,重组cC为1.21μmol/L,重组cC荧光强度由1.08增至18.05,即聚集程度增加。结论野生型cystatin C也有形成淀粉样沉淀倾向。     

轮状病毒SA11衣壳蛋白VP7的毕赤酵母重组表达及IgY的制备

目的 真核重组表达轮状病毒(rotavirus,RV)SA11株VP7衣壳蛋白并制备、纯化其卵黄抗体(IgY).方法 将SA11标准株在MAl04细胞中增殖,收集病毒液.从病毒液中提取RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获得SA11株衣壳蛋白VP7的长度为978 bp的编码基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上,进行测序.将重组体哑克隆到分泌表达载体pPICZαB中,再将重组体转化人大肠杆菌Top10中,用BstXI线性化酶切重组质粒后电转入毕赤酵母X-33中,进行测序.转染成功的菌落再用甲醇诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白抗原,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,用重组蛋白免疫罗曼母鸡,收集鸡蛋,Western blotting鉴定、纯化IsY.结果 细胞增殖液中提取的RNA银染可见11个条带,成功构建了含pPICZαB-SA11 VP7的毕赤酵母X-33,毕赤酵母X-33分泌的融合蛋白被收集、纯化.毕赤酵母X-33表达的SA11 VP7的衣壳蛋白经Western blotting验证与预测蛋白相对分子质量40 200相符.从鸡蛋中提取的鸡的IgY验证为抗VP7的抗体.纯度可达到95%,1个鸡蛋能产10.2 mg的IgY.结论 抗重组RV SA11衣壳蛋白VP7和IgY的成功制备为疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础.     

人防御素-5基因毕赤酵母表达载体的构建及鉴定

[目的]构建人防御素5(HD-5)基因的毕赤酵母表达载体并加以鉴定。[方法]采用PCR技术从人cDNA文库中扩增HD-5基因片段,将HD-5基因扩增产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后连接构成重组质粒,然后转化到E.coliTop10中,筛选阳性克隆,并进行PCR、酶切和序列鉴定。[结果]重组质粒经酶切获得HD-5基因片段大小正确,经序列测定证实HD-5基因正确插入pPICZαA中。[结论]成功构建人防御素5基因的毕赤酵母表达载体。     

人α防御素6毕赤酵母表达载体的构建

[目的]构建人α防御素6(HD-6)酵母表达载体,为研究和解析人α防御素6的功能准备了条件。[方法]采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,将产物分离纯化后经EcoRⅠ和XbaⅠ酶切,并将其插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,以得到重组的酵母表达载体pPICZαA/HD-6,最后进行琼脂糖电泳和酶切鉴定。[结果]从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和酶切结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内。[结论]成功地构建了人α防御素6基因的酵母表达载体pPICZαA/HD-6。     

EB病毒重组抗原Rta蛋白的表达及用于鼻咽癌筛查ELISA方法的建立

目的 制备和表达EB病毒重组抗原Rta蛋白,并建立筛查鼻咽癌的ELISA方法,为鼻咽癌的早期筛查提供科学依据。方法 设计引物扩增BRLF1编码区全长序列,构建重组质粒p PICZαA-BRLF1,电转入毕赤酵母GS115,筛选His+Mut+表型转化子并用甲醇进行诱导表达和纯化;建立Ig G/Rta抗体的ELISA检测技术,用于300例鼻咽癌患者和200例健康对照者血清的筛查,对检测结果进行评价。结果 成功构建p PICZαA-BRLF1重组质粒;目的蛋白在毕赤酵母GS115中高效分泌表达(50%),蛋白电泳显示在66.0 k Da处有相应条带;同时Western-blot也证明其有良好的免疫活性;利用该重组Rta蛋白建立的ELISA检测方法对鼻咽癌检测阳性率显著高于Ig A/VCA试剂盒(P0.01)。结论 本研究构建了EB病毒重组抗原Rta蛋白的真核表达载体,表达外源蛋白产量高,免疫活性好,可用于Ig G/Rta ELISA检测技术研究,适合于鼻咽癌的大规模筛查和早期诊断。     

PCR点突变改造人透明带蛋白3酵母表达载体

目的:构建人透明带蛋白3的186位氨基酸突变体重组质粒并鉴定。方法:通过PCR点突变改造人透明带蛋白3的Kex2位点,构建pPICZα-hZP3186S突变载体。结果:经DNA测序表明,ZP3基因的556～558bp处碱基由AGG突变为TCC,读码框正确。结论:成功构建了pPICZα-hZP3186S突变载体(186位精氨酸突变为丝氨酸),为重组人ZP3蛋白在毕赤酵母能够分泌性表达奠定基础。     

人TALL-1可溶性功能片段在毕赤酵母中的分泌表达

目的在毕赤酵母系统中分泌表达具有生物活性的人TALL-1基因胞外区片段（sTALL-1）。方法构建酵母重组表达质粒pPIC9K-sTALL-1,电转化法将SacI线性化的重组质粒转导入毕赤酵母菌GS115中,经G418筛选获得高拷贝转化子及表型鉴定后,用含1%甲醇的培养基诱导其分泌表达。结果成功构建酵母重组表达质粒pPIC9K-sTALL-1;甲醇诱导表达后,sTALL-1在酵母培养基中得到分泌表达;Westernblot和ELISA检测证实重组产物可以结合其特异抗体;MTT检测证实其对Hela细胞具有细胞毒效应。结论在毕赤酵母系统中实现了人sTALL-1的分泌表达。     

汉坦病毒G1糖蛋白毕赤酵母表达系统的构建

目的 构建汉坦病毒HTN型和SEO型G1糖蛋白的毕赤酵母表达系统.方法 应用RT-PCR法扩增汉坦病毒Z10株和L99株编码G1包膜糖蛋白的基因,将扩增产物分别与pMD 18-T simple载体连接,经序列分析后双酶切,定向克隆入载体pPICZoαA,继而用BstXI酶切线性化重组质粒并电转化入P.pastoris X33感受态细胞,用Zeocin筛选转化子进行鉴定.结果 PCR扩增产物Z10株为1 937bp、L99株为1 991bp,与T载体相连测序结果与GenBank相应序列比较,核苷酸序列同源性分别为99.5％和99.7％,其编码蛋白质二级结构均无改变.定向克隆毕赤酵母表达载体获得pPICZαA-Z10G1和pPICZαA-L99G1,分别电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株PpX33-Z10G1和PpX33-L99G1,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符.结论 成功构建汉坦病毒HTN型和SEO型G1糖蛋白毕赤酵母表达系统,为进一步研究奠定基础.     

人防御素5基因毕赤酵母重组表达系统的构建

[目的]构建人防御素5(HD5)基因毕赤酵母表达系统,为进一步表达HD5基因提供理论依据和实验基础. [方法]构建好的毕赤酵母重组表达质粒pGAPZaA/HD5经Sac I线性化后应用LiCl法转化毕赤酵母菌株GS115感受态,Zeocin平板筛选,PCR鉴定转化子. [结果]线性化的重组质粒pGAPZαA/HD5成功转化进入毕赤酵母感受态,PCR鉴定结果与预期相符. [结论]成功构建HD5基因毕赤酵母表达系统.     

人源抗HBsAg抗体Fab段在酵母中的表达

目的探索抗体在毕赤酵母中表达的可能性.方法首先构建既可在体外构建多拷贝、又可于体内筛选多拷贝的分泌型酵母表达载体-pD89,在此基础上插入抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)人源抗体Fab段的基因,电转化后,经G418筛选,得到阳性重组克隆.结果聚丙烯凝脉电泳(SDS-PAGE)检测证明,甲醇诱导后,阳性重组克隆可分泌表达分子量约50 KD的蛋白,免疫印迹实验证实,该蛋白为人源抗体Fab段.结论ELISA结果显示,表达的Fab段能够与HBsAg结合.