牡荆素人工抗原的合成与免疫原性的鉴定

目的合成牡荆素的人工抗原,并对其免疫原性进行了鉴定。方法利用高碘酸钠氧化法偶联牡荆素制备牡荆素-牛血清白蛋白的免疫抗原和牡荆素-卵清蛋白的包被原;用紫外分光光度法和薄层色谱法鉴定小分子与载体蛋白偶联反应,并用间接ELISA测定免疫抗原免疫小鼠抗体效价,间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测抗体特异性。结果紫外扫描和薄层色谱结果表明牡荆素与牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联成功,小鼠经牡荆素-牛血清白蛋白免疫后,体内产生了抗牡荆素抗体,效价在1∶16 000以上,线性检测范围为0.028 8~18μg/m L。结论合成的牡荆素人工抗原和专属酶联免疫分析法可用于后续的单克隆抗体的制备。     

葛根素单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法建立

采用过碘酸盐氧化法,将葛根素半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,得到免疫抗原葛根素-BSA和包被抗原葛根素-OVA.葛根素-BSA常规免疫程序免疫BALB/c小鼠,3次免疫后检测小鼠血清的效价和特异性.加强免疫后取小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,采用单克隆抗体筛选技术,筛选得到抗葛根素单克隆...     

不同偶联率绿原酸全抗原的免疫原性研究

目的:研究不同偶联率人工抗原绿原酸-牛血清(CGA-BSA)的免疫原性,为确定绿原酸全抗原的致敏性研究提供技术和物质基础。方法:将不同数量的CGA与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联,制得不同偶联率的完全抗原后,用这些抗原免疫BALB/c小鼠和SD大鼠,制备抗血清,通过ELISA法检测其IgE抗体和组胺水平,并对不同偶联率的CGA-BSA进行被动皮肤过敏实验(PCA),测定其抗体效价。结果:CGA-BSA偶联率为20时所免疫的BALB/c小鼠产生的IgE和组胺抗体水平最高。PCA实验也证明偶联率为20的CGA-BSA致敏动物产生的IgE抗体滴度比其他偶联率的CGA-BSA致敏动物产生的IgE抗体滴度高,组胺含量也高于其他组。结论:CGA-BSA的偶联率为10~20时具有较好的免疫原性,可应用于绿原酸免疫原性的鉴定,其中以偶联率20的CGA-BSA免疫原性最好。     

紫杉醇完全抗原的合成鉴定及免疫原性分析

目的 制备红豆杉属植物中抗癌成分紫杉醇(paclitaxel,TAX)的人工抗原及抗血清,为获取分泌抗紫杉醇抗体的单克隆细胞系及分离单链抗体基因、进而以之提高植物中紫杉醇的量,及建立快速检测TAX的酶联免疫吸附测定(ELISA)法提供技术基础.方法 将7-木糖基紫杉醇(7-xylotaxol,7-xyl-TAX)经NalO4氧化打开糖环,与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)反应偶联,制得半抗原-载体蛋白复合物后,用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定其中结合的半抗原数目;以此抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清.并通过ELISA法检测其抗体效价和特异性.结果 合成的人工抗原TAX-BSA中TAX与BSA的结合比约为4～5:1;免疫小鼠到特异针对TAX的抗血清,TAX抗体的效价为1:3 200.结论 成功地合成了TAX的人工抗原,且该抗原有较好的免疫原性.     

龙胆苦苷人工抗原的合成与鉴定

目的为建立龙胆苦苷免疫检测方法,需合成龙胆苦苷(GTP)的免疫抗原和包被抗原。方法将琥珀酸酐与龙胆苦苷中的羟基进行反应,再利用混合酸酐法将龙胆苦苷半抗原与载体蛋白(BSA和OVA)偶联形成龙胆苦苷-载体蛋白人工抗原,进而利用紫外分光光度计法(UV)、红外光谱法(IR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定人工抗原,结合三硝基苯磺酸法(TNBS)测定人工抗原的偶联比率,并免疫小鼠,最后用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗体效价。结果 IR、UV和SDS-PAGE法检测结果均表明龙胆苦苷与载体蛋白偶联成功,TNBS结果表明GTP-BSA(免疫抗原)和GTP-OVA(包被抗原)偶联比分别为9∶1和6∶1,间接ELISA结果表明免疫小鼠血清中抗龙胆苦苷抗体效价均达到1∶12800以上。结论本实验成功合成并鉴定了龙胆苦苷人工抗原,为龙胆苦苷免疫分析提供了实践基础。     

丹酚酸B人工抗原的合成与免疫原性研究

目的制备丹酚酸B（SAB）的人工抗原（SAB-BSA）和包被原（SAB—PLL）并进行鉴定。方法采用碳二亚胺（EDC）法将SAB分别与牛血清白蛋白（BSA）和多聚赖氨酸（PLL）载体偶联合成SAB—BSA和SAB-PLL;采用紫外分光光度（UV）法和薄层色谱（TLC）法对偶联效果进行鉴定,并通过SAB与BSA的吸光值计算出二者的偶联比;利用获得的SAB—BSA免疫小鼠,采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠抗血清内多克隆抗体效价并以间接竞争酶联免疫吸附法（ic—ELISA）检测小鼠抗血清内多克隆抗体的灵敏度。结果所合成的SAB—BSA为BSA和SAB的结合物,且SAB-BSA中无游离SAB-SAB与BSA偶联成功,SAB-BSA偶联结合比为18：1;SAB-BSA刺激小鼠产生的针对SAB的多克隆抗体,效价为1：2×10^3,该多克隆抗体IC50为17．7μg／mL。结论SAB—BSA和SAB—PLL合成成功,可用于SAB单克隆抗体的制备以及SAB快速检测试剂盒的研制。     

人参皂苷Rg1人工抗原的合成及免疫原性鉴定

目的 合成人参皂苷Rg1的人工免疫原和包被原,为后续制备人参皂苷Rg1的单克隆抗体及建立相应的免疫分析方法奠定基础.方法 采用NaIO4氧化法分别合成人参皂苷Rg1免疫抗原(Rg1-BSA)和包被抗原(Rg1-PLL);紫外光谱和薄层色谱法鉴定人工抗原偶联是否成功;用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗体效价,用间接竞争ELISA检测抗体特异性.结果 经紫外光谱和薄层色谱法检测,人参皂苷Rg1与BSA/PLL偶联成功;免疫小鼠后Rg1-BSA可以使小鼠体内产生抗Rg1抗体;利用合成的偶联物成功建立间接ELISA和间接竞争ELISA方法,测得小鼠血清抗体效价在1∶80 000以上,并且所得抗体能特异性结合人参皂苷Rg1.结论 成功合成了人参皂苷Rg1人工免疫原和包被原,可用于下一步的人参皂苷Rg1单克隆抗体制备及建立相应免疫分析方法.     

绿原酸人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

目的 合成绿原酸（chlorogenic acid,CHA）人工抗原,制备CHA多克隆抗体,为制备过敏成分分析的免疫芯片奠定基础。方法 采用碳二亚胺法分别合成CHA免疫抗原（CHA-牛血清白蛋白）和包被抗原（CHA-卵清蛋白）;UV法和TLC法鉴定人工抗原偶联是否成功;间接ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗体效价;间接竞争ELISA方法检测抗体特异性。结果 经UV法和TLC法检测,CHA与BSA偶联成功。血清抗体效价为1∶128 000,CHA-PAbs的质量浓度与抑制率的线性方程为Y＝?0.10 lnX＋1.158,线性检测范围为15.6～250 ng/mL,R²＝0.995,并且和甘草酸、黄芩苷等与其常配伍应用的中药化合物均无交叉反应。结论 成功制备了灵敏度高、特应性好的CHA多克隆抗体,为CHA的微量检测和过敏性研究提供了实验依据。     

石杉碱甲多克隆抗体的制备及酶联免疫检测方法的建立

目的 制备珍稀药源植物蛇足石杉的活性成分石杉碱甲(huperzine A,HupA)的人工抗原及多克隆抗体,建立快速检测HupA的酶联免疫分析方法.方法 采用戊二醛法,将半抗原HupA与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备人工抗原HupA-BSA和包被抗原HupA-OVA.用HupA-BSA免疫新西兰大白兔,制备抗HupA的抗血清,通过间接ELISA法和竞争ELISA法检测抗血清的效价和特异性.采用Protein A亲和层析法对抗血清进行纯化,以纯化后的多克隆抗体建立HupA的标准竞争抑制曲线.结果 合成的人工抗原HupA-BSA的偶联比为10.8∶1,免疫兔子得到抗HupA的抗血清,其效价为1∶64000,HupA的标准竞争抑制曲线为Y=0.215 1X-0.095 5(R2=0.987 3).结论 成功合成石杉碱甲人工抗原,经过免疫兔子制备抗石杉碱甲的多克隆抗体,建立HupA的酶联免疫检测方法.     

马钱苷人工抗原的合成、鉴定及免疫原性的初步研究

目的首次合成并鉴定马钱苷(loganin)人工抗原,为进一步制备马钱苷单克隆抗体,建立相关免疫分析方法奠定基础。方法采用高碘酸钠氧化法合成马钱苷免疫原(loganin-BSA)和包被原(loganin-OVA);应用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法鉴定马钱苷人工抗原是否偶联成功;通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测免疫小鼠血清中抗马钱苷抗体效价及其特异性。结果经MALDI-TOF-MS检测,马钱苷与BSA偶联成功。竞争抑制曲线表明,血清中的抗体可与马钱苷产生特异性结合,血清抗体效价在1∶40 000。结论成功合成了马钱苷人工抗原,为马钱苷单克隆抗体的制备及其在中药质量评价和动物体内药动学方面的应用奠定了基础。     

人白蛋白与3-氨甲基吡啶相互作用的研究

 目的研究人白蛋白与3-氨甲基吡啶(潜在的亲和配体)之间的相互作用规律。方法在不同酸碱度和盐浓度的缓冲液条件下将固定化3-氨甲基吡啶与人血浆中的白蛋白接触，测定3-氨甲基吡啶对人白蛋白的结合量。用亲和毛细管电泳方法测定了液相状态下白蛋白与3-氨甲基吡啶相互作用的亲和常数及结合位点的数目，并与固相状态下的作用机制进行了比较。最后用计算机辅助分子模拟的方法，在白蛋白三级结构上搜寻可能的结合位点， 结合实验数据阐明相互作用的机制。结果在pH8.0时结合量最高，并随pH升高和降低而减少；结合的量随盐浓度的增大而减少,潜在结合口袋区域存在ASP256,ASP259两个带电荷的氨基酸残基。结论静电相互作用是白蛋白与3-氨甲基吡啶的结合的主要动力，吡啶环的疏水性质和空间体积的排斥性质可能决定了白蛋白与3-氨甲基吡啶相互作用的专一性。     

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??OBJECTIVE To determine glycoprotein content in recombinant human albumin from different expression systems with different methods. METHODS Recombinant human albumin samples from Saccharomyces cerevisiae expression system, Pichia pastoris expression system, Oryza sativa expression system as well as plasma derived human albumin were investigated by phenol sulfuric acid method, HPLC peak area method and ConA combining elution HPLC method. RESULTS For 10 batches of samples expressed in pichia pastoris expression system, the total contents of mannose were 2.7 mg·g(Pro)^-1 (A manufacturer, n=4) and 1.7 mg·g(Pro)^-1 (B manufacturer, n=6), respectively. The HPLC peak area percentages of ConA binding protein in recombinant human albumin from Pichia pastoris expression system were the highest, which showed 2.65% (A manufacturer) and 0.71% (B manufacturer)respectively, the peak area percentage of ConA binding protein in Oryza sativa expression system was 0.05% (E manufacturer, n=3), and the ConA binding protein peak area of plasma derived human albumin was 0.01% (W manufacturer). The RESULTS of ConA binding and elution analysis with HPLC method for Quantitative determination of ConA binding protein showed that the ConA binding protein contents in the samples from pichia pastoris expression system were much higher: 27.58 mg·g(Pro)^-1 (A manufacturer), 21.48 mg·g(Pro)^-1(B manufacturer), 32.02 mg·g(Pro)^-1(C manufacturer); the ConA binding protein content in the sample from Saccharomyces cerevisiae expression system was lower, 2.29 mg·g(Pro)^-1(D manufacturer); the ConA binding protein content in the samples from oryza sativa expression system was the lowest, 1.27 mg·g(Pro)^-1 (E manufacturer); the plasma derived human albumin ConA binding protein content was 31.16 mg·g(Pro)^-1 (S manufacturer). CONCLUSION In terms of the RESULTS of the samples and METHODS involved in this study,there were glycosylated or glycol forms of protein in all recombinant human albumin samples from different expression systems; the glycosylated protein content in samples of Pichia pastoris expression system is higher than Saccharomyces cerevisiae expression system, while the glycoformed protein in samples of Oryza sativa expression system is the lowest. Plasma derived human albumin also contains glycoprotein or glycosylated protein.     

荧光猝灭法对葫芦巴碱与人血清白蛋白间相互作用的研究

目的:研究葫芦巴碱与人血清白蛋白间的相互作用。方法:在pH 7.4作用液、286nm激发波长条件下采用荧光光谱法来研究不同浓度的葫芦巴碱对人血清白蛋白的荧光猝灭作用。结果:当作用温度为37℃和47℃时,葫芦巴碱与人血清蛋白间的结合常数K分别为749.03L.mol-1和106.29L.mol-1,结合位点数n分别为1.0077和0.7625。结论:葫芦巴碱对人血清白蛋白的荧光发射有一定的猝灭作用,并且温度的升高不利于两者的结合;同时还证明葫芦巴碱与人血清白蛋白分子间的结合力主要是静电作用。     

Investigation of korean plant extracts for potential phytotherapeutic agents against B-virus hepatitis

The present study was undertaken to identify potential phytotherapeutic agents among the aqueous extracts of 151 herbal medicinal plants of Korea. Extracts were assayed for (1) binding potency to hepatitis B-virus surface antigen (HBsAg), and (2) inhibition of serum hepatitis B-virus DNA polymerase activity. Of the 151 aqueous plant extracts tested, 33 demonstrated a positive precipitation reaction with HBsAg⁺ serum, and 15 of these specifically bound HBsAg in serum as well as recombinant HBsAg (Hepavax®). Nine extracts competitively inhibited >80% of anti-HBsAg antibody binding to Hepavax® HBsAg. Furthermore, nine of these 15 plant extracts also exhibited greater than 25%—50% inhibition of hepatitis B-virus (HBV) DNA polymerase activity, and also significantly stimulated production of the potent cytokine, tumour necrosis factor (TNF). None of the extract concentrations used altered liver function parameters of normal rats.     

巴西苏木红素与血清白蛋白及血浆成分结合率研究

 目的 建立测定巴西苏木红素与血浆结合率的平衡透析方法,并测定其体外与血浆总物质及牛血清白蛋白结合率。方法 采用平衡透析法测定巴西苏木红素与血浆总物质及牛血清白蛋白结合率,采用HPLC测定各成分的血药浓度及游离药物浓度,生物样品用乙酸乙酯液萃取的方法。 结果 在低、中、高3种浓度下,巴西苏木红素与牛血清白蛋白的结合率为38.5%~50.8%,与大鼠血浆总物质的结合率为86.2%~97.3%。结论 巴西苏木红素与大鼠血浆有较高的结合率,血浆中的磷脂部分可能为参与两者之间结合的主要物质。     

橙皮素及橙皮苷与牛血清白蛋白作用的比较

目的：比较橙皮素和橙皮苷与牛血清白蛋白（BSA）作用的异同,探讨黄酮类化合物A环7位羟基糖苷化与否对结合血清白蛋白的影响。方法：荧光光谱、紫外-可见吸收光谱法测定橙皮素和橙皮苷与BSA的作用。结果：橙皮素对BSA的荧光猝灭效率明显高于橙皮苷;橙皮素对BSA的荧光猝灭以静态猝灭为主,而橙皮苷对BSA的荧光猝灭既有静态猝灭作用,也有动态猝灭作用;橙皮素与BSA结合的K a值明显大于橙皮苷;橙皮素结合BSA的位点与荧光发射基团的距离比橙皮苷的小;橙皮素与BSA之间的作用主要是氢键和范德华力,而橙皮苷与BSA的作用主要是疏水作用力。结论：橙皮素与BSA的结合能力明显强于橙皮苷,说明橙皮素比橙皮苷更容易被血清蛋白贮存和运输。     

人血清白蛋白的仿生亲和配基研究

 目的研究人白蛋白特异的仿生亲和配体和仿生亲和分离技术。方法合成固定化亲和配体库，以人血浆为原料筛选，进行人白蛋白分离实验。结果筛选出两个可以特异结合人血清白蛋白的亲和配体。其中3-氨甲基吡啶配位体对白蛋白的一步纯化倍数为18倍，回收率87.5%。结论固定化3-氨甲基吡啶可以特异结合人血清白蛋白。     

糖苷类化合物血浆蛋白结合的研究

[目的]考察dapagliflozin及其衍生物与大鼠血浆蛋白的结合规律以及结合位点。[方法]采用平衡透析法和高效液相色谱法（HPLC）测定血浆蛋白结合率,选出代表性化合物与地西泮和华法林进行竞争性结合实验,利用对接计算进行结合位点的初步研究。[结果]dapagliflozin的蛋白结合率随着血浆比例的增加而增大,糖苷类化合物结构变化对蛋白结合率也有一定影响,地西泮和华法林对糖苷类化合物的蛋白结合影响较小,对接结果表明糖苷类化合物主要与白蛋白的第2个亚结构结合。[结论]dapagliflozin及其衍生物具有较高的血浆蛋白结合能力,可能结合在与华法林和地西泮不同的白蛋白结合位点,结构的变化可以一定程度改变蛋白结合率。     

Inhibition of Na(+)/K(+) -ATPase by antcins, unique steroid-like compounds in Antrodia camphorate

The inhibition of Na(+)/K(+) -ATPase by versatile steroid-like compounds contributes to the putative therapeutic effects of many Chinese medicinal cardiac products via the same molecular mechanism triggered by cardiac glycosides. Five major steroid-like compounds, antcin A, B, C, H, and K were isolated from Niuchangchih (Antrodia camphorata), a unique Taiwan mushroom, and all inhibited Na(+)/K(+) -ATPase. Antcin A exhibited significantly higher inhibitory potency than the other four antcins, though weaker than ginsenoside Rh2 . In contrast, cortisone (an analogous steroid with anti-inflammatory effects stronger than antcin A) showed no detectable inhibitory potency. Molecular modeling has shown that antcins bind to Na(+)/K(+) -ATPase with the steroidal skeleton structurally upside-down in comparison with ginsenoside Rh2 . The inhibitory potency of antcin A is attributed to steroidal hydrophobic interaction within the binding pocket and the formation of three hydrogen bonds between its carboxyl group and two cationic residues around the cavity entrance of Na(+)/K(+) -ATPase. The presence of an additional carbonyl or hydroxyl group at C7 of the other four antcins leads to severe repulsion in the hydrophobic pocket, and thus significantly reduces inhibitory potency. It is proposed that antcin A is a bi-functional compound that exerts anti-inflammatory effects and that enhances blood circulation via two different molecular mechanisms.     

酮洛芬与血浆蛋白非共价结合的电喷雾质谱研究

 目的应用电喷雾离子阱质谱(ESI-MS)研究酮洛芬与人血清白蛋白、α₁-酸性糖蛋白的非共价结合。方法应用ESI-MS分别测定酮洛芬、人血清白蛋白、α₁-酸性糖蛋白以及酮洛芬与该两种蛋白形成的复合物的相对分子质量,通过结合前后的相对分子质量变化计算复合物化学计量比。考察了反应体系pH值以及质谱仪毛细管温度、锥孔电压等对药物与蛋白非共价结合的影响。结果酮洛芬(ketoprofen,KP)与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)和α1-酸性糖蛋白(α₁-acid glycoprotein,AAG)形成非共价结合复合物的表观化学计量比分别为5∶1和4∶1。结论ESI-MS是研究药物与蛋白间非共价结合的一种新方法,具有灵敏、快速和准确的特点。