转化生长因子β1活化肝星状细胞反式激活新基因剪切体的功能

目的 探讨反式激活新基因剪切体TTG 1 A的生物学功能和参与肝纤维化的致病机制.方法 应用酵母双杂交系统3,将PCR扩增的TTG1A基因与酵母表达载体pGBKT7连接,转化酵母细胞AH109,并在其内表达,而后与转化了人白细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上进行双重筛选,提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经Bgl Ⅱ酶切后测序,进行生物信息学分析. 结果成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTGlA.应用酵母双杂交系统3从人白细胞文库中筛选出19个与TTGlA相互作用的蛋白,其中包括人类主要组织相容性复合物Ⅱ型DP D(HLA-DP β),人类核糖体蛋白L30、人类核磷蛋白B23、人类核组蛋白2、人类ash2、人类变异的家族性睥性贫血和变异的异染性脑白质营养不良相关蛋白,人类死亡因子4(MORF4L1)、人类遍在蛋白偶连酶E2L3、人类载脂蛋白A-1(APOA1)、人类半乳凝素1以及5个未知功能蛋白. 结论 成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTGlA,初步揭示了新基因TTGlA的生物学功能,为进一步研究TGF β1介导的肝纤维化分子发病机制中的作用提供基础.     

Wnt抑制因子-1对肝星状细胞活化的影响

目的观察wnt抑制因子-1（WIF）对转化生长因子β1（TGF-β1）活化肝星状细胞（HSC）的影响。方法构建真核表达质粒pEGFP-C1-WIF并通过脂质体介导方法,将pEGFP-C1-WIF转染体外培养的HSC-T6细胞株,用TGF-β1刺激转染（试验组）和未转染的HSC-T6细胞株（对照组）,并用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组细胞（包括正常细胞组）smad3、β-连环蛋白（β-catenin）mRNA及其蛋白质的表达。结果试验组HSC-T6细胞株smad3、β-catenin mRNA及蛋白质表达明显低于正常组HSC-T6细胞株,更低于对照组HSC-T6细胞株（P〈0.05）。β-catenin和smad3蛋白质的表达均与α-肌动蛋白（α-SMA）蛋白质的表达显著相关（r=0.800,P〈0.01;r=0.743,P〈0.01）。结论 WIF能通过下调wnt/β-catenin以及TGF-β1/smads信号通路的生物学效应抑制HSC-T6细胞的活化,从而延缓肝纤维化的发展。     

转化生长因子β对肝星状细胞活化的调控作用

在肝纤维化过程中,TGFβ被认为是引起肝星状细胞(HSC)活化及细胞外基质产生的重要调控因子,因此,靶向TGFβ引起的HSC活化和肝纤维化的治疗策略值得深入研究。介绍了近几年来有关TGFβ对HSC的活化作用及其相关调控、靶向TGFβ活化HSC的治疗策略,以期为肝纤维化的临床治疗提供理论依据与新思路。     

锌α2糖蛋白抑制肝星状细胞活化和增殖的体外研究

目的探讨锌α2糖蛋白(AZGP1)在肝星状细胞活化和肝纤维化发生和发展中的作用机制。方法采用转化生长因子-β1刺激诱导人肝星状细胞株LX2活化和构建四氯化碳小鼠肝纤维化模型,观察细胞和肝组织中AZGP1的表达情况。应用质粒转染法过表达和抑制表达AZGP1后,分别检测LX2细胞的活化、增殖和凋亡功能及相关因子的改变。多组间比较采用单因素方差分析。结果免疫荧光染色结果显示在活化的LX2细胞中,AZGP1蛋白减少而α-平滑肌肌动蛋白增多,二者呈负相关。AZGP1基因和蛋白在活化的LX2细胞和四氯化碳肝纤维化小鼠的肝组织内显著低表达。过表达AZGP1后,LX2细胞中Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶-2和α-平滑肌肌动蛋白基因和蛋白明显下调;细胞荧光显示过表达AZGP1的细胞活化和α-平滑肌肌动蛋白减少。此外,过表达AZGP1后,LX2细胞的增殖活性和G1/S-特异性周期蛋白D1蛋白显著降低;细胞周期实验显示过表达AZGP1的细胞停滞在G0/G1期比例显著增多、而S期比例显著减少。AZGP1对LX2细胞凋亡无明显影响。结论AZGP1可通过抑制肝星状细胞活化和增殖而逆转肝纤维化;过表达AZGP1有望成为肝纤维化治疗的新靶点。     

外源性转化生长因子β1对大鼠原代肝星状细胞活化的影响

目的探讨大鼠原代肝星状细胞(HSC)体外培养过程中,不同时期外源性转化生长因子β1(TGF-β1)对其活化的影响及相关因素的变化.方法分离大鼠原代HSC,于无包被的塑料培养板上分别培养2,3,4,5,6,7 d时予TGF-β15 μg/L处理24 h,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,应用Western blot法检测处理前后细胞α-肌动蛋白(α-SMA)的变化,及活化过程中TGF-β1Ⅱ型受体(TβR-Ⅱ)的表达.结果HSC在体外培养过程中,不同培养时间对TGF-β1的刺激活化作用反应不同.TGF-β1处理后,对培养2,3,4,5 d HSC的活化有促进作用,以对培养第3天的细胞作用最明显,其α-SMA表达增加78.05%,而培养6,7 d的HSC的形态和α-SMA变化不明显.培养第7天的HSC比培养第3天的细胞TβR-Ⅱ表达增高(3.30±0.83 vs 1.55±0.38,P＜0.05).结论TGF-β1对处部分活化状态中某阶段细胞的活化具有促进作用.完全活化的细胞对TGF-β1的刺激活化作用不敏感,原因与TβR-Ⅱ的表达量无关.     

α-亚麻酸对转化生长因子β1诱导的肝星状细胞的影响

目的:探讨α-亚麻酸(α-linolenic acid,ALA)对转化生长因子1(transforming growth factor-β,TGF-β1)诱导的肝星状细胞(hepatic satellite cell,HSC)增殖及分泌功能的影响.方法:采用活化的HSC作为研究模型,将传代的细胞分为5组,以MTT比色法观察ALA对HSC的增殖效应,以ELASA检测细胞培养上清液中Ⅰ型及Ⅲ型胶原的含量,以Westernblot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达.结果:TGF-β1能诱导HSC增殖并促进胶原的分泌,ALA可不同程度抑制TGF-β1所诱导的HSC增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原和α-SMA的表达(P<0.01),且呈剂量依赖性(P<0.05).结论:ALA在高浓度时对TGF-β1能诱导的HSC起抑制作用,可能对脂肪性肝纤维化及其引起的肝硬化有治疗作用.     

肝星状细胞中的TGFβ信号转导通路

肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纤维化形成的中心环节,转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)启动了肝星状细胞的活化,TGFβ信号在HSC内主要通过ALK5/smad2/3途径在HSC内传递,而近年来的研究表明,ALK1/smad 1/5途径及非smad信号也起非常重要的作用.有必要对HSC中复杂的TGFβ信号进行研究,为有效抗TGFβ治疗肝纤维化提供依据.     

活化肝星状细胞的信号传导

肝纤维化是肝脏对各种急慢性肝损伤的疤痕修复反应的结果,是各种慢性肝病向肝硬化进展的共同环节,其最主要的特征是以胶原为主的细胞外基质(ECM)的生成与降解失衡,在肝脏中的过度沉积.活化的肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发生时ECM的主要来源.HSC持续激活后增殖、迁移和表型转化,成为肌成纤维样细胞,是肝纤维化发生和发展的核心环节.活化HSC具有如下特点:(1)合成和分泌间质胶原等各种ECM;(2)自分泌产生致纤维化细胞因子如转化生长因子(TGF)β I;(3)释放胶原酶抑制物组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP);(4)分泌趋化因子及其他炎症性细胞因子;(5)具有细胞收缩特性;(6)合成基质金属蛋白酶(MMP),使ECM降解异常;(7)对凋亡刺激的耐受性等.     

转化生长因子β1对大鼠肝星状细胞表达β-连环蛋白的影响

目的研究转化生长因子β1（TGF—β1）对大鼠肝星状细胞（HSC）表达β-连环蛋白（β-catenin）的影响。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）比较经不同浓度的TGF-β1刺激不同时间后HSC表达β-catenin、smad3和α-SMA mRNA的变化,并比较三者之间的关系。结果1ng／ml TGF—β1刺激2h后,HSC表达β—catenin mRNA、smad3 mRNA和α—SMA mRNA量最大,β—catenin mRNA表达与两者均具有明显的相关关系（r=0．947,P〈0．01;r=0．950,P〈0．01）。结论β—catenin在TGF—β1活化HSC的过程中发挥重要作用。     

肝星状细胞的抗原提呈特性

肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC),曾被称为Ito细胞、窦周细胞、脂细胞和贮脂细胞.由德国学者Kupffer在1876年首先用氯化金染色确认,称之为sternzellen,当时曾被误认为是一种肝内吞噬细胞.1951年,Ito用电镜观察将窦周HSC与窦内Kupffer细胞(肝吞噬细胞)予以清楚鉴别.1996年国际上将该细胞统一命名为HSC[1].     

Hedgehog通路与肝纤维化及肝星状细胞活化的关系研究

目的:探讨Hedgehog通路与肝纤维化及肝星状细胞(HSC)活化的关系.方法:清洁级SD雄性大鼠20只,均分为模型组和对照组.模型组采用腹腔注射四氯化碳(CCl4)和高脂饮食诱导肝纤维化,对照组予以正常饮食.第8周末取模型组存活大鼠与对照组中大鼠各5只处死,取左叶肝脏组织.HE、Masson染色观察两组肝组织病理变化;逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测纤维化大鼠肝脏中表达Hedgehog通路成员超音速Hedgehog信号通路(Shh)、膜受体patched(Ptc)、smoothened(Smo)和核转录因子Gli表达;实时荧光定量PCR法检测Hedgehog通路成员及HSC活化标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA在两组大鼠肝脏中的表达差异.体外培养HSC-T6细胞,RT-PCR检测HSC-T6细胞株中Hedgehog通路成员的表达;四甲基偶氮唑盐比色分析(MTT)法检测不同浓度环耙明(Cyclopamine,Cyc)对HSC-T6增殖的影响;分别用0、100/μmol/L的Cye干预HSC-T6,实时荧光定量PCR法检测Shh、Smo、Ptc、Gli-1及αSMA mRNA表达差异.结果:模型组大鼠肝脏有大量脂质及胶原沉积,且肝脏组织中均有Shh、Smo、Ptc、Gli-1表达.荧光定量PCR结果示模型组大鼠Shh、Smo、Gli-1及αSMA mRNA表达均较对照大鼠升高(20.45±3.31、12.78±0.53、10.88±2.41、4.91±2.59比1;P值均<0.05).Cyc在体外对HSC-T6有明显的抑制作用,且抑制作用呈剂量依赖性(F=636.81,P<0.01).荧光定量PCR结果示,用Cyc 100 μmol/L干预的HSC-T6中,Ptc、Smo、Gli-1和αSMA表达量分别为0.20±0.11、0.21±0.08、0.28±0.05和0.27±0.10,与Cyc 0μmol/L干预比较差异均有统计学意义(P值均<0.01).结论:肝纤维化过程中Hedgehog通路成员表达增高,抑制Hedgehog通路可抑制HSC活化,推测Hedgehog通路通过活化HSC促进肝纤维化的发生.     

肝星状细胞的去活化机制与抗肝纤维化治疗

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整合素αvβ3在肝星状细胞和肝纤维化组织中的表达

目的 研究整合素avβ3在肝星状细胞和纤维化肝组织中的表达,探讨能反映肝星状细胞活化状态的表型受体.方法 分离大鼠肝星状细胞,体外培养激活.硫代乙酰胺175 mg/kg每周2次,连续12周腹腔注射诱导大鼠肝纤维化.免疫染色观察细胞和组织中整合avβ3和a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达.实时PCR和Western印迹法分析avβ3在星状细胞中、正常和肝纤维化组织中的表达.结果 活化星状细胞中avβ3表达明显上调,与第1天相比,第14天的mRNA和蛋白质水平分别增加18倍和5.2倍.免疫染色整合素avβ3成簇极性表达于活化星状细胞的胞膜.肝纤维化模型中avβ3在mRNA和蛋白水平明显高于正常对照(t=2.39,P＜0.05;t=2.74,P＜0.05),正常肝组织中a-SMA和avβ3局限表达于门静脉周围,肝纤维化组织中a-SMA和avβ3表达于扩大的门管区和纤维间隔.结论 体内外活化星状细胞中整合素avβ3表达水平上调,它是星状细胞活化的表型受体,参与肝纤维化的发生.     

调控Notch信号对肝星状细胞活化的影响

目的 探讨肝星状细胞(HSC-T6)内是否存在功能激活的Notch信号分子以及调控Notch信号转导对HSC-T6活化的影响. 方法 用PCR方法检测Notch信号分子mRNA在HSC-T6细胞内的表达,TaqMan探针检测转化生长因子(TGF)β 1刺激HSC-T6后Notch信号分子的表达变化.细胞免疫荧光法检测Notch3和Jagged1在HSC-T6内的表达定位.用携带Notch3胞内域(ICD)的真核表达质粒pcDNA3.1-N3ICD和特异性干扰Notch3的siRNA(Notch3-siRNA)分别转染HSC-T6细胞,Western blot检测Notch3、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)和Ⅰ型胶原的表达变化.对数据采用t检验和方差分析. 结果 HSC-T6细胞内存在功能激活的Notch信号转导.TGF β 1(2.0 ng/ml)刺激HSC-T6导致Jagged1、Notch3和HES-1的mRNA水平明显上调,分别提高了2.9、3.2、2.2倍,F值分别为2543.482,287.982和1719.851,P值均＜0.01.pcDNA3.1-N3ICD转染后促使HSC-T6合成α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白增加,较对照组分别提高了5.8倍和4.5倍,t值分别为13.157和9.810,P值均＜0.01;相反,Notch3- siRNA明显抑制HSC-T6表达α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白,较对照组分别下降了约90％和84％,t值分别为19.863和10.376,P值均＜0.01.而且,Notch3-siRNA能拮抗TGFβ1诱导HSC-T6表达α-SMA和Ⅰ型胶原的作用.结论 Notch信号通路可能通过调控肝星状细胞的活化参与肝纤维化的形成,选择性地干预Notch3信号转导可能成为抗肝纤维化的新途径.     

MicroRNAs在肝星状细胞活化过程中表达差异谱的研究

目的 应用MicroRNAs基因芯片技术筛选静止和活化肝星状细胞差异表达的MicroRNAs.方法 用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流,Nycodenz密度梯度离心分离大鼠HSCs,并进行体外培养,借助荧光倒置显微镜观察细胞形态,MicroRNAs基因芯片技术和荧光定量PCR检验MicroRNAs在HSCs静止期(2天)和活化期(14天)的表达.结果 HSCs的miRNAs表达谱中差异表达miRNAs共21个,其中上调12个,下调9个(P＜0.01);荧光定量RT-PCR证实其表达水平在静止和活化期肝星状细胞中均有差异(P＜0.01).结论 MicroRNAs基因芯片筛选差异表达miRNAs可望为肝纤维化的基因治疗提供全新的靶标和策略,为肝纤维化的发病机制和诊断治疗研究提供了新的思路.     

木犀草素抑制肝星状细胞增殖及其胶原合成

目的 研究木犀草素对体外培养的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)增殖及其胶原表达、合成的影响。方法 从Wistar大鼠肝脏分离培养HSC,并用~3H-TdR和~3H-pro同位素掺入实验,基因探针原位杂交等技术研究了木犀草素对HSC增殖、胶原基因表达合成的影响。结果 当木犀草素的浓度分别达到10 μmol/L和20 μmol/L 时抑制HSC增殖(t=2.542,P＜0.05)和胶原合成(t=3.650,P＜0.01),其作用具有剂量依赖关系;25 μmol/L木犀草素使Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达降低,其中Ⅰ型前胶原基因表达降低具有统计学差异(x~2=6.850,P＜0.01)。结论 木犀草素在体外抑制HSC增殖和胶原表达合成,在体内可能会具有预防或冶疗肝纤维化的作用。