流体动力学因素对大段组织工程骨构建作用的实验研究

目的 研究灌注式生物反应器中流体剪切力和物质转运在大段组织工程骨构建过程中的作用. 方法 抽取健康志愿者髂嵴处骨髓20 mL,分离、培养hBMSCs.将第3代hBMSCs与大段β-TCP支架复合后,在灌注式生物反应器中灌注培养28 d.灌注过程中,通过改变培养基黏度或灌流量,对接种在支架上的hBMSCs施加不同流体剪切力(1、2、3倍)或给予不同速率(3、6、9 mL/min)的物质转运.培养结束后,对接种在支架上的细胞行增殖及ALP活性检测,同时对细胞/支架复合体进行组织学观察及形态学计量. 结果 灌流量均为3 mL/min时,流体剪切力2倍组的细胞活性高于其他各组,差异有统计学意义(P<0.05);当流体剪切力均为3倍时,3、6、9 mL/min灌流量组细胞活性差异无统计学意义(P>0.05).当灌流量均为3 mL/min时,流体剪切力2倍组和3倍组的ALP活性高于1倍组,差异有统计学意义(P<0.05);当流体剪切力均为3倍时,灌流量为6 mL/min组的ALP活性最高(P<0.05).灌注培养28 d后,各组ECM分布于整个β-TCP支架内,灌流量均为3 mL/min时,增加流体剪切力有利于支架内ECM形成及矿化;当流体剪切力均为3倍时,增加灌流量使ECM的矿化减少. 结论 流体剪切力和物质转运两个流体动力学参数是影响大段组织工程骨构建的重要因素.在构建大段组织工程骨过程中,应调节流体动力学参数使其对组织工程骨的构建发挥最佳效应.     

细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷修复软骨缺损的实验研究

[目的]通过将骨髓间充质干细胞（MCSc）诱导的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞接种到三维多孔β-磷酸三钙（β-TCP）生物陶瓷支架材料上，体外构建骨软骨复合体，探讨以β-TCP为载体建造组织工程化软骨修复骨软骨缺损的可行性。[方法]将β-TCP多孔陶瓷加工成圆柱状，并将其作为构建人工软骨的细胞支架。在支架材料上分别接种从犬骨髓干细胞培养成的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞，将细胞-支架复合体共同培养1周后，移植到犬关节软骨缺损处。植入后12、16周末取材，进行大体观察、组织学及组织化学等观察。[结果]复合体体内移植后，在犬关节软骨缺损处有新生软骨形成，形成的软骨基本保持了支架材料原有形态。[结论]β-TCP多孔陶瓷可作为支架材料，复合细胞后具有修复软骨缺损的作用。     

三维动态灌注法构建大段组织工程化骨修复羊胫骨干节段性缺损

[目的]观察三维动态灌注法构建的大段组织工程化骨修复羊胫骨干节段性骨缺损的效果.[方法]利用自行设计的灌注型生物反应器对复合骨髓基质干细胞的大段磷酸三钙柱状载体进行动态灌注培养或静态培养2周,通过葡萄糖日耗量、乳酸生成量监测细胞在载体内的扩增.在羊胫骨干节段性骨缺损中分别植入β磷酸三钙、静态培养和动态灌注培养的组织工程化骨,通过X线片、大体观察、硬组织切片和形态计量学检查观察其修复骨缺损的效果.[结果]动态培养法葡萄糖日耗量及乳酸生成量明显高于静态培养法.单纯β磷酸三钙、静态培养和动态灌注培养的组织工程化骨植入骨缺损16周后的临床愈合率分别为0/6、2/6、4/6.动态灌注培养组的材料残余率明显低于单存材料组(P<0.05).[结论]三维动态灌注培养法构建的大段组织工程化骨修复羊长骨节段性缺损的效果优于传统静态培养法.     

不同孔径β-TCP对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨作用的体外研究

目的 探讨不同孔径β-磷酸三钙(β-TCP)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖及成骨分化的作用.方法 体外原代培养BMSC,取第2代细胞悬液100μl(细胞浓度2×106/ml)接种于5组不同孔径(187～300、300～375、375～500、500～750、750～830 μm)的圆盘状多孔 β-TCP材料中.采用细胞计数试剂盒(CCK-8)测定BMSC接种后3、24、48、72 h增殖情况;扫描电镜观察接种72 h后BMSC在多孔β-TCP上贴附、生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测接种72 h后BMSC的ALP活性.结果 接种后48 h BMCS在各组多孔β-TCP上均有显著增殖,其中500～750 μm组增殖最快(P＜0.05);扫描电镜观察显示,BMCS在多孔β-TCP材料上黏附、伸展、聚集,生长状态良好;接种后72 h各组BMCS的ALP活性均明显增高,其中500～750 μm组ALP活性最高(P＜0.05).结论 不同孔径的多孔β-TCP对BMSC增殖及成骨分化均有促进作用,其中500～750 μm孔径的促进作用最明显,可能是促进BMSC增殖及成骨分化的最适孔径.     

凝胶包埋兔脂肪基质细胞接种三维支架动态构建组织工程化骨

目的 探讨高效的细胞种植方法,提高工程化骨构建质量.方法 成骨诱导化脂肪基质细胞,制备含rhBMP-2的纳米化壳聚糖/胶原蛋白/β磷酸三钙(Cs-Col-β-TCP)支架,构建工程化骨.静态种植静态培养(A组),振荡种植静态培养(B组),凝胶+振荡种植静态培养(c组),凝胶+静态种植静态培养(D组).第1、4、 8、 12、16、20、24、28天,扫描电镜、共聚焦显微镜观察,检测细胞存活率、细胞增殖、碱性磷酸酶、DNA、骨钙素水平.结果 C组细胞分布均匀、呈三维内生长、细胞外基质丰富,细胞存活率、增殖活力、碱性磷酸酶、DNA、骨钙素水平均高于其他组(79.53±2.67、0.59±0.20、65.16±6.85、207.62±19.36、55.22±8.51,P<0.05).结论 凝胶联合振荡种植可提高细胞接种效率及增强诱导成骨活性.     

脂肪干细胞/Ⅰ型胶原凝胶/聚乳酸聚乙醇酸-β-磷酸三钙骨组织工程复合体的构建及其异位成骨研究

目的 构建基于脂肪干细胞、Ⅰ型胶原凝胶以及聚乳酸聚乙醇酸-β-磷酸三钙支架(PLGA-β-TCP)的骨组织工程复合体并对其异位成骨进行研究.方法 设计构建脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(A组),同时设立单纯细胞/PLGA-β-TCP材料复合体(B组)、单纯Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(C组)以及单纯PLGA-β-TCP支架材料(D组)作为对照.扫描电镜、相差显微镜观察细胞材料复合情况并对脂肪干细胞增殖以及成骨分化进行分析.体外成骨诱导培养2周后移植于自体股部肌袋,8周后取出,依次行放射学、组织学定性及半定量分析.结果 (1)体外成骨诱导2周,A组细胞增殖率慢于B组(P<0.05,n=4),但其细胞总数远高于后者(P<0.01,n=4).A组碱性磷酸酶(ALPase)活性、细胞外基质矿化程度均显著高于B组(P<0.01,n=4).A组细胞悬浮于Ⅰ型胶原凝胶并均匀分布于材料孔隙中而B组细胞仅见黏附于材料表面.(2)移植8周,X线片示A组高密度钙化影形成,B、C、D组未见有阳性结果.A组材料孔隙中均匀充满新生骨组织,可观察到骨小梁样结构.B组仅在少数孔隙中有类骨组织形成,同时伴有结缔组织长入.A组新生骨面积百分比显著高于B组(P<0.01,n=4).结论 通过应用Ⅰ型胶原凝胶来实现脂肪干细胞与PLGA-β-TCP多孔支架材料的均匀复合,能够有效促进脂肪干细胞在材料孔隙中的成骨分化及均质骨组织形成.     

灌注培养对骨髓基质干细胞在大段材料上增殖与分布的影响

目的 探讨灌注培养对骨髓基质干细胞(BMSCs)在大段材料上增殖与分布的影响.方法 在大段多孔磷酸三钙材料上种植转染了增强型绿色荧光蛋白基因的大鼠BMSCs(eGFP-BMSCs),分别采用灌注式生物反应器(实验组)和静止培养法(对照组)进行培养.培养7、28 d行扫描电镜观察;培养7、14 d行荧光显微镜观察;动态临...     

羟基磷灰石/β－磷酸三钙/甲壳素复合多孔支架材料的制备及生物相容性研究

目的 探讨羟基磷灰石/β-磷酸三钙/甲壳素(HAP/β-TCP/CS)多孔支架的制备及其与人体骨髓间质干细胞(MSCs)的生物相容性.方法 以羟基磷灰石粉体为基体,采用有机泡沫浸渍-发泡复合成型工艺制备出羟基磷灰石/β-磷酸三钙多孔支架,再将该多孔支架与甲壳素复合得到有机-无机复合支架,然后通过体外培养实验评价该复合支架的干细胞相容性.结果 复合甲壳素可以显著提高HAP/β-TCP支架的抗压强度,并且该支架具有三维连通网状结构,细胞在支架上粘附,生长良好.结论 该复合多孔支架具有良好的干细胞亲和性和生物相容性.     

3D打印PLA-HA复合材料与骨髓基质细胞的相容性研究

目的 探讨骨髓基质细胞与3D打印聚乳酸-羟基磷灰石(Three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite,3D printed PLA-HA)复合支架材料的相容性,为骨组织工程选择合适的支架材料提供理论依据。方法将标记绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的骨髓基质细胞分别与3D打印PLA-HA复合材料和β-磷酸三钙(betatricalcium phosphate,β-TCP)材料体外复合培养,采用荧光显微镜观察细胞在支架材料上的生长黏附情况,并通过扫描电镜观察细胞在支架中的形态变化;CCK8(Cell Counting Kit8)法检测细胞于不同时间点在材料上的黏附率以及增殖情况;碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定法检测3 d、7 d、14 d的碱性磷酸酶活性变化。结果 骨髓基质细胞能够在3D打印PLA-HA复合材料和β-TCP材料上黏附生长;β-TCP组细胞黏附率高于3D打印PLA-HA组(P<0.05),但3D打印PLA-HA组在12 h细胞黏附率可达到60%以上;细胞增殖实验显示,3D打印PLA-HA组在体外培养第4天和第7天的细胞增殖量(OD值)均高于β-TCP组与对照组(P<0.05);3D打印PLA-HA组以及β-TCP组在第3天、第7天和第14天的ALP含量均高于对照组,且3D打印PLA-HA组第7天ALP含量较β-TCP组增多(P<0.05)。结论 3D打印PLA-HA复合材料具有良好的细胞相容性,可作为骨组织工程的支架材料。     

Tissue-engineered bone constructed in a bioreactor for repairing critical-sized bone defects in sheep

Purpose

Repair of bone defects, particularly critical-sized bone defects, is a considerable challenge in orthopaedics. Tissue-engineered bones provide an effective approach. However, previous studies mainly focused on the repair of bone defects in small animals. For better clinical application, repairing critical-sized bone defects in large animals must be studied. This study investigated the effect of a tissue-engineered bone for repairing critical-sized bone defect in sheep.

Methods

A tissue-engineered bone was constructed by culturing bone marrow mesenchymal-stem-cell-derived osteoblast cells seeded in a porous β-tricalcium phosphate ceramic (β-TCP) scaffold in a perfusion bioreactor. A critical-sized bone defect in sheep was repaired with the tissue-engineered bone. At the eighth and 16th week after the implantation of the tissue-engineered bone, X-ray examination and histological analysis were performed to evaluate the defect. The bone defect with only the β-TCP scaffold served as the control.

Result

X-ray showed that the bone defect was successfully repaired 16 weeks after implantation of the tissue-engineered bone; histological sections showed that a sufficient volume of new bones formed in β-TCP 16 weeks after implantation. Eight and 16 weeks after implantation, the volume of new bones that formed in the tissue-engineered bone group was more than that in the β-TCP scaffold group (P?Conclusion Tissue-engineered bone improved osteogenesis in vivo and enhanced the ability to repair critical-sized bone defects in large animals.     

富集骨髓基质干细胞复合多孔β-磷酸三钙促进骨缺损修复的实验研究

目的 评估富集骨髓基质干细胞(BMSCs)复合β-磷酸三钙(β-TCP)在促进骨缺损修复中的作用. 方法 抽取12只崇明山羊骨髓血,用梯度离心法分别将其中的BMSCs富集、分离后与β-TCP复合.12只山羊双侧股骨内髁钻孔,制备骨缺损模型.所有山羊左侧股骨内髁缺损通过富集BMSCs/β-TCP进行局部填充治疗(实验组),其中10只羊右侧股骨内髁缺损以单纯β-TCP颗粒填充治疗(对照组),2只羊右侧股骨内髁缺损旷置(空白组),评价富集效率.术后16周处死取材,将所得标本进行影像学观察和形态学计量,实验组和对照组之间进行比较. 结果 BMSCs富集后有核细胞数和碱件磷酸酶染色呈阳性的细胞集落形成单位(CFUs/ALP+)数均有显著提高,差异有统计学意义(P<0.05).X线侧位片和μ-CT形态计量分析显示实验组新生骨长入率(70.27%±8.47%)显著高于对照组(21.40%±5.77%),差异有统计学意义(t=11.97,P<0.05).X线侧位片、CT平扫与三维重建以及μ-CT图像均可见实验组疗效优于对照组. 结论 在促进骨缺损修复中,富集BMSCs/β-TCP的疗效优于单纯β-TCP颗粒,有良好的应用前景.     

Repair of bone defect in caprine tibia using a laminated scaffold with bone marrow stromal cells loaded poly (L-lactic acid)/β-tricalcium phosphate

Repair of bone defects of a critical size encounters many problems, and many efforts aim to build a porous scaffold loading bone marrow stromal cells (BMSCs) or bone morphogenetic protein (BMP2) to quickly repair bone defects. In this paper, a laminated scaffold was designed and tested for the repair of bone defects in a caprine tibia. Beta-tricalcium phosphate (β-TCP) and poly (L-lactic acid) (PLLA) were fabricated to a sandwich structured composite that was then rolled up to form a cylindrical shaped, porous scaffold. The porosity and bending strength of the PLLA/β-TCP laminated scaffold were around 70% and 1.7 MPa, respectively. Results from in vitro experiments showed that the pH value of the scaffold in water fluctuated between 4.9 and 7.0 during its degradation. When exposed to the simulated body fluid, the scaffold lost its strength after 11 weeks of degradation. After implantation in Chinese caprines' diaphyseal defects with loaded allogeneic BMSCs, the scaffold sped up the bone repair without collapse of the scaffold and the unwanted inflammatory response, and then rapidly degraded and finally disappeared at 12 weeks. Gross examinations and pullout tests showed that the experimental caprines walked normally and the implanted leg could be heavily loaded. X-ray examinations and histological analyses showed new bone tissues formed with similar structures to normal ones. It is suggested that the novel PLLA/β-TCP laminated scaffold with BMSCs loading can regenerate new bones quickly.     

家兔作为胎龄期骨髓间充质干细胞动物模型的实验研究

目的建立以家兔为对象的胎龄期BMSC研究动物模型。方法通过人工授精方法,获得孕期3周的孕兔4只,行剖腹产术取出胎兔20只,冲取胎兔骨髓,以贴壁培养法进行体外扩增培养。测量第3代胎兔BMSC的生长曲线,克隆形成率,并进行成骨、成脂及成软骨诱导分化。另外,将原代细胞冻存30 d后复苏,测量其第3代生长曲线,对冻存前后增殖能力的变化进行观察。扫描电镜观察胎兔BMSC与β-TCP形成细胞材料复合物的体外形态。将BMSCs-β-TCP复合物植入裸鼠皮下,于术后1、3、6个月分别取材,行HE、VG、Masson染色观察。结果胎兔来源的BMSC于倒置相差显微镜下观察,细胞饱满均匀,呈梭形或倒三角形状;传代后各代细胞形态未发生明显变化,生长曲线相差不大;成骨、成脂以及成软骨诱导观察到钙结节、脂肪空泡、黏多糖。冻存30 d后复苏,其第3代生长曲线与冻存前相比未见明显变化。电镜下观察,与β-TCP复合7 d后,细胞能均匀紧密贴合于材料上,伸展良好分布均匀。植入裸鼠皮不同时间点取材行HE、VG、Masson染色,均显示有新生骨组织生成。结论以家兔为研究动物模型,可以在胎龄期获取并分离得到BMSC,并可在异位构建组织工程骨,是间充质干细胞动物研究的新选择。     

脱细胞牛颈静脉血管支架的内皮化研究

目的 探讨在脱细胞牛颈静脉血管支架上进行内皮细胞再种植的可行性.方法 将人骨髓间充质干细胞(BMDCs)诱导分化为内皮种子细胞后种植在脱细胞牛颈静脉血管支架上,分为动态培养和静态培养2组.培养7 d后,对标本进行病理和扫描电镜观察.结果 静态培养的血管支架表面形成连续的单细胞层.动态培养后血管支架表面的细胞仍有50%残留,沿流场方向排列.结论 人骨髓间充质干细胞诱导分化的内皮种子细胞在脱细胞牛颈静脉血管支架上可以黏附生长.     

骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的：体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步临床应用奠定基础。方法：将SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后，以生长状态良好的骨髓间充质干细胞接种于制备好的组织工程化脱细胞真皮支架上，进行体外联合培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程皮肤结构。结果：体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好，传代扩增容易，组织工程化脱细胞真皮基质去细胞完全，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好，可体外构建组织工程皮肤。结论：利用体外扩增培养的骨髓间充质干细胞及制备的组织工程化脱细胞真皮基质可以体外联合构建组织工程皮肤。     

新型骨组织工程β-TCP／CPPF／PLLA支架复合BMSCs修复节段性骨缺损的影像学研究

目的：将自体骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）接种到β-TCP／CPPF／PLLA支架上,进行体外复合培养,构建组织工程人工骨,植入兔桡骨大段骨缺损模型中,评估BMSCs／β-TCP／CPPF／PLLA复合体促进成骨的作用。方法：用新西兰大白兔40只,随机分为BMSCs／β-TCP／CPPF,PLL复合物组（A组）、β-TCP／CPPF／PLLA支架组（B组）、空白对照组（C组）共三组,建立兔桡骨双侧大段骨缺损模型,相应植入自体细胞材料复合物和单纯支架材料,空白对照组不作任何处理。术后4、8、12、16周处死动物,摄X线片观察骨缺损修复情况。结果：X线检查结果：A组术后2周可见缺损处有散在的、少量的模糊状骨痂生成,术后4周可见明显的骨生成影像,成云雾状,均匀分布在骨缺损区,术后8周整个缺损区均可见到骨痂生成,成骨现象较4周更加明显,部分髓腔已通,术后12～16周,缺损区已完全为新生的骨组织充填,骨髓腔已完全再通,修复区比正常的桡骨较细。B组、C组术后2～16周,虽有不同程度的成骨现象,但没有完全修复骨缺损区,B组较C组修复明显。X线评分结果：A组在各时期均明显高于B组,差异具有显著性（P〈0．01）。结论：自体BMSCs与β-TCP／CPPF／PLLA复合物移植能修复大节段的骨干缺损。