功能未知基因C16orf68在不同肝细胞系内的表达特征

目的获取人基因C16orf68,构建原核表达载体,诱导重组蛋白的表达,制备兔抗C16orf68蛋白多克隆抗体,观察C16orf68在各细胞系的表达特征。方法用RT-PCR技术,从肝星状细胞系LX2的总RNA中获得编码C16orf68基因功能片段的cDNA,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-C16orf68,并导入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达重组的重组蛋白。利用Western blot技术、生物质谱技术对表达的C16orf68进行确认。利用纯化的C16orf68重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗C16orf68蛋白的多克隆抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。利用Western blot技术观察C16orf68在多个细胞系的表达特征。结果扩增获得C16orf68基因片段,测序结果与GenBank已公开的基因序列相一致,成功表达了C16orf68重组蛋白,经Western blot鉴定、生物质谱Q-TOF分析均显示表达正确。利用纯化后的重组蛋白,制备了兔抗人C16orf68多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价〉1：320 000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好,Western blot结果显示各细胞系该蛋白主要表达于肝实质细胞。结论 C16orf68在肝脏主要表达于肝实质细胞,可能与肝细胞损伤相关。     

功能未知基因C17orf77重组蛋白及多克隆抗体的制备

目的体外克隆表达C17orf77重组蛋白,制备其多克隆抗体,初步探索该蛋白的生物学作用,观察其细胞系分布特征。方法以HepG2细胞cDNA为模板,PCR扩增C17orf77目的基因片段,构建pET-32a(+)-C17orf77原核表达载体。转化大肠埃希菌,IPTG诱导C17orf77重组蛋白表达并进行Western blot鉴定。以重组蛋白免疫大耳白兔,获得兔抗C17orf77蛋白多克隆抗体,并分析其特异性及检测效价。MTT法观察不同浓度重组蛋白对HepG2细胞增殖的影响。利用Western blot观察C17orf77蛋白在HepG2、L02、LX2和Jurkat细胞系的表达情况。结果 PCR扩增获得C17orf77基因片段,成功诱导表达了C17orf77重组蛋白。制备了多克隆抗-C17orf77,ELISA检测抗体效价1∶1280000。不同浓度C17orf77重组蛋白对HepG2细胞无明显增殖促进或抑制活性(P0.05)。C17orf77蛋白在HepG2、L02、LX2和Jurkat细胞系均有分布。结论利用体外克隆表达的C17orf77重组蛋白可制备效价和特异性均较高的多克隆抗体。HBV感染相关基因C17orf77在体外肝脏的间质和实质细胞,以及CD4+T细胞系(Jurkat细胞)均有不同程度的表达。提示该基因可能与HBV感染的致病过程相关。     

新型冠状病毒Nsp16蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备北大核心CSCD

目的原核表达新型冠状病毒Nsp16重组蛋白并制备兔抗Nsp16多克隆抗体。方法通过琼脂糖凝胶电泳对含有Nsp16基因的重组质粒进行双酶切鉴定,并将鉴定后的重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞;通过IPTG诱导重组蛋白的表达,利用镍柱亲和层析法纯化该重组蛋白并进行Western blot鉴定;将鉴定后的目的蛋白与弗氏佐剂以1:1的体积比混匀,乳化后免疫新西兰大白兔,利用ELISA和Western blot分别进行多克隆抗体效价的测定及其特异性鉴定。结果Nsp16基因重组质粒经双酶切后得到912bp的目的片段,重组质粒转化大肠埃希菌表达出分子质量单位为33.3ku的重组蛋白,且主要存在于上清中。用纯化的重组蛋白免疫大白兔,获得兔抗Nsp16特异性多克隆抗体,且其效价达1:409600以上。结论重组Nsp16蛋白可以在大肠埃希菌中正确表达,免疫大白兔后获得高效价抗Nsp16多克隆抗体,即具有免疫反应性。为SARS-CoV-2Nsp16蛋白在新型冠状病毒肺炎中的进一步研究奠定了基础。     

C9orf47-1重组蛋白的克隆表达及其对HepG2细胞周期的调控作用

目的克隆表达C9orf47-1蛋白,探索其可能的生物学功能。方法构建C9orf47-1原核表达载体,转化BL21,IPTG诱导目的蛋白表达;纯化目的蛋白,制备兔源多克隆抗体;采用生物信息学软件对C9orf47-1蛋白进行生物信息学分析;采用Western blot检测其在HepG2、L02、LX2和Jurkat细胞系的表达情况,及重组蛋白对HepG2细胞内质网应激的影响;采用流式细胞术检测其对HepG2细胞周期的影响。结果 PCR扩增获得序列完全正确的C9orf47-1基因片段,构建的C9orf47-1原核表达载体能在大肠埃希菌中以包涵体的形式表达C9orf47-1重组蛋白;重组蛋白经Ni-NTA纯化后免疫大耳白兔,获得的多克隆抗体效价高达1∶640 000,并识别C9orf47-1蛋白;C9orf47-1蛋白在4种细胞系中均有表达,其中在HepG2和Jurkat中的表达量高于L02和LX2;重组蛋白未引起HepG2细胞的内质网应激,但可引起细胞周期的变化：延长G1、G2期,缩短S期（P〈0.05）。结论 C9orf47-1重组蛋白具有抗原性,该蛋白对肝细胞周期（G2/S）有一定的阻滞作用。     

淋球菌MlaA重组蛋白表达及多克隆抗体的制备与应用

目的 原核表达、纯化淋球菌MlaA蛋白,制备并鉴定其多克隆抗体。方法 构建原核表达载体pET-28a-MlaA,转化BL21(DE3)大肠埃希菌,经IPTG诱导重组蛋白的表达。通过亲和层析法纯化目的蛋白,并进行Western blot鉴定。以纯化的重组蛋白作为抗原,与佐剂乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后取小鼠静脉血并分离血清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定抗体效价,用Western blot、间接免疫荧光试验(IFA)和流式细胞术(FCM)检测MlaA多克隆抗体的反应性和特异性。结果 Western blot显示,pET-28a-MlaA转化BL21后表达相对分子质量为35×10³的淋球菌MlaA重组蛋白。ELISA检测MlaA免疫小鼠血清抗体效价为1∶8 000～1∶32 000。Western blot、IFA和流式细胞术检测制备的抗体能识别淋球菌变性和非变性MlaA蛋白。结论 成功表达并纯化淋球菌MlaA重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,将制备的抗体血清作为一抗对淋球菌及其他不同类菌株进行Western Blot检测后发现,制备的多克隆...     

犬瘟热病毒M蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的对犬瘟热病毒(CDV)弱毒株M基因进行克隆及原核表达,并制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。方法针对犬瘟热病毒弱毒株(CDV-LP)的M基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)并转化至宿主菌BL21(DE3),在0.4mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化的M蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。结果通过RT-PCR成功扩增出大小为1 014bp的CDV M基因,构建的重组质粒pET-30a(+)-M在大肠埃希菌中诱导表达出分子质量单位为43ku的重组M蛋白,与预期值相符;重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western blot检测显示M重组蛋白能被抗CDV多克隆抗体识别;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应。结论本研究成功构建了pET-30a(+)-M并表达了CDV M蛋白,制备了鼠多克隆抗体,为建立CDV M蛋白的ELISA抗原检测方法,鉴定表达M蛋白的重组杆状病毒奠定了基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原TPx蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体制备

目的 原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原(Excretory secretory antigen, ESA)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase, TPx),并纯化TPx蛋白及制备兔多克隆抗体。方法 通过全基因合成的方法PCR扩增TPx基因。将扩增的TPx基因克隆至原核表达质粒pET30a载体中,构建重组质粒pET30a-TPx并转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,12%SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。用Ni-IDA亲和层析柱进行纯化,Western blot鉴定TPx重组蛋白的纯化效果。用纯化的TPx重组蛋白免疫新西兰兔,制备TPx多克隆抗体,ELISA测定纯化抗体的效价。结果 成功构建重组质粒pET30a-TPx,经IPTG诱导表达,获得以可溶性形式高效表达的TPx重组蛋白,相对分子质量约为22.43×10³,纯化后的带有His标签的TPx重组蛋白能被兔抗血清识别。用纯化的TPx重组蛋白免疫新西兰兔,获得TPx多克隆抗体,其ELISA效价为1∶1 126 400,抗体纯度为85...     

TgMIC6的优化表达及其多克隆抗体的制备北大核心CSCD

目的原核表达弓形虫微线体蛋白6(TgMIC6)结构功能域,并制备其多克隆抗体。方法运用Optigene TM密码子优化分析平台对弓形虫MIC6(TgMIC6)功能区的编码序列进行密码子优化,合成优化后的编码基因,并将其克隆入pET30a原核表达载体,构建pET30a-MIC6重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,经His亲和层析纯化后以His单克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体纯化后分别运用ELISA和Western blot对其效价和特异性进行分析。结果成功构建了pET30a-MIC6原核表达载体。表达的TgMIC6融合蛋白相对分子质量为45×10~3,与预期相符,纯化后浓度为0.5 mg/ml。以纯化的融合蛋白为抗原制备兔源性抗血清,ELISA测定其效价为1∶25 600,抗体浓度3.2 mg/ml,纯度>90%,Western blot显示该抗体能识别TgMIC6重组蛋白和不同虫株内的天然MIC6蛋白。结论优化后的TgMIC6功能区在原核表达系统内高效表达,制备的TgMIC6多克隆抗体效价高,特异性强,可识别重组菌和不同虫株表达的TgMIC6。     

日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的获得、表达及初步鉴定

目的获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的cDNA序列,克隆、表达和纯化原核蛋白并初步鉴定。方法应用简并引物PCR和5’端、3’端锚定PCR,扩增得到日本血吸虫Tsunagi基因的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a(+),诱导表达并纯化融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用ELISA和Western Blotting对表达蛋白进行初步鉴定。结果获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的完整ORF,序列全长为531bp,编码177个氨基酸。构建的重组质粒pET28a-SjTsunagi在大肠杆菌中获得了可溶性表达;以重组蛋白免疫小鼠获得效价为1∶51 200的多克隆抗体,Western Blotting证实抗体可特异性识别目的蛋白。结论成功获得日本血吸虫Tsu-nagi蛋白编码基因的全长ORF,在大肠杆菌中克隆表达了Tsunagi基因,并制备了特异性多克隆抗体,为进一步研究其在日本血吸虫生殖生物学中的功能奠定了基础。     

新型冠状病毒M蛋白表达及多克隆抗体制备北大核心CSCD

目的利用原核表达系统表达新型冠状病毒M蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并与M真核质粒免疫效果相比较,为新型冠状病毒感染检测试剂盒的研制奠定基础。方法将酶切鉴定正确的原核重组表达载体PMAT-9s-M转化BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达M蛋白并进行鉴定。M蛋白经镍离子亲和层析柱纯化浓缩后免疫大白兔,制备多克隆抗体。将M真核重组质粒转化至DH5α,碱裂解法大量抽提质粒后免疫大白兔,制备多克隆抗体。采用ELISA检测2种抗血清的抗体效价,采用Western blot检测2种抗血清与M蛋白的反应性。结果PMAT-9s-M转化BL21后表达70 ku的His-MBP-M融合蛋白,且该蛋白主要存在于包涵体中。纯化后免疫大白兔,制备的多克隆抗体血清效价与真核重组质粒免疫制备的抗血清抗体效价均达1︰16000,且2种抗血清均与凝血酶切M蛋白有良好反应性。结论原核表达的M蛋白免疫制备的多克隆抗体特异性强,效价高,且重组M蛋白制备简便、经济高效,为新冠病毒感染诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

功能未知基因C170rff7重组蛋白及多克隆抗体的制备

目的体外克隆表达C170rf77重组蛋白,制备其多克隆抗体,初步探索该蛋白的生物学作用,观察其细胞系分布特征。方法~HepG2细胞cDNA为模板,PCR扩增C170rf77目的基因片段,构建pET-32a（＋）．C170rf77原核表达载体。转化大肠埃希菌,IPTG诱导C170rf77重组蛋白表达并进行Westernblot鉴定。以重组蛋白免疫大耳白兔,获得兔抗C170rf77蛋白多克隆抗体,并分析其特异性及检测效价。MTT法观察不同浓度重组蛋白对HepG2细胞增殖的影响。利用Westernblot观察C170rf77蛋白在HepG2、L02、Lx2和Jurkat细胞系的表达情况。结果PCR扩增获得C170rf77基因片段,成功诱导表达了C170rf77重组蛋白。制备了多克隆抗．C170rf77,ELISA检测抗体效价〉1：1280000。不同浓度C170rf77重组蛋白对HepG2细胞无明显增殖促进或抑制活性（P〉0．05）。C170rf77蛋白在HepG2、L02、Lx2和Jurkat细胞系均有分布。结论利用体外克隆表达的C170rf77重组蛋白可制备效价和特异性均较高的多克隆抗体。HBV感染相关基因C170rf77在体外肝脏的间质和实质细胞,以及CD4’T细胞系（Jurkat细胞）均有不同程度的表达。提示该基因可能与HBV感染的致病过程相关。     

血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗BC097361蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR技术,以LX02细胞总RNA为模板,扩增BC097361目的 基因片段,构建原核表达载体pET-32a(+)-BC097361.转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-半乳糖苷诱导并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,Western blot分析证实融合蛋白表达的特异性.大量表达后利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性.纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗BC097361蛋白的多克隆抗体.以纯化的BC097361蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测.结果 扩增获得BC097361基因片段,成功表达了BC097361相关蛋白,经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析得到证实.成功获得融合蛋白及兔抗BC097361多克隆抗体.酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价>1:320 000,Western blot、免疫组织化学检测证明多克隆抗体的特异性良好.结论 利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达BC097361蛋白,获得高特异性、高效价兔抗BC097361蛋白的多克隆抗体,为今后研究BC097361蛋白的生物学特性奠定了基础.     

猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 建立猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白原核表达系统并制备兔多克隆抗体。方法 通过逆转录PCR(RT-PCR)技术将猪囊尾蚴总RNA反转录为cDNA,利用特异性引物扩增猪带绦虫Ts14-3-3.3基因,将其克隆至原核表达质粒pCznⅠ中,在大肠杆菌Arctic Express中用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达产物,用HisLink亲和层析柱进行纯化,免疫印迹(Western blot)法鉴定纯化后的Ts14-3-3.3重组蛋白。将纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化法检测Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴的分布。结果 成功构建猪带绦虫重组表达质粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3,经IPTG诱导表达,获得可溶性形式高效表达的Ts14-3-3.3重组蛋白,分子质量约29.31 kD,纯化后带有His标签的Ts14-3-3.3重组蛋白能被抗血清所识别。用纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,获得了Ts14-3-3.3多克隆抗体,其效价为1∶512 000。Western blot和免疫组化结果显示,Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴中均有表达。结论 成功制备猪带绦虫重组Ts14-3-3.3蛋白,并获得了高纯度、高效价的兔多克隆抗体。     

弓形虫TgMIC16多克隆抗体制备 纯化 及其在亚细胞定位中的应用

目的 制备并纯化弓形虫微线蛋白16（TgMIC16）兔源多克隆抗体,并利用制备的多克隆抗体对该蛋白进行亚细胞定位。方法 利用原核表达、纯化的TgMIC16重组蛋白与等体积弗氏佐剂混合,背部皮下、多点注射免疫新西兰大白兔,于第3次加强免疫后的第14天收集兔血清,Protein A亲和纯化柱纯化,用ELISA和蛋白质印迹（Western blotting）分别检测抗体效价和抗体特异性。用弓形虫RH株速殖子感染人包皮成纤维（HFF）细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,采用间接免疫荧光（IFA）检测TgMIC16 在感染细胞中的定位。结果 间接ELISA 结果显示,制备的TgMIC16多克隆抗体滴度为1∶512 000;Western blotting 结果显示,TgMIC16抗体特异性良好;IFA结果显示,TgMIC16定位在弓形虫微线体。结论 本研究制备并纯化了抗弓形虫TgMIC16兔源多克隆抗体,并成功应用于TgMIC16在弓形虫微线体的免疫荧光定位。     

寨卡病毒E蛋白及第三结构域的原核表达和多克隆抗体制备

目的 在大肠杆菌中克隆表达和纯化寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)包膜糖蛋白(Envelope Protein,E)及第三结构域(Envelope DomainⅢ,EDⅢ),并制备两种免疫原的鼠多克隆抗体。方法 通过Vero-E6细胞培养扩增ZIKV,提取病毒总RNA并反转录为cDNA,利用E和EDⅢ基因的cDNA序列构建原核表达载体pET32a/E和pET28a/EDⅢ,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni⁺柱亲和层析法纯化蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清,间接ELISA法测定效价,Western Blot检测特异性。结果 成功表达并纯化重组蛋白E和EDⅢ,获得的多克隆抗体效价均达到1:409 600,Western Blot检测多克隆抗体可特异性识别重组E蛋白和EDⅢ以及天然E蛋白。结论 成功制备出特异性抗寨卡病毒E蛋白和EDⅢ的鼠源多克隆抗体,为深入探索寨卡病毒致病机制、检测方法和免疫策略奠定了研究基础。     

E型沙眼衣原体主要外膜蛋白多克隆抗体的制备、鉴定和初步应用

目的 表达E型沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)并制备其兔源多克隆抗体.方法 诱导表达实验室构建的MOMP/pGEX6p-1重组质粒,通过胶回收进行目的蛋白的纯化.MOMP免疫新西兰家兔制备多克隆抗体,ELISA法测定抗体效价,Western印迹、细胞免疫荧光方法鉴定抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中成功表达融合蛋白谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-MOMP.ELISA法检测抗体的效价达到1∶12 800,Western印迹结果显示抗体可与原核表达的MOMP特异性结合,细胞免疫荧光检测结果显示抗体可与体外培养的沙眼衣原体特异性结合.结论 成功表达了E型沙眼衣原体的MOMP,并制备了高效价、高特异性的抗MOMP抗体,为沙眼衣原体的检测和临床研究提供依据.

Abstract：

Objective To express major outer membrane protein (MOMP) of Chlamydia trachomatis E and to prepare rabbit polyclonal antibody. Methods The recombinant plasmid MOMP/ pGEX6p-l prepared by our lab was introduced into E. coli. The protein was expressed and purified by gel recycling, then was injected into New Zealand rabbits to produce polyclonal antibodies. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the titer of antibody. The antibody specificity was identified by Western blot and immunofluorescence. Results The fusion recombinant protein glutathione S-transferase (GST)-MOMP was successfully expressed in E. coli. The titer of antibody recombinant protein detected by Western blot and to the endogenous MOMP of Chlamydia trachomatis in vitro detected by immunofluorescence. Conclusions The recombinant MOMP is successfully expressed and the MOMP antibody with high titer and high specificity is obtained. which will be helpful for Chlamydia trachomatis detection and related clinical research.     

日本血吸虫Mago nashi基因的表达及其抗体的制备

目的 获得日本血吸虫Mago nashi(SjMago)基因的原核表达蛋白并制备多克隆抗体.方法 以童虫cDNA文库为模板,PCR方法扩增该基因,将其亚克隆人原核表达载体pET28a(+)中,IPTG诱导表达重组蛋白,用含重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用Western blot和ELISA法鉴定抗体的特异性和效价.结果 成功重组SjMago基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达相对分子质量约17×103的目的蛋白,免疫家兔获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测多克隆抗体的效价为1∶40 960,Westernblot证实有特异性目的蛋白条带存在.结论 成功获得了原核表达的SjMago基因,制备出特异性的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础.     

霜天蛾昆虫变应原多克隆抗体的制备及免疫特性分析

目的 制备兔抗霜天蛾变应原多克隆抗体,分析其与特异性过敏患者血清抗体成分的异同,为免疫筛选cDNA文库,制备基因重组霜天蛾变应原奠定基础.方法 应用霜天蛾变应原提取液免疫家兔获得霜天蛾变应原多克隆抗体,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定混合免疫兔血清抗体效价:应用免疫印迹的方法对比分析免疫兔血清与特异性过敏患者血清抗体成分的异同.结果 混合免疫兔血清效价经ELISA检测,效价>1:10 000,免疫印迹检测兔抗血清免疫球蛋白G相似文献