人神经营养素-3基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建含有人NT-3基因真核表达载体pcDNA3．1-NT-3。方法：采用PCR技术，扩增编码神经营养素-3基因，克隆到PMD18-T载体上，再亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1的Hind Ⅲ和BamHI位点。结果：重组真核表达载体pcDNA3．1-NT-3经酶切鉴定证明NT-3基因正向插入真核表达载体中，碱基序列的测定证明重组质粒中含有人的NT-3基因序列。结论：构建的真核表达载体携有人NT-3cDNA序列，并且含有巨细胞病毒强启动子、ploy(A)加尾信号和neo标志基因，可能具有转染多种哺乳类细胞通用性，可用于NT-3基因的真核表达及基因治疗的研究。     

人神经营养素-3全基因在大肠杆菌内的表达

目的　应用基因工程方法制备人神经营养素 3(hNT 3)蛋白 ,为研究hNT 3的生物学作用和开展应用hNT 3进行中枢神经损伤和退行性疾病的治疗提供材料。方法　将经过序列分析确定的hNT 3全基因重组至原核表达质粒pBV2 2 0中 ,构建了重组表达载体pBV/hNT 3,在大肠杆菌中表达后 ,SDS PAGE法测定目的蛋白的相对分子质量 ,鸡胚背根节培养法检测其生物学活性。结果　pBV/hNT 3在大肠杆菌中表达出了三个分子质量分别为 1 5× 1 0 3、1 8× 1 0 3和 33× 1 0 3的蛋白质 ,恰与hNT 3蛋白、其前导肽及前体的分子量相符。表达蛋白主要以包涵体形式存在 ,经纯化复性后 ,可明显促进鸡胚背根节的存活和神经元突起的生长。结论　人神经营养素 3全基因可在大肠杆菌内正确地转录和翻译 ,并可部分性地进行加工     

人脑源性神经营养素-6基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的 克隆人脑源性神经营养素－6（neurotrophin-6,NT-6)基因，并观察其在大肠杆菌中的表达情况。方法 从流产胎儿大脑皮层提取总RNA，用逆转录聚合酶链反应扩增得到人的NT－6基因cNDA片段；经酶切回收后克隆进pBK-CMV质粒，构建NT－6的表达载体。通过诱导，使NT－6基因在大肠杆菌中表达。结果 分离克隆了人脑源性NT－6基因，含该基因的大肠杆菌在异丙基－β－D－硫代半乳糖苷诱导的情况下，表达了特异性的蛋白质。结论 人脑源性NT－6基因的克隆表达为进一步研究NT－6的结构，功能及临床应用奠定了基础。     

人神经营养素-3基因重组腺病毒载体的构建、表达和生物活性检测

目的构建具有生物活性的人神经营养素-3（NT-3）基因重组腺病毒表达载体.方法从人脑组织mRNA中扩增NT-3基因全长cDNA,定向克隆于穿梭质粒pShuttle中,获得一个带有CMV启动子的质粒.再与腺病毒骨架DNA（Adeno-X viral DNA）体外连接,形成重组腺病毒质粒（pAd-NT-3）.用pAd-NT-3转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒（Adeno-NT-3）. 结果NT-3基因RT-PCR扩增产物约801 bp.Adeno-NT-3 PCR鉴定为正确重组子.RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA及Western blot检测显示,Adeno-NT-3能在其转染的293细胞表达和分泌NT-3.这种NT-3能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞. 结论应用体外连接法成功构建了人NT-3基因重组腺病毒表达载体,其表达产物具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞的活性作用.     

NT-3基因l克隆与表达

目的：探讨利用基因工程技术帽备神经营养素-3（Neurotrophin-3,NT-3)的方法。方法：根据NT-3cDNA序列设计一对引物，采用聚合酶锭反应，扩增编码人NT-3基因，通过基因重组，构建表达载体PBV220-NT-3，自动序列分析测定TN-3序列，将重组PBV220-NT-3转化到大肠杆菌DH5α中，温度诱导目的基因表达，透视电镜观察诱导后的工程菌，薄层凝胶扫描分析目的基因表达量，Western blot鉴定其免疫活性。结果：序列分析结果与文献报道一致；目的基因在温度诱导下表达量为25%，表达产物以包涵体形式存在于工程菌攻体两端，大小不一，Western blot阳性，结论：本实验利用基因工程技术制备NT-3是可行的，且表达量为25%，表达产物具有免疫活性。为进一步研究其生物学功能奠定基础。     

人白细胞介素-3基因cDNA的克隆及其真核表达质粒的构建

目的:克隆人白细胞介素-3(hIL-3)基因cDNA,构建其真核表达质粒pcDNA3/hIL-3。方法:从人外周血单个核细胞中提取IL-3mRNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增IL-3基因cDNA,通过T/A克隆法,首先构建pUCm-T/hIL-3,然后构建其真核表达型载体pcDNA3/IL-3。结果:pUCm-T/hIL-3内插入片段序列与hIL-3基因序列一致;pcDNA3/IL-3经酶切鉴定与预期结果一致。结论:成功完成了hIL-3基因克隆和pcDNA3/IL-3真核表达质粒的构建。     

腺病毒介导的神经营养素-3基因能够在大鼠脊髓前角运动神经元内过表达神经营养素-3

目的观察腺病毒介导的神经营养素-3(NT-3)基因在发出坐骨神经传出纤维的大鼠脊髓前角运动神经元的过表达。方法在坐骨神经内直接注射含有绿色荧光蛋白(GFP)基因(报告基因)的NT-3基因重组腺病毒(Ad-NT-3-GFP),7d后应用免疫荧光组织化学染色技术,在荧光显微镜下观察脊髓前角运动神经元的NT-3过表达。结果 GFP表达组(对照组)和NT-3加GFP表达组两组动物的L4和L5脊髓段横切片上,有绿色荧光蛋白阳性标记的细胞。在NT-3加GFP表达组,还可以观察到NT-3阳性标记的细胞,这种细胞能与绿色荧光蛋白阳性标记的细胞重合,是过表达NT-3的前角运动神经元。与GFP表达组的前角运动神经元形态比较,NT-3加GFP表达组的过表达NT-3的前角运动神经元呈现更富有分支的突起。结论腺病毒介导的NT-3基因能够在发出坐骨神经传出纤维的大鼠脊髓前角运动神经元内过表达NT-3,这为下一歩应用NT-3基因治疗策略修复实验性脊髓损伤提供初歩的实验资料。     

人BDNF的克隆、表达及其活性检测

为了研究脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗Parkinson病中的作用,采用RT-PCR技术,从人胚脑组织扩增及克隆了BDNF全长及其成熟蛋白编码基因,经测序证实后,将其分别克隆至表达载体pcDNA3.1与pGEX6p-1,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-BDNF和重组原核表达载体pGEX6p-BDNFs。pcDNA3.1-BDNF经脂质体介导转染至体外培养的E16胚鼠中脑星形胶质细胞,以G418筛选出抗性阳性克隆,该克隆株与E12-E14胚鼠中脑神经干细胞体外共培养,酪氨酸羟化酶免疫细胞化学反应显示,转染细胞株所表达的BDNF蛋白具有生物学活性,可延长前体细胞的存活并促进其向多巴肢神经元分化。将pGEX6p-BDNFs转化大肠杆菌,以IPTG诱导,获得了相对分子质量约为40 kD的GST-BDNF融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的10％,并经免疫印迹证实具有特异的免疫反应性。     

人源性神经营养素-6成熟肽基因融合表达载体的构建及表达产物的纯化

为了得到人源性神经营养素-6(N eurotroph in-6,NT-6)成熟肽片段,本研究以经测序鉴定的人源性NT-6 cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(Po lym erase cha in reaction,PCR)扩增得到NT-6蛋白成熟肽编码区基因片段;将该基因克隆到融合表达载体pGEX 1-λT,构建重组原核融合表达质粒pGEX-NT-6;在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy l-βD-th ioga lactos ide,IPTG)诱导的条件下,观察融合蛋白在大肠杆菌JM 109中的表达情况;利用蛋白回收试剂盒对表达产物进行纯化。结果表明经PCR扩增后,得到一分子量为460 bp左右的片段;含有该片段的重组质粒经电泳及双酶切鉴定表明,所得到的重组质粒即为含有目的片段的pGEX 1-NT-6;与带有pGEX 1-λT质粒的细菌相对照,pGEX 1-NT-6质粒转化的大肠杆菌JM 109,在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,该蛋白分子量为41 KD。获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量大约为15 KD的NT-6成熟肽。本研究成功构建了人源性NT-6成熟肽编码区基因融合表达载体,并纯化了其表达产物,为研究人源性NT-6的生物学功能奠定了基础。     

神经营养素-3的研究进展

神经营养素－３（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３，ＮＴ－３）是神经生长因子基因家族的成员，可促进多种中枢和外周神经元的存活和分化，调节神经元突触活动，并对神经系统发育和成熟起重要作用。ＮＴ－３在损伤条件下对神经元具有保护作用，因而在治疗神经系统疾病和神经损伤中有临床应用前景     

人神经营养素-3受体TrkC基因重组腺病毒载体的表达和生物学活性检测

目的探讨人神经营养素-3受体TrkC基因重组腺病毒载体（Adeno—TrkC）在神经干细胞内的表达及其对神经干细胞的生物活性作用。方法用RT-PCR检测Adeno—TrkC感染的293细胞的TrkCmRNA含量。用免疫细胞化学和Western blotting检测Adeno—TrkC感染的神经干细胞表达TrkC受体蛋白。在体外培养条件下,观察人神经营养素-3（NT-3）对感染了Adeno—TrkC的神经干细胞分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞的影响。结果在Adeno—TrkC感染的293细胞和神经干细胞中检测到TrkCmRNA和TrkC受体蛋白,且表达产物和其配体NT-3结合后能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞,分化率达到55．2％,均高于其他对照组。结论Adeno-TrkC能在神经干细胞内表达TrkC受体蛋白．这种TrkC受体蛋白具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞活性的作用,这为进一步应用NT-3和TrkC联合进行基因治疗中枢神经损伤研究奠定了基础。     

人血管内皮生长因子基因的克隆、表达及生物活性分析

目的 克隆人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因,构建真核表达载体,观察其对脐静脉内皮细胞的增殖作用和血管新生的影响。方法 利用RT-PCR方法,从人扁桃体组织中扩增人VEGF165 cDNA完整编码区,并构建成pcDNA3．1( )／VEGF165(简称pcDNA／V)重组体;应用脂质体介导的基因转移技术将构建的真核表达载体pcDNA／V体外转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC),MTT法检测其对内皮细胞增殖的影响。建立家兔下肢缺血模型,注射重组质粒pcDNA／V,pcDNA3．1( )空质粒作对照,选取不同时间点,行血管造影。结果 构建的真核表达载体pcDNA／V的酶切电泳分析和测序表明结果正确。pcDNA／V转染HUVEC能明显促进内皮细胞的分裂增殖。血管造影显示,术后基因治疗组远端动脉充盈早于对照组,新生血管数目也明显多于同时期对照组。结论 成功克隆了人VEGF165基因,构建了其真核表达载体。体内外生物学活性研究证实,重组质粒的表达产物具有刺激HUVEC增殖和促进缺血肢体侧枝循环建立的功能。     

人神经营养素-4成熟蛋白基因克隆

本研究的目的是克隆人神经营养素-4成熟蛋白基因(mhNT-4)并进行序列分析。应用PCR技术,以正常人血淋巴细胞染色体DNA为模板,扩增出人神经营养素-4(hNT-4)成熟蛋白编码基因。将所得基因片段重组于pGEM-T Easy质粒,筛选得到含人mhNT-4基因的阳性克隆。采用Sanger单链末端终止法测出全部的核苷酸序列。所得到的序列与国外文献所报道的结果(GenBank,M86528)完全相同。mhNT-4成熟蛋白基因的成功克隆,为研究其在原核细胞中的表达提供了有利条件。本文结果也提示不同人种间及不同个体间hNT-4成熟蛋白基因是相对保守的。     

鸡柔嫩艾美耳球虫江苏分离株5401基因的克隆、序列分析及原核表达

分别以孢子化卵囊及第2代裂殖子为材料,应用RT-PCR技术克隆了柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）江苏分离株5401基因。测序结果表明该序列全长为864bp,序列本身是一个开放阅读框,将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较,第174位和第287位发生突变,碱基分别由T突变为C,由C突变为T。第1个为无义突变,第2个突变引起第96位氨基酸由A变为V。其核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将所获5401基因克隆到pGEX-4T-2获得重组质粒pGEX-4T-2-5401,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达。用大鼠抗柔嫩艾美耳球虫子孢子高免血清对原核表达产物进行Western Blotting检测,结果表明有2条融合蛋白,大小分别为90kDa和80kDa左右。     

鸡柔嫩艾美尔球虫第二代裂殖子表面抗原MZ5-7基因的克隆、表位分析及原核表达

用RTPCR的方法,从感染柔嫩艾美尔球虫(Eimeriatenella)第5天的鸡盲肠分离的第二代裂殖子中克隆出MZ57基因,并进行抗原表位分析和原核表达,结果表明,MZ57基因ORF为945bp,与GenBank里已知序列(登录号为L08257)比较核甘酸和氨基酸同源性均为99.9%。应用DNAStar软件对该基因的抗原表位进行了分析,发现其B细胞表位广泛分布在80～300区域,其中80～130区域、190～220区域和300～320区域更为突出,而T细胞基序则集中在123～190区域和220～300区域。根据MZ57基因序列重新设计一对引物,PCR方法扩增出不含信号肽长度为885bp的基因序列,克隆到pET28b获得重组质粒pET28bMZ亚,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达,表达的融合蛋白约36.5kDa10poundnote,符合目的蛋白大小;同时应用Westernblot方法与抗第二代裂殖子和子孢子的2种高免血清反应,结果表明抗裂殖子和子孢子血清均能识别MZP(裂殖子蛋白,MZP,merozoiteprotein)。     

人抗—HBsFab段基因的序列分析及表达

对已建的噬菌体抗体库中分离的人抗－ＨＢｓ克隆进行了序列分析和表达研究，发现１９个克隆都具有相同的重链可变区基因，轻链可变区基因有４个相同，其余１５个未进行序列测定。ＤＮＡ序列分析表明ＶＨ、ＪＨ分属ＶＨＶＨⅢ和ＪＨ６，Ｄ段为二个Ｄ基因的融合，ＶＫ，ＪＫ属于ＶＫＩ和ＪＫ４。     

小鼠白细胞介素18的基因克隆及其融合蛋白的表达

白细胞介素１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８，ＩＬ－１８）是一种能诱导ＩＦＮ－γ产生的新型细胞因子，在调节Ｔｈ１型细胞免疫应答中起重要作用。采用逆转录ＰＣＲ从活化的小鼠腹腔巨噬细胞中获得了小鼠ＩＬ－１８（ｍＩＬ－１８）ｃＤＮＡ，测序鉴定正确的片段经ＥｃｏＲＩ酶切后克隆入ＧＳＴ融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，再转化至大肠杆菌ＤＨ５ａ高效表达，经纯化获得了有活性的ｍＩＬ－１８融合蛋白。