流式细胞术计数CD34阳性细胞的标准化与质量控制

用流式细胞术计数脐带血,外周血及其采集物中的ＣＤ３４＾＋细胞数已被普遍采用,然而,不同实验之间的ＣＤ３４＾＋细胞计数差异非常大,本就影响结果的主要因素,目前国际上采用的标准化方案和不同方案之间的比较进行综述,我们实验室应用ＰｒｏＣＯＵＮＴ试剂盒检测了４５例脐带血,１２份正常骨髓和４例外周血采集物中的ＣＤ３４＾＋细胞的数量,结果表明ＰｒｏＣＯＵＮＴ为标准化程度较高的方法,有利于减少不同实验之间ＣＤ３４＾＋细胞计数的差异。     

microRNA在人脐血CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞中的差异性表达

为进一步探讨microRNA（miRNA）在造血调控中的作用奠定基础,比较了miRNA在人脐血CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞中的差异性表达。从人脐血中分离单个核细胞（MNC）,应用FACSVantage分选流式细胞仪分选CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞;抽提miRNA后与miRNA芯片杂交,应用生物信息学技术分析miRNA芯片的表达结果。结果发现,miRNA在人脐血CD34^＋CD38^＋细胞的表达水平比在CD34^＋CD38^-细胞的表达水平降低至1／2以下者共11个,表达水平升高至2倍以上者共73个,以上84个miRNA被称为“干细胞性”miRNA。经比较Georgantas等和芯片表达结果,发现有12个（14、29％,12／84）相同的miRNA。部分miRNA经历了类似于CD34在造血细胞表面的发展历程。应用生物信息学技术可寻找到新的与造血调控相关的miRNA簇及miRNA的下游靶基因。结论：“干细胞性”miRNA在正常造血中发挥着重要作用,即miRNA的系统表达模式一造血干／祖细胞基因表达谱一造血干／祖细胞的自我更新和系列定向分化。     

自体纯化CD34+细胞移植治疗自身免疫性疾病14例的临床观察

目的 探讨自体纯化CD34+细胞移植治疗自身免疫性疾病(AID)的疗效.方法 对14例自身免疫性疾病患者进行自体纯化CD34+细胞移植.采用环磷酰胺(CTX)+G-CSF动员外周血干细胞,通过CliniMACS细胞分选仪分选CD34+细胞并冻存.预处理方案:8例采用氟达拉滨(FDB)+抗胸腺细胞球蛋白(ATG)+CT...     

细胞因子在CD34阳性骨髓细胞中的表达

CD34~ 细胞包含有造血干/祖细胞,而造血干/祖细胞能被IL-3,GM-SCF,G-CSF等诱导分化与增殖。正常的CD34~ 细胞是否参与一些细胞因子的产生尚未被阐明。我们采用逆转录-聚合酶链反应分析了经流式细胞仪分选出的正常骨髓CD34~ 细胞IL-1β,IL-3,IL-4,IL-6,GM-CSF,TNF-α,TNF-β及c-kit基因的表达,并且分析了重组IL-1β,IL-3,IL-7,GM-CSF,PIXY321(IL-3/GM-CSF融合蛋白)及干细胞因子(SCF)对这些细胞因子的调节作用。结果发现新分选出的CD34~ 细胞表达较高水平的IL-1β,c-kit mRNA及低水平的IL-3,TNF-α,TNF-βmRNA。经外源性的细胞因子刺激后,IL-1β,TNF-α及TNF-βmRNA均有不同程度的上调,唯IL-7能使GM-CSF mRNA的表达变为阳性,IL-7亦能显著增强IL-6基因的表达。所有这些细胞因子对c-kit及IL-3基因表达均无明显作用。     

The relationship of CD34+ dosage and platelet recovery following high dose chemotherapy and autologous CD34+ reinfusion in multiple myeloma

Autologous hematopoietic stem cell transplantation (ASCT) is an established treatment for multiple myeloma (MM), yet the impact of transplanted CD34+ cell dose remains unresolved, especially in patients over the age of 65 years. Data was collected from 207 consecutive ASCT patients to determine the relationship between CD34+ infusion count and short-term and long-term platelet recovery. For MM patients under the age of 65 years (n = 155), CD34+ dosage correlates with time to platelet engraftment (p < 0.001) and platelet count at 30 days (p = 0.003), but not with long-term platelet counts at 180 or 360 days from the CD34+ reinfusion. For MM patients aged 65 years or older (n = 46), CD34+ dosage did not correlate with time to platelet engraftment, but did correlate with both short-term and long-term platelet counts at 30 (p < 0.001), 180 (p = 0.021), and 360 days (p = 0.005). Exploratory regression analysis was done to explore platelet stability following the current minimum CD34+ dosage reinfusion. For MM patients under the age of 65 years, the minimum standard CD34+ dosage of 2 × 10⁶ cells/kg was sufficient for a timing to platelet engraftment of <21 days and short-term platelets count ≥150 × 10⁹/L at 30 days. Alternatively, for MM patients aged 65 years or older, the CD34+ dosage of 2 × 10⁶ cells/kg was insufficient for platelet counts ≥150 × 10⁹/L at 30 and only marginally attainable at 360 days suggesting that in elderly MM patients a higher CD34+ dosage may be required for platelet recovery and possibly long-term platelet stability.     

骨髓增生异常综合征患者骨髓CD34-和CD34+细胞凋亡与增殖的意义及对生存的影响

本研究分析骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓CD34^＋和CD34-细胞凋亡和增殖情况,探讨MDS的发病机制,并判断其与疾病预后的关系。流式细胞术分析20例高危MDS、20例低危MDS患者及10例正常对照者骨髓CD34^＋细胞的比例、CD34^＋细胞和CD34-细胞凋亡、增殖的百分率,计算各组中的凋亡／增殖（A／P）比。并用单变量和多变量生存分析法分析CD34^＋细胞和CD34-细胞增殖和凋亡对预后的影响。结果表明：①MDS高危组患者骨髓CD34^＋细胞的比例明显高于低危组（P〈0．05）,而低危组与对照组比较无显著差异;②CD34^＋,CD34-细胞的凋亡率在MDS低危组中均为最高,明显高于MDS高危组和对照组。在低危组中,CD34-细胞的凋亡率为（80．36±1．82）％,明显高于CD34^＋细胞的（54．75±2．18）％（P〈0．05）,而在高危组中,CD34^＋,CD34-细胞的凋亡率无显著差异;③CD34^＋细胞的增殖率在MDS高危组中最高,明显高于低危组和对照组,而CD34-细胞的增殖率在MDS高危和低危组间无显著差异。高危组CD34^＋细胞的增殖率为（50．67±3．37）％,明显高于CD34-细胞的（30．99±1．96）％（P〈0．05）;④CD34^＋、CD34-细胞的A／P值在MDS低危组均明显高于高危组和正常对照组,而CD34-细胞的A／P值在MDS高、低危组均明显高于CD34^＋细胞的A／P值（P〈0．05）。此外,CD34^＋细胞的凋亡率与生存及预后明显相关。结论：CD34^＋细胞百分率随MDS危险度增加而逐渐增加,在低危组中以CD34-细胞的凋亡占主导,随着病情进展,在高危组中则以CD34^＋细胞的增殖占主导,提示异常的凋亡和增殖在MDS的发生和发展中起重要作用。此外,CD34^＋细胞的凋亡率可能是独立的预后不良因素,抑制凋亡可能诱导MDS向白血病的转化。     

利用基因芯片分析碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血干细胞CD34~+与CD133~+细胞基因表达的差异

背景:迄今为止,人们利用基因芯片对碱性成纤维细胞生长因子诱导CD34~+和CD133~+干细胞分化后细胞生物学性状、功能调控、基因变化及其表达差异等方面的认识尚不足,有待深入研究.目的:利用基因芯片比较脐血CD34~+和CD133~+细胞基因表达的差异,并探讨碱性成纤维细胞生长因子体外诱导脐血CD34~+和CD133~+造血干/祖细胞分化的基因表达变化,及其对碱性成纤维细胞生长因子反应性差异.方法:利用MiniMACS免疫磁珠法从脐静脉血单个核细胞中分离出CD34~+和CD133~+干/祖细胞,经含碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12细胞营养液培养10～15 d,提取培养前后细胞总RNA,利用Oligo GEArray(r)芯片和GEArray表达分析软件进行芯片数据分析.流式细胞仪检测CD34~+和CD133~+造血干细胞回收率.碱性成纤维细胞生长因子诱导前后CD34~+、CD133~+细胞形态变化.变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA浓度和纯度.基因芯片检测结果.结果与结论:①对20份脐血分别进行CD34~+和CD133~+细胞分选,分选CD34~+细胞纯度为(77.52±5.06)%,回收率为(2.74±1.59)%;CD133~+细胞纯度为(79.16±3.37)%,回收率为(1.12±0.94)%.②新分选出的CD34~+细胞呈球形,经碱性成纤维细胞生长因子培养15 d后,多数细胞形态未发现显著变化,部分细胞出现贴壁生长,可见突起和梭形细胞.CD133~+细胞呈球形,经碱性成纤维细胞生长因子培养15 d后,细胞明显扩增,由圆球形变为不规则形,部分细胞出现贴壁生长.③CD34~+干细胞培养前后总RNA提取质量分别为2 236 ng和1 796 ng;CD133~+干细胞培养前后总RNA提取质量分别为2 518 ng和2 191 ng.④在所检测的263个干细胞相关基因中,脐血CD133~+细胞与CD34~+细胞基因表达差异2倍以上的基因有10种,其中5种基因表达前者高于后者,5种基因表达前者低于后者;碱性成纤维细胞生长因子诱导培养后,CD133~+细胞有32种基因表达显著高于CD34~+细胞,在检测的263个基因中,未见低于CD34~+细胞的基因.证实脐血中新分离的CD133~+细胞和CD34~+细胞基因表达仅有少数基因存在差异;CD133~+细胞对碱性成纤维细胞生长因子的反应性显著强于CD34~+细胞,表现为细胞周期调节、信号转导和分化等基因表达增强.     

体外诱导骨髓CD34+细胞生成血管内皮细胞的方法

目的：体外分离狗骨髓CD34^ 细胞，建立诱导分化血管内皮细胞的方法，并进行生物学鉴定。方法：利用免疫磁珠法分离狗骨髓CD34^ 细胞，在体外经血管内皮细胞生长因子（VEGF）、内皮细胞生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（hFGF)诱导后，观察细胞生长状况，以光镜、电镜进行形态学鉴定，应用免疫组化方法检测冯维靳布兰德因子（Von Willebrand factor,vWF)表达。结果：光镜下细胞单层融合生长，呈铺路石样形态，单个核位子中央，细胞群体倍增时间为35h。电镜下可见到Weibel-Palade小体，在细胞胞浆vWF染色阳性。结论：采用免疫磁珠法可从骨髓获得高纯度的CD34^ 细胞，在体外诱导分化成血管内皮细胞。     

内部核糖体进入位点介导多药耐药基因1在人CD34^＋细胞中的表达

为了达到双耐药基因共转染以拓宽造血细胞耐药谱的目的,初步观察了内部核糖体进入位点(IRES)介导多药耐药基因1(MDR1)在人早期造血细胞中的表达效率.由脑心肌炎病毒IRES调控MDR1基因翻译的双耐药基因逆转录病毒载体pSF-DIM和相同启动子调控的MDR1单耐药基因逆转录病毒载体pSF-MDR1,包装后获得的双嗜性包装细胞PA317/pSF-DIM和PA317/pSF-MDR1病毒滴度分别为8×104和1.3×105cfu/ml.用其上清感染人脐血CD34+细胞,经FCM检测表明基因转导后单基因转导组和双基因转导组P-gp表达均有提高,分别为28.82%(荧光强度25.49)和10.92%(荧光强度9.48),但单基因转导组高于双基因转导组.因此,IRES成功地介导了MDR1基因在人早期造血细胞中的表达,为后续的试验奠定了一定的基础.但是,双基因转导组和单基因转导组MDR1表达差异的原因还需进一步研究.     

明胶酶A、B在脐血CD34+细胞及部分白血病细胞系中的表达

目的　研究骨髓及脐血CD34+ 细胞及白血病细胞系的明胶酶 ,即基质金属蛋白酶 9(MMP 9,明胶酶B)和基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 ,明胶酶A)的产生 ,探讨它们在CD34+ 细胞迁移、归巢中的意义及在白血病发病中的作用。方法　通过MiniMACS磁珠分离技术分离脐血及骨髓的CD34+细胞 ,通过酶谱分析法测定脐血、骨髓CD34 + 细胞及白血病细胞系的无血清条件培养液中明胶酶的表达。结果　在脐血CD34+ 细胞的条件培养液中可测出相对分子质量为 92× 10 3的亮带 ,骨髓CD34+ 细胞的条件培养液中未测到亮带。部分白血病细胞系U937、KG 1a、HL 6 0可产生相对分子质量为 92×10 3和 72× 10 3的亮带 ,J6 1、J6 2细胞系可产生相对分子质量为 92× 10 3的亮带 ,而HEL、Namalva、CEM、K5 6 2、LCL H不产生亮带。结论　脐血CD34+ 细胞可产生MMP 9,而骨髓CD34+ 细胞不产生 ,脐血CD34+ 细胞具有较强的穿透基底膜的迁移能力并与MMP 9相关。在白血病细胞系中 ,部分髓系白血病细胞系产生MMP 9和MMP 2 ,而非髓系白血病细胞系不产生。     

动员外周血CD34阳性细胞流式细胞术测定中的策略探讨

探索用流式细胞术测定动员外周血中CD34^ 细胞的简便有效的方法，以便在干细胞动员中进行有效的动态监测，及时收取干细胞，把握最佳移植效果，将经药物动员的移植供的外周血用CD34和CD45荧光抗体标记，用红细胞裂解液将红细胞裂解后经流式细胞仪检测，运用恰当的分析窗口，有效的设门分析结合干细胞的生物学特性，确定CD34^ 细胞在窗口中的确切位置，统计CD34^ 细胞在有核细胞中的比例，结果表明，通过本方法可有效地测定0.05%-0.1%的CD34^ 细胞的相对含量，在药物动员的第5或6天，多数患外周血中CD34^ 细胞达到峰值，某些患外周血中CD34^ 细胞可超过1%，结论：通过标记中的有效阻断和多参数分析，本方法可对动员外周血中微量的CD34^ 细胞进行有效的动态监测，对适时采集干细胞进行移植提供了重要的参考。     

Prevention of osteonecrosis by intravenous administration of human peripheral blood‐derived CD34‐positive cells in a rat osteonecrosis model

Aseptic idiopathic osteonecrosis of the femoral head is a painful disorder of the hip that can lead to collapse of the femoral head and the need for total hip replacement following joint destruction. Treatment of this disease still remains a clinical challenge. Adult human circulating CD34⁺ cells have been demonstrated to contribute to vasculogenesis and osteogenesis in immunodeficient rat non‐union models in vivo. We hypothesized and proved that the transplantation of CD34⁺ cells could have a role for improvement of osteonecrosis by promoting vasculogenesis and osteogenesis. Vascular deprivation‐induced femoral head necrosis was developed in immunodeficient rats and we then administered human G‐CSF mobilized CD34⁺ cells intravenously. At 4 weeks after administration, the structure of the femoral head and neck were evaluated histologically and morphometrically with haematoxylin and eosin (H&E) staining and micro‐CT imaging. Microangiography was carried out for macroscopic evaluation of neovascularization, and the contribution of human cells to vasculogenesis and osteogenesis was evaluated by immunofluorescent staining with human‐specific antibodies. Our treatment resulted in an obvious improvement of osteonecrosis after CD34⁺ cell administration and demonstrated the differentiation potential of CD34⁺ cells into endothelial cells and osteoblasts. In conclusion, this new therapeutic approach using circulating cell fraction could be a promising cell‐based therapy for early‐stage osteonecrosis of the hip. Copyright © 2010 John Wiley & Sons, Ltd.     

脐血CD34+细胞与单个核细胞的体外扩增特性研究

目的　探讨CD34+ 富集细胞和单个核细胞 (MNC)的体外扩增特性。方法　利用Min iMACS系统富集CD34+ 细胞 ,在相同条件下与同批MNC进行对照培养 ;观察了再次富选和MNC培养上清 (MNC SN)对CD34+ 富集细胞扩增的影响 ;并尝试了MNCCD34- 细胞的培养。结果　虽然CD34+ 富集细胞具有很高的扩增潜力 ,但在培养过程中 ,其集落密度和CD34 + 细胞含量却始终呈下降趋势 ,而MNC在培养中却出现了一个上升的趋势 ,集落密度和CD34+ 细胞含量分别由第 0天的 (4 12± 16 7) 10 5细胞和 (1.12± 0 .4 2 ) %增至第 7天的 (116 2± 5 6 6 ) 10 5细胞和 (4 .17± 1.4 4 ) % ;再次富选可以使培养过的CD34+ 富集细胞的总细胞和CD34+ 细胞扩增能力大大提高 ;MNCCD34- 细胞具有集落形成和转化为CD34+ 细胞的能力 ;MNC SN对CD34+ 富集细胞的集落形成有促进作用 ,而同时又对CD34+ 细胞有促分化作用。结论　CD34+ 富集细胞在体外大量扩增的同时存在大量分化 ,其在培养过程中产生的CD34-细胞对CD34+ 细胞的扩增有抑制作用 ;脐血MNC中大量的CD34- 细胞含有造血干 祖细胞 ,其分泌的细胞因子有促进CD34+ 细胞向较为成熟的集落形成祖细胞分化的作用。     

异基因造血干细胞移植CD34^＋CD61^＋巨核系前体细胞与血小板植入的相关分析

本研究通过定量测定G—CSF动员后外周血及骨髓采集物的CD34^＋CD61^＋细胞，以探索巨核前体细胞CD34^＋CD61^＋亚群输注量与异基因外周血和／或骨髓移植后血小板恢复时间的相关性。24例不同血液病患者接受HLA全相合同胞、非血缘供者或单倍体相合同胞造血干细胞移植。20例可评估的患者依移植方法不同分为HLA全相合组和单倍体相合组，HLA全相合组采用PBSC移植方案，单倍体相合组采用PBSC＋BM联合移植方案，对外周血干细胞和骨髓样本CD34^＋CD61^＋亚群通过流式细胞仪立即测定或隔夜保存后测定。结果表明，单倍体相合组输注CD34^＋、CD34^＋CD61^、CD34^-CD61^＋细胞数中位值分别为6．24×10^6／kg（1．53—20．48）、66．19×10^4／k（8．16—493．83）、34．38×10^6／kg（14．71—109．16）；HLA全相合组中位值分别为4．88×10^6／kg（1．00—8．24）、14．16×10^4／kg（11．63—96．87）和13．50×10^6／kg（1．74—35．61）。中性粒细胞计数（ANC）〉0．5×10^9／L和血小板计数〉20×10^9／L的中位时间，单倍体相合组分别为18．5（11．00—29．00）和16．5（9．00—35．00）天；HLA全相合组为14．5（9．00—24．00）和10．5（6．00—37．00）天，血小板的植入时间在两组差别无显著性，中性粒细胞植入时间在HLA全相合组和单倍体相合组差异有显著性（p=0．048），对于两组中CD34^＋细胞量〉2×10^6／kg的受者血小板的植入时间分析，两组差别有显著性（p=0．006）。CD34^＋CD61^＋亚群与血小板植入的相关性明显优越于CD34^＋细胞，可评估20例（r=-0．449p=0．047CD34^＋细胞群），单倍体相合组12例CD34^＋CD61^＋亚群（r=-0．768p=0．004），HLA相同纽8例CD34^＋CD61^＋亚群（r=-0．747p=0．033），CD34^＋CD61^＋亚群与血小板的植入时间呈负相关关系，输注CD34^＋CD61^＋亚群细胞量大，血小板的植入时间缩短。结论     

PNH患者骨髓CD34^＋CD59^＋细胞体外扩增及植入体内重建造血的活性研究

本研究应用BALB／c裸鼠为移植模型探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobin—uria，PNH）患者CD34^＋CD59^＋的增殖和重建造血的能力，为实现PNH患者自体骨髓移植或自体外周血造血干细胞移植提供实验依据。利用免疫磁珠双阳性分选法，从正常人及PNH患者骨髓中分离出两组CD34^＋CD59^＋细胞，分别进行体外扩增，并将体外扩增的正常人和PNH患者骨髓CD34^＋CD59^＋细胞分别输注给接受亚致死剂量照射的BALB／c裸鼠。应用流式细胞技术和DNA检测技术检测受鼠骨髓、脾脏和外周血中人CD45^＋细胞。结果表明：PNH组的CD34^＋CD59^＋细胞在体外生存、扩增能力似弱于正常人对照组。但CD34^＋CD59^＋细胞输注给受鼠后6周，在受鼠骨髓、脾脏和外周血中可检测到人CD45^＋细胞，PNH组受鼠CD45^＋细胞水平与正常人对照组相比，无统计学差异。结论：PNH患者CD34^＋CD59^＋细胞仍具有同正常人CD34^＋CD59^＋细胞相同的生物特性，能体外扩增并能保持正常干／祖细胞的特性。     

脐血CD34+CD38-早期造血祖细胞的体外增殖和凋亡

为了从适龄产妇脐血中分离出CD34^ CD38^-细胞，在体外较长时间培养后观察分析CD34^ CD38^-细胞分裂增殖、凋亡以及干细胞因子对CD34^ CD38^-细胞增殖的影响，用流式细胞仪从10例健康产妇脐血中分选出CD34^ 和CD38^-标记的脐血原始细胞．在添加IL-3、IL-6、GM—CSF、EPO、IGF—1和SCF6种混合因子的干细胞培养基中培养6个月，观察细胞并绘制生长曲线，用单细胞凝胶电泳检测干细胞因子对CD34^ CD38^-细胞生长的影响和用流式细胞仪检测CD34’CD38细胞凋亡情况。结果表明：脐血CD34^ CD38^-细胞可在体外较长时间培养增殖，无异常或过度的细胞凋亡发生。结论：通过控制培养条件，脐血CD34^ CD38^-早期造血祖细胞可在体外较长时间培养增殖，以作为大量脐血原始细胞移植的细胞来源.     

人参二醇促骨髓CD34+细胞增殖和分化的研究

本研究探讨人参二醇（PDS）对正常人骨髓CD34^＋细胞的促进增殖和诱导分化作用。用吸附单克隆抗体的免疫磁珠技术从正常人骨髓分离出CD34^＋细胞,采用琼脂半固体多向祖细胞集落（CFU-Mix）培养方法观察PDS对CD34^＋细胞的增殖作用;用液体培养使CD34^＋细胞增殖,并向红系、粒系定向生长,用流式细胞仪分析PDS诱导后细胞表面标记变化。结果显示：免疫磁珠分离CD34^＋细胞的获得率占骨髓有核细胞（MNC）的（1.0±0.15）%;活细胞比例占（95.6±1.2）%,CD34^＋细胞富集度达（86.8±2.8）%。中浓度PDS（25mg/L）能够有效地促进CD34^＋细胞增殖,生成CFU-Mix集落,提高率为（56.3±3.5）%,与对照相比较有显著差异（p〈0.01）。液体培养生成粒系、红系细胞的数量明显增高,与对照相比差异有显著性,提高率分别为（35.6±3.2）%和（22.3±2.1）%,与对照相比差异有显著性（p〈0.01）,且呈剂量依赖性。经PDS诱导14天后,细胞表面分化标记明显增高,CD33^＋细胞在PDS50mg/L时最高,CD71^＋细胞在25mg/L时最高,G-A^＋细胞在10mg/L时最高,而CD15^＋细胞数量无明显变化。结论：PDS不但促进CD34^＋细胞增殖,且能诱导其定向分化,提示PDS具有类似造血生长因子和协同生长因子的效应。     

间充质干细胞对脐血CD34^＋细胞扩增及其细胞特性变化的影响

本研究探讨脐带间充质干细胞（MSC）对CD34^＋细胞（HSPC）体外扩增的支持作用及对CD34^＋细胞表面标志、归巢黏附分子、集落形成能力等干细胞特征变化的影响。用免疫磁珠法从新鲜分离的脐血单个核细胞分离CD34^＋造血干祖细胞（HSPC）；用MSC饲养层（feeder）制备经^137Cs照射的间充质干细胞饲养细胞（MSC feeder cells）。将CD34^＋细胞接种在不同的培养体系中，实验分为3组：HSPC＋CK组为培养液中加入细胞因子组合（SCF、FL和TPO），HSPC＋MSC组为CD34^＋细胞接种在MSC feeder上，HSPC＋MSC＋CK组同时加入细胞因子组合及MSC饲养细胞。培养后4、7、10、14天计数有核细胞总数（MNC），计算细胞扩增情况；用流式细胞术检测不同处理组间CD34^＋细胞及亚群免疫表型、归巢黏附分子和集落形成能力。结果表明：在2周的培养时间里，3组MNC和CD34^＋细胞均明显增加，MNC扩增数依次HSPC＋MSC＋CK组〉HSPC＋CK组〉HSPC＋MSC组。体外扩增10天内HSPC＋MSC＋CK组MNC得到大量的扩增，同时CD34^＋细胞的扩增亦较高。培养4天3组细胞CD34^＋比例较0天有明显下降（P〈0．01）；扩增后CD34^＋细胞比例：HSPC＋MSC组〉HSPC＋MSC＋CK组〉HSPC＋CK组（P〈0．01）；各组CD34^＋细胞亚型细胞比例有所不同，HSPC＋CK组4天时CD34^＋CD38^-细胞有一过性升高（62．71％），之后迅速降低，7天时为0．05％；HSPC＋MSC组7天时CD34^＋CD38^-细胞比例为18．92％，与HSPC＋CK组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。从集落形成分析结果看出：MSC、细胞因子混合组扩增后细胞集落形成能力在不同时间点均维持在较高水平。结论：脐血CD34^＋细胞在体外短期培养（〈7天）下，MSC和细胞因子联合应用能同时使CD34^＋细胞得到明显的扩增并维持造血干祖细胞的生物学特征。     

人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34+细胞增殖的研究

为了研究人骨髓间充质干细胞(MSC)作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的作用,将MSC和胎儿骨髓来源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系(HFCL)经60Coγ线照射后分别制备细胞滋养层,比较不同滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血CD34+细胞增殖数及LTC-IC数的影响.结果表明,无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSCF、rhTPO),HFCL滋养层组培养12天扩增细胞数明显高于MSC滋养层组,以第0天细胞数为100%(下同),有细胞因子组为(9797±361)%vs(7061±418)%,无细胞因子组为(5305±354)%vs(1992±247)%,均P＜0.01.MSC滋养层组CD34+细胞扩增数与HFCL滋养层组相比无显著差异[(825±305)%vs(820±191)%,P＞0.05],但在细胞因子存在时低于HFCL滋养层组[(939±212)%vs(1617±222)%,P＜0.01].MSC滋养层组维持脐血中LTC-IC的能力明显优于HFCL滋养层组[第5周CFU-GM数(129.95±8.73)个/105接种细胞数vs(89.81±10.29)个/105接种细胞数,P＜0.05];细胞因子存在时,其作用更为明显[第5周CFU-GM数(192.93±4.95)个/105接种细胞数vs(90.47±14.28)个/105接种细胞数,P＜0.01].MSC与HFCL按一定比例混合,可提高扩增效率.当MSC与HFCL之比为41时,集落形成数量最高,达(186.89±11.11)个/105接种细胞数,明显高于比例为32(131.45±13.02)个/105接种细胞数和二者单用组[前者(138.92±14.84)个/105接种细胞数,后者(64.63±6.11)个/105接种细胞数;均P＜0.01].结论MSC维持脐血中LTC-IC集落形成的能力优于基质细胞系HFCL,HFCL支持脐血CD34+细胞的增殖能力优于MSC,MSC加上适量HFCL可显著提高CD34+细胞扩增效率.     

Direct volumetric flow cytometric quantitation of CD34+ stem and progenitor cells

Objectives: In this study, we compared a classic single‐platform (SP) method applying beads for enumeration of CD45+ or CD34+ cells with a new device allowing direct volumetric measurements of stem and progenitor cells. Background: Following apheresis and cyropreservation, the precise enumeration of CD34+ cells as key parameter of graft quality is mandatory for the clinical course after transplantation. Currently, flow cytometry with SP technique represents the ‘gold standard’ for such determinations. Methods/Materials: Fresh samples, 14 from mobilised peripheral blood (PB), 9 from apheresis products (AP) and 13 samples from frozen‐thawed (FT) haematopoietic progenitor cell grafts, were analysed for CD34+ cells, CD45+ cells, and in frozen‐thawed samples for viability by a bead‐based flow cytometric method and in parallel by a direct, volumetric flow cytometric method. Results: Comparison of CD34+ analyses revealed a significant correlation (P < 0·01) for each material between both techniques with r = 0·95 (PB), r = 0·933 (AP) and r = 0·929 (FT). Also, for analysis of CD45+ cells µL^?1, the measured numbers evaluated with the different techniques did not significantly differ for all three materials analysed. In frozen‐thawed samples, the analysis of viability was comparable for both techniques. Conclusions: The results of this study demonstrate that a direct volumetric analysis of CD34+ cells µL^?1 or CD45+ cells µL^?1 is feasible. This technique represents a simple and economical approach for standardisation of progenitor and stem cell analyses.