临床相关的脊髓损伤动物模型新进展

自1911年首个脊髓损伤动物模型建立以来,相继出现切割损伤型、牵拉损伤型、压迫损伤型和缺血损伤型等模拟临床不同环境的脊髓损伤动物模型。迄今,这些模型在建立过程中不断融入许多新技术:计算机控制的精确打击、定位下的精准切割,数字化的牵拉器及符合生物力学的脊髓压迫器等。科学技术的发展促进了脊髓损伤动物模型更加贴近不同的临床状态。     

Ischemia-reperfusion model in rat spinal cord: cell viability and apoptosis signaling study

This work aimed at determining the ideal ischemia time in an in vitro ischemia-reperfusion model of spinal cord injury. Rat spinal cord slices were prepared and then exposed or not to oxygen deprivation and low glucose (ODLG) for 30, 45, 60, 75 and 90 minutes. Cell viability was assessed by triphenyltetrazolium (TTC), lactate dehydrogenase (LDH) release, and fluorochrome dyes specific for cell dead (ethidium homodimer) using the apotome system. Glutamate release was enzymatically measured by a fluorescent method. Gene expression of apoptotic factors was assessed by real time RT-PCR. Whereas spinal cord slices exposed to ODLG exhibited mild increase in fluorescence for 30 minutes after the insult, the 45, 60, 75 and 90 minutes caused a 2-fold increase. ODLG exposure for 45, 60, 75 or 90 minutes, glutamate and LDH release were significantly elevated. nNOS mRNA expression was overexpressed for 45 minutes and moderately increased for 60 minutes in ODLG groups. Bax/bcl-xl ratio, caspase 9 and caspase 3 mRNA expressions were significantly increased for 45 minutes of ODLG, but not for 30, 60, 75 and 90 minutes. Results showed that cell viability reduction in the spinal cord was dependent on ischemic time, resulting in glutamate and LDH release. ODLG for 45 minutes was adequate for gene expression evaluation of proteins and proteases involved in apoptosis pathways.     

Treadmill measures of ambulation rates in ovine models of spinal cord injury and neuropathic pain

Our laboratories are developing treadmill-based gait analysis employing sheep to investigate potential efficacy of intra-dural spinal cord stimulation in the treatment of spinal cord injury and neuropathic pain. As part of efforts to establish the performance characteristics of the experimental arrangement, this study measured the treadmill speed via a tachometer, video belt-marker timing and ambulation-rate observations of the sheep. The data reveal a 0.1–0.3% residual drift in the baseline (unloaded) treadmill speed which increases with loading, but all three approaches agree on final speed to within 1.7%, at belt speeds of ≈4 km/h. Using the tachometer as the standard, the estimated upper limit on uncertainty in the video belt-marker approach is?±?0.18?km?h^?1 and the measured uncertainty is ±?0.15?km?h^?1. Employment of the latter method in determining timing differences between contralateral hoof strikes by the sheep suggests its utility in assessing severity of SCI and responses to therapeutic interventions.     

大鼠脊髓慢性压迫性损伤实验模型的建立

目的：建立一种新型大鼠脊髓慢性压迫实验动物模型，为探索脊髓受压后的病理生理机制奠定基础。方法：根据大鼠脊柱解剖结构特点自行设计一种大鼠脊髓压迫器，用以制作大鼠慢性压迫模型。运用行为学、影像学、TTC、HE、Tunnel等方法，了解动物行为学变化及受压节段脊髓病理学改变，以评价模型的可靠性。结果：脊髓压迫后渐次出现肌力减退、行动瘫痪；TTC结果显示，在各时段可见脊髓缺血范围与压迫时间及压迫强度相关；压迫后，脊髓出现组织水肿、神经元空泡化、白质疏网状改变及退行性变，以及神经元和胶质细胞的凋亡。结论：（1）用大鼠脊髓压迫器制作的大鼠脊髓慢性压迫缺血性损伤模型，具有方法简单、科学、重复性强等特点；（2）脊髓压迫程度可根据实验目的不同进行调节；（3）本实验为脊髓压迫性损伤机制的研究提供了一种理想的动物试验模型。     

大鼠脊髓全横断损伤后脊髓caspase-3的表达变化

目的观察大鼠脊髓全横断(SCT)后横断端细胞凋亡及caspase-3 mRNA、蛋白的表达变化并探讨其意义。方法SD大鼠90只,手术组(SCT组)动物选择在T10节段全横断脊髓,假手术组除不横断外其余步骤相同。TUNEL法检测脊髓横断端凋亡情况,免疫组织化学、RT-PCR、Western blot技术检测不同时间点caspase-3 mRNA、蛋白表达变化。结果SCT后横断端脊髓灰质白质均检测到凋亡细胞,caspase-3在损伤周围组织呈阳性,RT-PCR、Western blot显示1d组基因及蛋白均明显上调,3d、7d、14d、21d组mRNA逐渐下降,且3d组依然高于假手术组;3d、7d、14d组蛋白逐渐下降而21d组又略有回升,且3d、21d组依然高于假手术组。结论SCT后凋亡主要在早期出现,随时间进展呈逐渐下降趋势。     

兔颈脊髓半侧挫伤模型的建立及其MRI和组织学表现的研究

目的 建立兔颈脊髓半侧挫伤模型,观察不同程度损伤24小时后其MRI及组织学表现。方法 22只成年雄性新西兰兔,随机分为中度损伤组（n=9）、重度损伤组（n=9）和假手术组（n=4）。直径为3.0 mm的打击头由电磁伺服材料试验机驱动,对准C5脊髓左侧行高速挫伤（500 mm/s）。根据打击头的位移距离分为位移2.0 mm组（中度损伤组）和位移2.8 mm组(重度损伤组)。假手术组仅暴露C5脊髓,不进行挫伤。损伤后24小时每组随机取两例行MRI影像学检查,所有动物均取材进行组织学观察,测量横断面脊髓出血面积。 结果 中度损伤组打击力和位移分别为(2.47±0.39) N和(1.99±0.02) mm,重度损伤组打击力和位移分别为(5.16±0.82) N和(2.76±0.02) mm,中度损伤组的打击力明显小于重度损伤组（P<0.05）。MRI结果显示,中度及重度损伤组均可见C5左侧脊髓信号改变。HE染色显示脊髓左侧有明显的出血及脊髓组织结构破坏,中度损伤组损伤中心横截面出血面积（0.012±0.006）mm2明显小于重度损伤组（0.039±0.006）mm2（P<0.05）。 结论 本文建立的兔颈脊髓半侧挫伤模型能够控制挫伤位移,实现对脊髓的高速打击。不同程度的颈脊髓半侧挫伤在打击力、MRI影像学及组织学上均有不同。     

大鼠脊髓祖细胞的分离与体外培养

采用bFGF、EGF及神经元无血清培养基分离培养大鼠脊髓祖细胞，并对脊髓祖细胞进行了分化和电生理实验。脊髓祖细胞可增生分化成神经元和胶质细胞，并具有电流特性。有希望应用于脊髓创伤的治疗。     

大鼠脊髓横断伤后护理对生存质量及功能评分的影响

目的通过脊髓损伤(SCI)后的科学护理,探讨提高动物的生存率及生存质量的方法。方法制作SCI动物模型,分为A、B两组,脊髓横断伤不作护理为A组(非护理组),脊髓横断伤行术后护理为B组(护理组)。观察两组动物的生存率、生存质量及行为学评分(BBB),并进行比较。结果脊髓损伤护理组的生存率及生存质量与脊髓损伤非护理组比较,具有显著性差异(P<0.05),护理组高于非护理组。结论脊髓横断伤模型护理可提高动物生存率,改善生存质量,有助于提高实验动物的样本量。     

大鼠脊髓星形胶质细胞培养方法的改良

目的:改进大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养方法,为研究脊髓星形胶质细胞的生物学作用及脊髓相关疾病提供实验模型.方法:新生1～2d的SD乳鼠,无菌操作下游离整段脊柱,将脊髓从椎管中冲出,机械吹打制成单细胞悬液,差速黏附处理以去除成纤维细胞成分.利用GFAP免疫荧光显色对培养细胞进行鉴定.结果:经原代和传代培养,获得的星形胶质细胞纯化率高达99%以上.结论:采用本实验室改进的方法,操作简便快捷,培养的大鼠脊髓星形胶质细胞生长良好,纯度高,为后续实验对脊髓星形胶质细胞的生物学作用研究奠定实验基础.     

活性氧在脊髓损伤中的作用

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)治疗的实验性研究在18世纪就已经开始，研究者发现兴奋性毒性、Ca2+超载、神经元凋亡与氧化应激参与了神经损伤病理过程。近期研究中活性氧学说在脊髓损伤中的作用越来越受到研究者的重视，并有研究表明线粒体呼吸链、炎症反应中的呼吸爆发等多种途径参与了SCI后活性氧生成。本文在阐述活性氧生物学作用的同时，并结合近年来以活性氧为靶点的SCI治疗策略做一小结。     

脊髓挤压伤所致小胶质细胞的变化与血脊髓屏障的关系

为探讨脊髓损伤时血脊髓屏障的破坏和小胶质细胞被激活两者之间的关系,本实验用大鼠脊髓挤压伤模型进行了研究。将成年雄性SD大鼠64只,随机分为对照组及脊髓挤压伤后0h、8h、24h、72h、1w、2w、4w等8组。分别以HE染色观察病理变化,小胶质特异性标记物OX-42的免疫荧光组化染色观察小胶质细胞,股静脉伊文思蓝注射观察血脊髓屏障的变化。结果显示,脊髓损伤面积在伤后8h组明显扩大,72h达顶峰,1w组时面积回缩并维持到实验最后(4w)。在伤后24h组可观察到活化的小胶质细胞,其后一部分迁移入损伤区内,吞噬坏死组织,变成巨噬细胞。至4w时,HE染色切片上仍可在伤区内见到小胶质巨噬细胞。伤区外活化的小胶质细胞仍可见于伤后4w。伊文思蓝不能通过正常的血脊髓屏障,脊髓挤压伤后即可进入脊髓,分布于损伤区及其邻近。至1w时脊髓内已无伊文思蓝,血脊髓屏障恢复正常。此现象与脊髓伤后活化的小胶质细胞长期存在的事实不一致。活化的小胶质细胞可损坏血脊髓屏障,血脊髓屏障在脊髓挤压伤后1w已恢复,而活化的小胶质细胞却可在伤后长期存在,说明单纯激活的小胶质细胞不足以破坏血脊髓屏障。     

神经干细胞移植对小鼠脊髓损伤的影响

目的观察神经干细胞(NSCs)移植对脊髓损伤(SCI)小鼠功能恢复的影响。方法分离、培养、增殖和纯化E14-17d小鼠的NSCs,并通过免疫荧光法对其进行鉴定。将绿色荧光蛋白转基因小鼠的NSCs移植到小鼠脊髓损伤模型体内,术后进行行为学和病理学检测,观察小鼠功能恢复情况。运用改良Allen's法制备小鼠T10-T11脊髓损伤动物模型,动物分为假手术组(12只)、模型组(12只),治疗组(12只)和对照组6(12只)。治疗组每只小鼠自眶静脉注射NSCs悬液200μl(2×10个细胞),对照组只注射DMEM/F12培养基200μl。术后1d、3d、7d、14d、21d、28d和56d,进行BBB运动功能评分和病理学检测,观察植入区细胞生长变化情况。结果 BBB评分显示:治疗组明显高于对照组(<0.01),治疗组与假手术组相比没有明显差异(>0.05),说明NSCs移植后小鼠的行为学得到了明显改善,功能有所恢复。病理学检测发现,移植后NSCs不仅迁移到脊髓损伤区,而且与宿主细胞较好地整合。结论移植的E14-17d胚胎小鼠NSCs不仅可在脊髓损伤部位存活并和宿主细胞整合,而且可促进小鼠后肢运动功能恢复。     

腓肠神经移植修复大鼠陈旧性脊髓损伤的作用

目的:探讨利用自体周围神经组织移植修复大鼠陈旧性脊髓损伤病理机制,为临床应用提供实验依据。方法:利用改良Allens撞击方法建立脊髓打击损伤模型,12周后,将大鼠分为2组,实验组切取后肢腓肠神经,利用显微外科技术去除神经外膜,将其修剪成小段,游离移植于脊髓损伤处,对照组不作处理。分别于术后2、4、12周,在光镜及电镜下观察脊髓损伤段及移植周围神经再生情况。术后4、8及12周分别对两组动物进行脊髓诱发电位检查。结果:对照组脊髓变性,可见瘢痕和空洞,实验组术后12周,损伤区脊髓与周围神经融合良好。脊髓诱发电位检查神经移植组优于对照组。结论:周围神经组织游离移植修复大鼠陈旧性脊髓损伤后,存活良好,为再生轴突跨越损伤段脊髓提供通道。     

大鼠脊髓损伤后植入人发角蛋白的实验研究

目的：研究人发角蛋白（HHK）在脊髓损伤（SCI）修复中诱导和促进神经元和神经纤维的再生以及HHK在脊髓中的降解机理。方法：选用12只成年雌性SD大鼠,采用改制的II型NYU装置,建立SCI组,SCI后植入HHK组,并设正常对照组,分别于术后14d取材,经HE,Mallory's－磷钨酸－苏木素,Loyer'sSterry Thionin等方法染色,观察其光镜结构的变化。结果：与损伤组相比较,植入HHK组损伤节段的萎缩程度明显,然质中部分神经元残存,有髓神经纤维脱髓鞘现象减轻,HHK周边集聚大量巨噬细胞和胶质细胞,植入的HHK毛小皮膨胀松弛,出现与皮质层分离,皮质层内出现皲裂,中央髓质腔增大,结论：植入HHK具有减轻脊髓损伤后的继发性损伤的作用,为进一步研究HHK在SCI修复过程中的作用及机理提供了形态学基础。     

川芎嗪促进脊髓损伤修复的研究进展

川芎嗪应用于临床治疗心脑血管疾病、呼吸系统疾病、肾脏疾病和肝硬化等疾病已有多年,对治疗脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的相关研究也逐年增多。近年来,关于川芎嗪治疗脊髓损伤的临床试验和动物实验不断增多,主要机制包括抑制细胞凋亡和炎症反应、降低内皮素含量、改变血液流变学、增加神经丝蛋白和神经营养因子表达、保护线粒体和改善细胞内外离子紊乱。     

低氧预处理脐带间充质干细胞移植促进大鼠脊髓损伤修复

目的:评估低氧预处理脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)移植修复大鼠急性脊髓损伤的作用并初步探讨其机制。方法:分别于常氧和低氧条件下培养UCMSCs,细胞免疫荧光鉴定细胞,ELISA测定细胞脑源性生长因子(BDNF)、血管源性生长因子(VEGF)、睫状生长因子(CNTF)和肝细胞生长因子(HGF)的浓度。采用改良的Al1en’s法(2.5 g×10 cm)建立60只大鼠T10脊髓损伤模型,随机分为假手术组、模型组、低氧细胞移植组及常氧细胞移植组,每组20只,损伤后即刻移植1×10~6个细胞至低氧细胞移植组及常氧细胞移植组动物脊髓内。术前及术后每周进行运动功能BBB评分;采用免疫荧光法检测移植细胞的存活、神经细胞凋亡;采用ELISA法检测细胞移植第2、14、28 d脊髓组织肝细胞生长因子的浓度。结果:在低氧组,体外由UCMSCs分泌的BDNF、VEGF、CNTF和HGF浓度显著高于常氧组细胞。与模型组比较,细胞移植组运动功能评分和HGF含量增加,而神经细胞的凋亡率降低,但以低氧细胞移植组改变最明显。结论:低氧预处理的UMCSCs具有提高神经营养因子分泌作用,其机制可能与下调神经细胞凋亡,增加受损脊髓组织HGF有关。     

The neuroprotective effects of fibronectin mats and fibronectin peptides following spinal cord injury in the rat

We have shown previously that mats made from the glycoprotein fibronectin are permissive for axonal growth when implanted into the injured spinal cord. Recent evidence has indicated that fibronectin and its peptides also have neuroprotective effects in the CNS. We have therefore examined the neuroprotective effects of fibronectin applied to a spinal cord injury site. Adult rats with fibronectin mats implanted into a spinal cord lesion cavity had decreased apoptosis in the intact adjoining spinal cord tissue at 1 and 3 days post-injury compared to rats that had gelfoam implanted into the lesion cavity. Rats with fibronectin mat implants also showed enhanced hindlimb locomotor performance for the first 3 weeks post-surgery compared to control animals. To further examine the neuroprotective potential of fibronectin following spinal cord injury, we examined the effects of placing fibronectin mats over the site of a spinal cord hemisection or of delivering a solution derived from a dissolved fibronectin mat. The effects of these treatments were compared with control animals and animals that were treated with a fibronectin peptide (PRARIY) that has been shown to decrease secondary damage in a rodent model of cerebral ischemia. Results showed that both types of fibronectin mat treatment resulted in decreased lesion size, apoptosis, and axonal damage within the first week post-injury compared to control animals and were comparable in their neuroprotective efficacy to treatment with the fibronectin peptide. The results of the current study indicate that fibronectin based biomaterials have neuroprotective effects following spinal cord injury, in addition to their previously reported ability to promote axonal regeneration.     

基于体素的形态学分析在脊髓损伤中的研究进展

创伤性脊髓损伤（SCI）通常会导致大脑皮质发生继发性损害,造成神经元凋亡或萎缩。基于体素的形态学（VBM） 技术凭借其无创性、精确性的优点,已在SCI患者大脑微观结构变化的研究中得到了广泛应用。本文主要从损伤后皮质 萎缩情况及其与患者临床表现间相关性的横向研究结果,损伤早期进行性神经退变的时空模式及其对患者临床结果预测 能力的纵向研究结果,损伤持续时间（亚急性、慢性等）、损伤严重程度（完全性、不完全性等）、临床康复情况（感觉运动功 能、神经性疼痛等）等因素对研究结果的不同影响这3个方面对VBM在SCI中的研究进展进行综述,并指出未来研究应进 一步提高VBM技术的可靠性,同时完善研究方案的设计,以促进VBM在脑功能探索和SCI康复治疗中的作用。     

一种新型颈椎骨折错位的大鼠原发性脊髓损伤模型

目的　模拟临床建立一种大鼠颈椎骨折错位的原发性脊髓损伤模型。 方法　依据大鼠颈椎解剖特点,自行研制的头侧椎夹固定C3和C4,连接固定于大鼠立体定位架上。尾侧椎夹固定C5和C6并连接到材料试验机,以定速向背侧错位后返回原位,产生C4~5骨折错位和脊髓损伤。按上述方法在8只雄性大鼠C4~5产生骨折错位1.90 mm,错位速度2 mm/s。损伤后立刻行心脏灌注固定,HE染色分析脊髓出血量。 结果 C4~5椎间盘均在C4下终板处断裂,椎间盘破坏的错位位移为(1.00±0.17)mm,最大力为(12.7±5.1)N。肉眼观察到脊髓均有出血,脊髓背侧有两条对称的淤血带,或者色泽较深的出血点;HE染色进一步显示脊髓C4和C5节段的出血主要集中在灰质,而白质有分散的出血点,且背侧较腹侧多,脊髓总出血量为(2.46×10-3±1.26×10-3)ml。 结论 该动物模型可以产生颈椎骨折错位和脊髓损伤,是一种新型的与临床相关的原发性脊髓损伤模型。