幽门螺杆菌毒力蛋白CagA对胃癌细胞线粒体自噬相关蛋白表达的影响北大核心CSCD

目的检测幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,Hp)主要毒力蛋白CagA对胃癌细胞线粒体自噬相关蛋白par-kin、p62、LC3表达的影响,为Hp致胃癌的研究提供理论基础。方法用cagA基因失活突变Hp菌株(1004HpAcagA)和野生型Hp/cagA+菌株(1004Hp)感染原代胃癌细胞,感染6 h收集细胞蛋白,用高表达cagA的真核表达载体pcDNA3.1/cagA脂质体转染胃癌细胞AGS,24 h收集细胞蛋白,用Western blot检测各组细胞线粒体自噬相关蛋白parkin.p62.LC3表达变化。结果parkin、p62、LC3蛋白表达检测灰度值在1004 HpAcagA感染组分别为0.97±0.23 J.71±0.23,1.03+0.14,1004 Hp感染组分别为1.61±0,32,2.26±0,08,1.32±0,04,1004 Hp感染组较1004 HpAcagA感染组升高了1.66倍、1.32倍、1.27倍,差异有统计学意义(F值分别为7.96,15.35,11.09,P<0.05);par-kin、p62、LC3蛋白表达检测灰度值在pcDNA3.1空载体转染组分别为1.15+0.14,0.75+0.23,0.74±0,19,pcDNA 3.1/cagA转染组分别为1.49±0,02,1.01+0.02、l.29±0.07,pcDNA3.1/cagA转染组较pcDNA3.1空载体转染组升高1.29倍、1.35倍、1.74倍,差异有统计学意义(F值分别为17.48,14.02,21.06,P<0.05)。Hp/cagA+感染和pcDNA 3.1/cagA转染取得一致结果,提示Hp cagA注入胃上皮细胞后影响细胞线粒体自噬相关蛋白的表达。结论HpCagA对线粒体自噬有一定的调控作用,其可能是Hp诱导胃癌发生发展的分子机制。     

幽门螺杆菌毒力蛋白CagA对胃癌细胞线粒体自噬相关蛋白表达的影响北大核心CSCD

目的检测幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,Hp)主要毒力蛋白CagA对胃癌细胞线粒体自噬相关蛋白par-kin、p62、LC3表达的影响,为Hp致胃癌的研究提供理论基础。方法用cagA基因失活突变Hp菌株(1004HpAcagA)和野生型Hp/cagA+菌株(1004Hp)感染原代胃癌细胞,感染6 h收集细胞蛋白,用高表达cagA的真核表达载体pcDNA3.1/cagA脂质体转染胃癌细胞AGS,24 h收集细胞蛋白,用Western blot检测各组细胞线粒体自噬相关蛋白parkin.p62.LC3表达变化。结果parkin、p62、LC3蛋白表达检测灰度值在1004 HpAcagA感染组分别为0.97±0.23 J.71±0.23,1.03+0.14,1004 Hp感染组分别为1.61±0,32,2.26±0,08,1.32±0,04,1004 Hp感染组较1004 HpAcagA感染组升高了1.66倍、1.32倍、1.27倍,差异有统计学意义(F值分别为7.96,15.35,11.09,P<0.05);par-kin、p62、LC3蛋白表达检测灰度值在pcDNA3.1空载体转染组分别为1.15+0.14,0.75+0.23,0.74±0,19,pcDNA 3.1/cagA转染组分别为1.49±0,02,1.01+0.02、l.29±0.07,pcDNA3.1/cagA转染组较pcDNA3.1空载体转染组升高1.29倍、1.35倍、1.74倍,差异有统计学意义(F值分别为17.48,14.02,21.06,P<0.05)。Hp/cagA+感染和pcDNA 3.1/cagA转染取得一致结果,提示Hp cagA注入胃上皮细胞后影响细胞线粒体自噬相关蛋白的表达。结论HpCagA对线粒体自噬有一定的调控作用,其可能是Hp诱导胃癌发生发展的分子机制。     

线粒体外膜电压依赖阴离子通道在携带mtDNA A4263G突变的细胞株凋亡中的作用

目的: 研究线粒体外膜电压依赖的阴离子通道（voltage-dependent anion channel,VDAC）在携带线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）A4263G突变的细胞株凋亡中的作用。方法: 对该家系的4名母系成员（3名血压异常者,1名血压正常者）和3名遗传背景相同的对照者建立了传代淋巴细胞系。采用流式细胞仪检测线粒体膜电势;用激光共聚焦显微镜观测VDAC与Bax蛋白结合的情况。结果: VDAC及凋亡相关蛋白Bax在携带mtDNA A4263G的细胞株中重表达增高,而淋巴细胞sKCa通道的表达没有明显差异;mtDNA A4263G突变携带者的线粒体膜电势与正常者比较平均降低32%（P<0.05）;而加入环孢霉素A（CsA为VDAC拮抗剂）后,线粒体膜电势升高,与正常者之间的差异消失。携带突变者线粒体外膜的VDAC可与Bax蛋白结合,而正常对照者二者没有结合,在加入CsA后,可抑制突变者线粒体外膜VDAC与Bax蛋白的结合。结论: 线粒体VDAC表达异常可导致mtDNA A4263G携带突变的细胞株凋亡增加。     

幽门螺杆菌对胃癌细胞线粒体DNA编码的细胞色素氧化酶基因表达的影响

既往研究表明胃黏膜细胞核基因组有线粒体DNA（mtDNA）片段整合,且这种整合与幽门螺杆菌（H. pylori）感染有关,并参与胃癌的发生.mtDNA片段与核基因整合后,是否会引起所编码基因表达的改变,这种改变是否与H.pylori感染有关尚不明确.目的：观察H.pylori作用于胃癌细胞后线粒体编码基因细胞色素氧化酶（COX）Ⅰ、COXⅡ和COXⅢmRNA表达的变化,探讨H.ptkiri致胃癌的分子机制.方法：将6μl/ml H.pylori培养滤液与胃癌细胞分别作用4 h、8 h和12 h,收集细胞,提取RNA,应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测各时间点COXⅠ、COXⅡ和COXⅢmRNA的表达.结果：H.pylori作用4 h后,线粒体COX Ⅰ、COXⅡ和COXⅢmRNA的表达有所降低,8 h时下降更明显,12 h时段下降速度减缓;除COXⅡ4 h时与对照组无差异外,其余各时间点的表达量均显著低于对照组（P＜0.05）.结论：H.pylori可引起胃癌细胞线粒体编码基因COX Ⅰ、COXⅡ和COXⅢmRNA表达下调,影响线粒体的功能.     

线粒体内膜蛋白ANT在幽门螺杆菌致胃癌细胞凋亡中的表达

目的观察H．pylori作用于胃癌细胞后线粒体内膜蛋白ANT1、ANT2和ANT3mRNA的表达变化,探讨胁pytori致胃癌细胞凋亡的分子机制。方法H．pylori分别作用于胃癌细胞0、12、24、48h后收集细胞,提取RNA,应用RT-PCR检测各时相点ANT1、ANT2和ANT3mRNA表达的变化。结果H．priori与胃癌细胞共培养12h后,ANT1和ANT3mRNA的表达增加,24h增加更明显,48h达到高峰。各时相点的表达量明显高于0h（P〈0．05）。ANT2的表达较弱,与0h相比无明显差异（P〉0．05）。结论口．pylori可能通过影响线粒体内膜蛋白ANTmRNA的表达,改变线粒体膜通透性,诱发细胞凋亡。     

线粒体电压依赖阴离子通道对携带线粒体DNAA4263G突变的细胞株线粒体钙循环的影响

目的 研究线粒体外膜电压依赖阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)在携带线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) A4263G突变的细胞株线粒体钙循环中的作用. 方法 对该家系的4个母系成员(3个血压异常和1个血压正常者)和3名遗传背景相同的对照者建立了传代淋巴细胞系,利用共聚焦显微镜评价VDAC在携带mtDNA A4263G突变的高血压患者细胞线粒体钙循环中的作用. 结果 与正常对照者淋巴细胞比较,突变细胞株线粒体内钙荧光强度及线粒体膜电势(Δψm)降低,加入苍术苷(线粒体通道蛋白开放剂)后正常者线粒体内钙荧光强度增加,而突变携带者没有明显改变,但两者Δψm均降低,加入环孢素A(CsA)后可以抑制苍术苷作用. 结论 线粒体VDAC功能异常导致mtDNA A4263G突变携带者细胞线粒体对钙通透性增加,Δψm降低,加入苍术苷进一步导致Δψm降低,加入CsA后可以抑制苍术苷作用.     

幽门螺杆菌对胃上皮细胞株GES-1凋亡及XIAP表达的影响

目的观察幽门螺杆菌（Hp）慢性感染对胃上皮细胞凋亡及X凋亡抑制蛋白（XIAP）表达的影响。方法通过Hp SS1与人非肿瘤性胃上皮细胞株GES-1共培养,建立GES-1模型细胞,检测模型细胞凋亡率及胃上皮细胞XIAP mRNA的表达。结果Hp感染8周、12周、16周模型细胞凋亡率分别为64．55％、60．58％、45．52％,模型胃上皮细胞的XIAP mRNA实时定量PCR的CT值分别为0．901、0．842、0．796,明显低于对照组细胞凋亡率75．52％（P〈0．05）及XIAP mRNA的CT值1．030（P〈0．01）。结论Hp慢性感染能抑制胃上皮细胞凋亡,其机制可能与上调XIAP mRNA表达有关。     

幽门螺杆菌对细胞色素氧化酶基因Ⅱ表达的影响及其临床意义

目的观察幽门螺杆菌（H．pylori）培养滤液作用于胃癌细胞后,细胞色素氧化酶Ⅱ（COX-Ⅱ）mRNA及其蛋白表达的变化,探讨H．pylori致胃癌的可能分子机制。方法将6μl/ml H．pylori培养滤液与胃癌细胞分别作用4、8、12小时,收集细胞,提取RNA,应用lit-PCR和Westernblot法检测各时间点COX-Ⅱ mRNA及其蛋白表达。结果正常情况下,胃癌细胞COX-Ⅱ mRNA稳定表达。H．pylori培养滤液分别作用4、8、12小时后,其表达量呈缓慢下降趋势,8、12小时的表达量显著低于对照组（P〈0．05）。COX-Ⅱ蛋白的表达呈现相似的趋势。结论H．pylori可引起胃癌细胞线粒体编码基因COX-Ⅱ mRNA和蛋白的表达障碍,影响线粒体功能。     

硒代甲硫氨酸对胃癌细胞蛋白表达谱的影响

目的:分析硒代甲硫氨酸对胃癌AGS细胞蛋白表达谱的影响.方法:应用Hoechst荧光染色法及流式细胞术观察硒代甲硫氨酸对胃癌AGS细胞凋亡的影响;应用双向凝胶电泳技术分析硒代甲硫氨酸对胃癌AGS细胞蛋白表达的影响.结果:胃癌AGS细胞在含硒代甲硫氨酸培养液中培养5 d后,部分细胞的细胞核内出现凋亡小体,含硒代甲硫氨酸培养液中AGS细胞的凋亡率显著高于正常培养液组(53.98%±9.88% vs 15.76%±9.03%,P＜0.01).双向电泳技术筛选出12个表达差异的蛋白.结论:硒代甲硫氨酸可以影响胃癌AGS细胞蛋白的表达.这些差异表达的蛋白可能与胃癌细胞凋亡有关.     

H pylori感染在胃癌前病变中对端粒酶相关基因及细胞增殖与凋亡的影响

目的:分析胃癌前病变中端粒酶RNA(hTR)、端粒酶逆转录酶(Htert)、c-Myc、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及相互关系,并探讨H pylori感染致胃癌前病变的可能机制.方法:33例胃癌前病变中H pylori阳性19例,H pylori阴性14例.采用原位杂交法检测胃黏膜活检标本中hTR表达; 免疫组织化学SP法检测hTERT、c-Myc、PCNA表达; TUNEL法检测细胞凋亡.结果:H pylori阳性胃癌前病变组h TR、hTERT、c-Myc阳性率均显著高于H pylori阴性胃癌前病变组(63.2% vs 28.6%,68.4% vs21.4%,47.4% vs 7.1%,均P<0.01); 增殖指数及凋亡指数在H pylori阳性组分别为17.5±5.4、17.7±3.9,H pylori阴性组分别为8.3±3.6、9.2±5.2,两组相比均有显著性差异( P<0.01).胃癌前病变中hTERT与hTR、hTERT与c-Myc表达均呈显著正相关性( rs = 0.45,0.54,均P<0.01).结论:H pylori感染可诱导胃癌前病变中端粒酶相关基因及c-Myc过度表达,促进细胞增殖与凋亡,引起胃黏膜上皮细胞动力学紊乱.     

Effect of Helicobacter pylori VacA on gene expression of gastric cancer cells

AIM: To determine the effect of Helicobacter pylori VacA on gene expression of gastric cancer cells. METHODS: Gene expression profile of a gastric cancer cell line, SGC7901, after challenged by VacA~+ and VacA~- H pylori broth culture supernatants (BCS), was detected by the cDNA microarray technique. Cytoskeleton changes of SGC7901 and HeLa cells were observed through high-resolution laser scanning confocal microscopy. RESULTS: A total of 16 000 cDNA clones were detected. The percentage of genes with heterogeneous expression in SGC7901 cells challenged by VacA~+ BCS reached 5%, compared with that challenged by VacA~- BCS. There were 865 genes/EST with 2-fold differential expression levels and 198 genes/EST with 3-fold differential expression levels. Most of these genes were involved in vital cell events including signal transduction, regulation of gene expression, cytoskeleton, apoptosis, stress response and inflammation, cell cycle and tumor development. Cells co-cultured with VacA~+ BCS showed collapsed and disrupted microtubular cytoarchitecture. CONCLUSION: VacA~+ BCS can disrupt cytoskeletal architecture, likely through affecting the expression of cytoskeleton-associated genes, directly induce the expression of tumor promoter-related genes and inhibit the expression of tumor suppressor genes, thus favoring the development of tumors. VacA~+ BCS can also alter the expression of inflammation and stress response genes. This suggests that VacA may play an important role in the pathogenicity of H pylori.     

幽门螺杆菌VacA重组蛋白对SGC7901胃癌细胞的作用

目的:研究幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)编码基因在大肠杆菌中的表达产物对SGC7901胃癌细胞的作用.方法:常规培养pET32a-vacA-E.coliBL21(DE3)工程菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,产物纯化后作用于胃癌细胞,倒置显微镜及电镜等检测细胞生长情况.结果:重组蛋白作用于胃癌细胞后,倒置显微镜下观察,细胞生长受抑制,其细胞空泡毒作用减弱甚至消失,电镜下可见10%-20%左右细胞呈现轻度空泡变,仅少数细胞空泡变明显,细胞表面微绒毛消失,少量细胞体积减小,并出现了早期核着边固缩等凋亡改变.结论:重组VacA蛋白对胃癌细胞的生长具有抑制作用,空泡毒作用减弱.     

HLA-DQB1 locus and gastric cancer in Helicobacter pylori infection

BACKGROUND AND AIMS: It has been suggested that the incidence of digestive diseases associated with Helicobacter pylori is influenced by the strain diversity of H. pylori, factors involving the host or environment, and the duration of infection. The authors have previously reported that human leukocyte antigen (HLA)-DQB1*0401 plays an important role in the development of atrophic gastritis in H. pylori infected patients. The aim of the present study was to investigate the relationship between HLA-DQB1 genotype and cancer development. METHODS: HLA-DQB1 genotyping was performed by the PCR-RFLP method on 122 H. pylori-infected non-ulcer dyspepsia (NUD) patients, 53 gastric cancer patients and 28 uninfected controls. To reliably estimate the grade of atrophic gastritis, histological evaluation was performed. RESULTS: The allele frequency of DQB1*0401 was significantly higher in intestinal type cancer patients compared with age- and sex-matched H. pylori-infected NUD patients. There was no significant difference in the mean atrophic scores of the biopsy samples from the lesser curvature of the mid-corpus between these groups. CONCLUSIONS: HLA-DQB1*0401 is a useful marker for determining susceptibility to intestinal type gastric cancer.     

Effects of different Helicobacter pylori culture filtrates on growth of gastric epithelial cells

AIM： To study the effects of different Helicobacter pylori （H pylori） culture filtrates on growth of gastric epithelial cells.
METHODS： Broth culture filtrates of H pylori were prepared. Gastric epithelial cells were treated with the filtrates, and cell growth was determined by growth curve and flow cytometry. DNA damage of gastric epithelial cells was measured by single-cell microgel electrophoresis.
RESULTS： Gastric epithelial cells proliferated actively when treated by CagA-gene-positive broth culture filtrates, and colony formation reached 40%. The number of cells in S phase increased compared to controls. Comet assay showed 41.2% comet cells in GES-1 cells treated with CagA-positive filtrates （P 〈 0.05）.
CONCLUSION： CagA-positive filtrates enhance the changes in morphology and growth characteristics of human gastric epithelial tumor cells. DNA damage maybe one of the mechanisms involved in the growth changes.     

幽门螺杆菌源抗菌肽对胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞生长的影响

目的 研究幽门螺杆菌(Hp)源抗菌肽(2-20)对胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞生长的影响。方法 采用琼脂扩散法检测Hp抗菌肽(2-20)及杀菌肽(cecropin)B的抗菌活性及致死浓度(LC)，MTT法测定H声抗菌肽(2-20)、杀菌肽B对胃黏膜上皮细胞株GES-1、胃癌细胞株SGC-7901的细胞毒作用及半数抑制浓度(IC50)。结果 Hp抗菌肽(2-20)及杀菌肽B对E-coli K12D31的LC分别为65和0．44μmol／L，Hp抗菌肽(2-20)的抗菌活性较杀菌肽B低。Hp抗菌肽(2-20)及杀菌肽B对胃癌细胞具有浓度依赖性细胞毒作用。而Hp抗菌肽(2-20)在相对较低浓度时对胃黏膜上皮细胞有促进增殖的作用。杀菌肽B在5～20μmol／L浓度范围内对胃黏膜上皮细胞株GES-1无细胞毒作用。Hp抗菌肽(2-20)对胃黏膜上皮细胞株GES-1、胃癌细胞株SGC-7901的IC50为630、500μmol／L，杀菌肽B对胃黏膜上皮细胞株GES-1、胃癌细胞株SGC-7901的IC50为75、25μmol／L。结论 Hp抗菌肽(2-20)的抗菌活性较杀菌肽B低，对胃癌细胞具有浓度依赖性细胞毒作用。Hp抗菌肽(2-20)在相对较低浓度对胃黏膜上皮细胞有促进增殖的作用，可能与胃癌发生有关。     

幽门螺杆菌致胃癌发生机制

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称Hpylori或HP）是全球范围内高感染率的慢性感染性致病菌，全世界有50％以上的人口感染本菌，在发展中国家感染率更高，我国在80％左右。大量的流行病学资料调查表明，H．pylori除了是消化性溃疡的最主要病因外，也是胃腺癌和胃淋巴组织相关淋巴瘤发生的主要原因，研究显示由该菌引起的炎症可导致萎缩性胃炎，肠上皮化生，不典型增生，最终演变为胃腺癌，1994年国际癌症研究中心将其列为第一类致癌因子。胃癌是人类发生的最常见的恶性肿瘤之一，其致死率位居恶性肿瘤第二。我国在上个世纪进行的两次全国普查表明，其死亡率在我国居第一位。胃癌多发于50岁以上，日本、韩国、哥伦比亚和我国是胃癌的高发国家。在胃恶性肿瘤中，腺癌约占85％～95％。尽管胃腺癌的发病机制还不清楚，但与H．pylori的长期定植、遗传因子和环境有关。     

幽门螺杆菌感染与胃癌局部浸润的相关性

胃癌是一种常见的恶性肿瘤,严重威胁着人类的健康,幽门螺杆菌被国际上确认为胃癌的主要病因之一,且其与胃癌的不良预后相关.本文主要通过探讨幽门螺杆菌与胃癌局部浸润的关系,阐明幽门螺杆菌与胃癌转移的可能机制,为胃癌患者根除幽门螺杆菌治疗提供理论依据.     

幽门螺杆菌诱导蒙古沙鼠胃上皮细胞凋亡可能涉及线粒体途径

目的建立幽门螺杆菌(Hp)感染蒙古沙鼠模型,探讨线粒体途径在Hp诱导胃上皮细胞凋亡中的作用。方法 48只雄性蒙古沙鼠均分为Hp感染组和对照组,每组分别于1、3和6个月3个时相点各处死8只动物,取胃黏膜行组织学检查:用Warthin-Starry银染、PCR和快速尿素酶法检测 Hp;通过H-E染色,光镜下观察胃黏膜病理变化;流式细胞仪测定细胞凋亡、线粒体膜电位及胞内游离 Ca2+含量。结果 Hp感染蒙古沙鼠后,胃黏膜出现慢性胃炎、肠化生及异型增生改变,而对照组胃黏膜基本正常,Hp感染组肠化生及异型增生发生率明显高于对照组(P<0．05)。Hp感染胃上皮细胞1、3、 6个月后的凋亡率分别为(16．71±3．30)％、(5．90±0．82)％、(5．69±0．70)％,而对照组的凋亡率分别为(4．20±0．94)％、(3．17±0．43)％、(4．70±0．55)％。其中Hp感染1个月后胃上皮细胞的凋亡率高于其他各组(P<0．05)。Hp感染胃上皮细胞1、3、6个月后的线粒体膜电位分别为43．10±17．62、 71．19±38．03、80．56±32．90,而对照组分别为84．70±23．50、84．39±37．51、79．54±30．24,其中Hp 感染1个月后胃上皮细胞的线粒体膜电位低于其他各组(P<0．05);Hp感染1、3、6个月后胃上皮细胞内游离Ca2+含量分别为18．60±9．32、5．18±2．06、4．94±3．25,而对照组分别为4．82±3．70、6．86 ±2．34、5．28±3．13,Hp感染1个月后胃上皮细胞内游离Ca2+含量高于其他各组(P<0．05)。结论 Hp诱导蒙古沙鼠胃上皮细胞凋亡主要发生在Hp感染早期;线粒体膜电位的下降和胞内游离Ca2+含量的升高参与了Hp诱发蒙古沙鼠胃上皮细胞凋亡的过程。     

Research progress on Helicobacter pylori outer membrane protein

Helicobacter pylori (H pylori), one of the most common bacterial pathogens on human beings, colonizes the gastric mucosa. In its 95 paralogous gene families, there is a large outer membrane protein (OMP) family. It includes 32 members. These OMP are important for the diagnosis, protective immunity, pathogenicity of H pylori and so on. They are significantly associated with high H pylori density, the damage of gastric mucosa, high mucosal IL-8 levels and severe neutrophil infiltration. We introduce their research progress on pathogenicity.