婴儿双歧杆菌介导的CD和UPRT联合5-FC基因疗法对黑色素瘤的体外治疗实验研究

目的 采用婴儿双歧杆菌为载体,探讨尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(UPRT)对胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统抗瘤作用的增强效应.方法 构建原核表达质粒pGEX-UPRT,以电穿孔法将该质粒转化入婴儿双歧杆菌,筛选阳性重组菌并鉴定.采用MTT法检测表达的UPRT是否可以与CD产生抗瘤协同作用,并观察细胞形态学改变.结论 重组婴儿双歧杆菌可以正确表达UPRT.体外MTT检测显示CD UPRT组细胞存活率低于对照组(P＜0.01),且可使B16-F10鼠黑色素瘤细胞对5-FC的杀伤敏感性(IC50＝0.015 μmol/mL)提高,是CD组(IC50＝0.127 μmol/mL)的8.5倍.形态学观察CD UPRT组肿瘤细胞显示出明显的损伤性改变,细胞生长受到明显抑制,而UPRT组和CD组变化明显不如前者.结论 婴儿双歧杆菌联合转导UPRT基因可明显增强CD/5-FC自杀基因系统对鼠黑色素瘤细胞B16-F10的杀伤作用.     

婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC自杀基因系统对黑色素瘤的抑瘤实验

目的 观察婴儿双歧杆菌介导的胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶(CD／5-FC)自杀基因系统对黑色素瘤的体内、外抑瘤效果。方法 含重组CD基因的婴儿双歧杆菌中加入5-FC．厌氧条件下培养24h后取其上清液．加到黑色素瘤B16-F10细胞上．观察其对细胞形态及细胞生长抑制率的影响;建立小鼠黑色素瘤动物模型,尾静脉注入含重组CD基因的婴儿双歧杆菌,腹腔注入5-FC,观察携带重组CD基因的婴儿双歧杆菌联合5-FC对黑色素瘤肿瘤体积及肿瘤体积倍增时间的影响。结果 ①体外实验：实验组肿瘤细胞形态显示出显著的损伤性改变,细胞生长受到明显抑制．而对照组肿瘤细胞影响不大。②小鼠黑色素瘤动物模型实验结果显示,经重组婴儿双歧杆菌联合5-FC治疗21d．实验组肿瘤倍增时间明显长于对照组．其肿瘤体积明显小于对照组．且随着观察时间的延长,这种差异越显著。结论 婴儿双歧杆菌介导的CD／5-FC自杀基因系统对黑色素瘤具有明显的抑瘤效果。     

厌氧菌介导的肿瘤靶向自杀基因系统对鼠黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤作用研究

目的 构建婴儿双歧杆菌介导的胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)肿瘤基因治疗系统,探讨该系统对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的体外杀伤效应.方法 构建重组质粒pGEX-CD,以电穿孔法转化婴儿双歧杆菌,筛选阳性克隆菌,然后加入5-FC厌氧培养,24 h后取其上清液,作用于小鼠黑色素瘤B16-F10细胞,采用MTT法检测细胞存活率,并观察细胞形态学改变.结果 成功构建出婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC肿瘤基因治疗系统.与空白对照组和pGEX组相比,CD组肿瘤细胞发生了明显的形态学改变,细胞存活率明显降低.结论 婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC系统对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞具有明显的体外杀伤效应.     

厌氧菌介导的CD/5-FC系统对鼠黑色素瘤的杀伤效应

目的 构建婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC肿瘤基因治疗系统,探讨该系统对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的体外杀伤效应. 方法 构建重组质粒pGEX-CD,以电穿孔法转化婴儿双歧杆菌,筛选阳性克隆菌,然后加入5-FC厌氧培养,24h后取其上清,作用于小鼠黑色素瘤B16-F10细胞,采用MTT法检测细胞存活率,并观察细胞形态学改变. 结果 成功构建出婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC肿瘤基因治疗系统.与对照组和pGEX组相比,CD组的肿瘤细胞发生了明显的形态学改变,细胞存活率明显降低. 结论 婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC系统对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞具有明显的体外杀伤效应.     

超声微泡联合pDsRed2-N1-CD/UPRT融合自杀基因对肺癌细胞的杀伤作用

目的：探讨超声微泡联合pDsRed2-N1-CD/UPRT融合自杀基因在肺癌A549细胞中的表达水平及其杀伤作用。方法：提取前期构建的pDsRed2-N1-CD/UPRT质粒,转染肺癌A549细胞,分为A组：空白对照组;B组：脂质体+质粒;C组：超声照射+脂质体+质粒;D组：超声照射+微泡+脂质体+质粒。荧光显微镜下观察质粒的转染情况,免疫细胞化学法及Western blot法检测胞嘧啶脱氨酶（Cytosine deaminase,CD）、尿嘧啶磷酸核糖转移酶（Uracil phosphoribosyltransferase,UPRT）在各组细胞中的蛋白表达水平,MTT法检测超声微泡联合CD/UPRT质粒对肺癌A549细胞的生长抑制作用。结果：超声微泡能提高A549细胞中CD/UPRT质粒转染率达（54.8±2.59）%。免疫细胞化学与Western blot结果均显示联合超声微泡后CD、UPRT蛋白表达明显增加（P<0.05）。在前体药物５－氟尿嘧啶（５－Fluorouracil,5-FU）作用下,CD/UPRT质粒转染对细胞有一定的杀伤作用,联合超声微泡后,细胞的生长抑制率明显升高（P<0.05）。结论：超声微泡能提高CD/UPRT质粒在肺癌A549细胞中的转染率及CD、UPRT在细胞中的蛋白表达,从而增强CD/UPRT对肺癌A549细胞的杀伤作用。     

靶向调控UPRT/5-FU自杀基因系统对前列腺癌细胞旁观者效应的研究

目的研究前列腺特异性膜抗原(PSMA)增强子(enhancer)/启动子(promoter)靶向性调控尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)/5-氟尿嘧啶(5-FU)自杀基因系统对前列腺癌细胞株的旁观者效应。方法应用自行构建PSMA启动子/增强子靶向性调控的UPRT基因真核表达质粒pPSMA enhancer/promoter-UPRT,脂质体介导转染质粒,并应用G418进行稳定表达UPRT基因的前列腺癌细胞株的筛选。转染质粒pPSMA enhancer/promoter-UPRT的前列腺癌细胞和非转染细胞按不同比例混合培养,UPRT/5-FU自杀基因系统配给,MTT法检测其对前列腺癌细胞杀伤的旁观者效应。结果成功筛选稳定表达UPRT基因的前列腺癌细胞株;通过转染细胞和非转染细胞按照不同比例混合,结果显示该自杀基因系统并没有明显的旁观者效应,随着转染比例的增多,细胞增殖抑制率也逐渐增加,没有出现跳跃明显性增加。结论UPRT可以使5-FU快速转化毒性物质,发挥细胞毒作用,但发挥细胞毒杀作用中的旁观者效应不明显。     

携带重组胞嘧啶脱氨酶基因的婴儿双歧杆菌对鼠黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤效应研究

目的将携带胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组婴儿双歧杆菌应用于肿瘤的基因导向酶前药物疗法,利用厌氧菌趋低氧代谢的特性构建一种全新的肿瘤靶向基因治疗系统。方法PCR扩增CD目的基因、酶切后连接目的基因与质粒片段,电穿孔法将重组体转染婴儿双歧杆菌,筛选阳性克隆抽提质粒,酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定,并体外检测CD基因的表达。结果携带自杀基因CD的重组载体成功地被转染进婴儿双歧杆菌,并能表达CD酶活性,当加入CD酶底物5-FC后,显示出对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞明显的杀伤效应。结论成功构建了携带自杀基因CD的重组婴儿双歧杆菌,重组菌在体外显示出对B16-F10肿瘤细胞有明显的抑制效应。     

CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较

【目的】探讨CEA启动子(CEA promoter，Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)与胸苷激酶(thymidine kinase，TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因。【方法】以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组，未转染者为对照组，5-氟胞嘧啶(5-fluomcytosine，5-Fc)组系列质量浓度：10、8、6、4、2、0μg／mL；更昔洛韦(ganciclovir，GCV)组系列质量浓度：5、4、3、2、1、0μg／mL；两药联合应用的系列质量浓度：(10 5)、(8 4)、(6 3)、(4 2)、(2 1)、0μg／mL。光镜观察细胞形态，噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate，GIR)及半数抑制浓度(IC50）。病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养，给予5-Fc 5μg／mL或，和GCV10μg／mL，噻唑蓝法测定细胞GIR。【结果】对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低，5-Fc组IC50为2400μg／mL，GCV组为3500μg/mL。实验组随5-Fc与GCV剂量增加，对细胞的杀伤作用明显增加，5-Fc组IC50为5．75μg／mL，GCV组为3．50μg／mL两者同时应用相当于5-Fc 1．90μg/mL GGV0．95μg／mL，细胞对5-Fc的敏感性提高417．4倍，对GCV的敏感性提高1000倍。病毒杀伤Lovo细胞具有明显的“旁观者”效应，联合应药组的“旁观者”效应明显高于单独应用组。【结论】双自杀基因细胞毒效应以及“旁观者”效应均高于单一自杀基因。     

婴儿双歧杆菌对小鼠黑色素瘤模型肿瘤组织的靶向性

目的：探讨婴儿双歧杆菌对黑色素瘤组织是否具有靶向特性。方法：采用荷瘤鼠尾静脉推注。H-TdR标记婴儿双歧杆菌示踪分析、组织培养和组织切片革兰氏染色观察婴儿双歧杆菌的瘤组织靶向性。结果：瘤组织内放射性强度持续增强，正常组织放射性强度则持续减弱。组织培养显示婴儿双歧杆菌在瘤组织内富集增殖。组织切片显示瘤组织内大量革兰氏染色阳性条杆状紫蓝色深染区，而正常组织中却无。结论：婴儿双歧杆菌对黑色素瘤具有较好的靶向性。     

婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对大鼠膀胱癌组织细胞凋亡及Fas/FasL表达的影响

目的 评价婴儿双歧杆菌(BI)介导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因治疗系统对SD大鼠膀胱癌的治疗效果,探讨其诱导大鼠膀胱癌组织细胞的凋亡及对大鼠膀胱癌组织Fas/FasL mRNA和蛋白表达的影响.方法 N甲基亚硝基脲(MNU)膀胱灌注法诱导建立大鼠膀胱肿瘤模型,并随机分为生理盐水/GCV对照组(生理盐水组)、BI-pGEX-5X-1/GCV组(空质粒组)和BI-pGEX-TK/GCV治疗组(重组质粒组).分别将生理盐水、BI-pGEX-5X-1、BI-pGEX-TK经尾静脉注射到各组荷瘤大鼠体内,联合腹腔注射GCV,治疗4周后,称取各组膀胱癌组织质量.TUNEL法检测各组肿瘤组织凋亡,RT-PCR、蛋白质印迹法(Western blot)检测各组肿瘤组织Fas/FasL mRNA及蛋白表达水平.结果 与空质粒组及生理盐水组比较,重组质粒组荷瘤大鼠膀胱质量明显降低(P＜0.01);TUNEL法检测发现各组均出现不同程度的肿瘤细胞凋亡,与空质粒组及生理盐水组比较,重组质粒组凋亡最为显著(P＜0.01);与空质粒组及生理盐水组比较,重组质粒组的荷瘤大鼠膀胱癌肿瘤组织细胞Fas/FasL mRNA及其蛋白表达明显上调(P＜0.05).结论 双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对大鼠膀胱肿瘤生长有明显抑制作用,可能通过激活Fas/FasL凋亡途径,诱导大鼠膀胱肿瘤细胞的凋亡,从而发挥抑瘤作用     

Pharmacokinetics and the bystander effect in CD：：UPRT/5-FC bi-gene therapy of glioma

Background Cytosine deaminase （CD） converts 5-fluorocytosine （5-FC） to 5-fluorouracil （5-FU） in CD/5-FC gene therapy, 5-FU will be mostly converted into nontoxic 13-alanine without uracil phosphoribosyltransferase （UPRT）. UPRT catalyzes the conversion of 5-FU to 5-fluorouridine monophosphate, which directly kills CD：：UPRT-expressing cells and surrounding cells via the bystander effect. But the pharmacokinetics and the bystander effect of CD：：UPRT/5-FC has not been verified in vivo and in vitro. Before the CD：：UPRT/5-FC bi-gene therapy system is used in clinical trial, it is essential to monitor the transgene expression and function in vivo. Thus, we developed a preclinical tumor model to investigate the feasibility of using ^19F-magnetic resonance spectroscopy （^19F-MRS） and optical imaging to measure non-invasive CD and UPRT expression and its bystander effect. Methods C6 and C6-CD：：UPRT cells were cultured with 5-FC. The medium, cells and their mixture were analyzed by ^19F-MRS. Rats with intracranial xenografted encephalic C6-CD：：UPRT glioma were injected intraperitoneally with 5-FC and their ^19F-MRS spectra recorded. Then the pharmacokinetics of 5-FC was proved. Mixtures of C6 and C6-CD：：UPRT cells at different ratios were cultured with 5-FC and the cytotoxic efficacy and survival rate of cells recorded. To determine the mechanism of the bystander effect, the culture media from cell comprising 25% and 75% C6-CD：：UPRT cells were examined by ^19F-MRS. A comparative study of mean was performed using analysis of variance （ANOVA）. Results ^19F-MRS on samples from C6-CD：：UPRT cells cultured with 5-FC showed three broad resonance signals corresponding to 5-FC, 5-FU and fluorinated nucleotides （F-Nuctd）. For the C6 mixture, only the 5-FC peak was detected. In vivo serial ^19F-MRS spectra showed a strong 5-FC peak and a weak 5-FU peak at 20 minutes after 5-FC injection. The 5-FU concentration reached a maximum at about 50 minutes. The F-Nuctd signal appeared after about 1 hour, reached a maximum at around 160 minutes, and was detectable for several hours. At a 10% ratio of C6-CD：：UPRT cells, the survival rate was （79.55±0.88）% （P 〈0.01）. As the C6-CD：：UPRT ratio increased, the survival rate of the cells decreased. ^19F-MRS showed that the signals for 5-FU and F-Nuctd in the culture medium increased as the ratio of C6-CD：：UPRT in the mixture increased. Conclusions ^19F-MRS studies indicated that C6-CD：：UPRT cells could effectively express CD and UPRT enzymes. The CD：：UPRT/5-FC system showed an obvious bystander effect. This study demonstrated that CD：：UPRT/5-FC gene therapy is suitable for 5-FC to F-Nuctd metabolism; and ^19F-MRS can monitor transferred CD：：UPRT gene expression and catalysis of substrates noninvasively, dynamically and quantitatively.     

腺病毒载体介导的CD自杀基因体外抑瘤效果观察

目的:构建含CD基因的腺病毒载体pAd-CD, 进行肿瘤的自杀基因治疗.方法:分别构建了含CD基因和LacZ基因的重组病毒质粒载体,同质粒pJM17共转染293细胞同源重组后包装为感染性腺病毒颗粒,经滴度测定后,体外分别感染小鼠前胃癌肿瘤细胞MFC.结果:感染Ad-LacZ的细胞可被X-gal染成蓝色,感染Ad-CD的细胞予前药5-FC可见肿瘤细胞杀伤效果明显.结论:腺病毒载体可有效地转CD和LacZ基因进入肿瘤细胞,C D基因作为自杀基因进行体外肿瘤治疗效果明显,本实验构建的新载体及结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了基础.     

CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较

[目的]探讨CEA启动子(CEA promoter,Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)与胸苷激酶(thymidine kinase,TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因.[方法]以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组,未转染者为对照组,5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-Fc)组系列质量浓度:10、8、6、4、2、0μg/mL;更昔洛韦(ganciclovir,GCV)组系列质量浓度:5、4、3、2、1、0μg/mL;两药联合应用的系列质量浓度:(10 5)、(8 4)、(6 3)、(4 2)、(2 1)、0μg/mL.光镜观察细胞形态,噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate,GIR)及半数抑制浓度(IC50).病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养,给予5-Fc5μg/mL或/和GCV 10μg/mL,噻唑蓝法测定细胞GIR.[结果]对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低,5-Fc组IC50为2 400 μg/mL,GCV组为3 500μg/mL.实验组随5-Fc与GCV剂量增加,对细胞的杀伤作用明显增加,5-Fc组IC50为5.75μg/mL,GCV组为3.50 μg/mL,两者同时应用相当于5-Fc1.90 μg/mL GCV 0.95 μg/mL,细胞对5-Fc的敏感性提高417.4倍,对GCV的敏感性提高1 000倍.病毒杀伤Lovo细胞具有明显的"旁观者"效应,联合应药组的"旁观者"效应明显高于单独应用组.[结论]双自杀基因细胞毒效应以及"旁观者"效应均高于单一自杀基因.     

hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.     

CD基因对大肠癌杀伤作用的实验研究

目的：探讨ＣＤ基因对大肠癌靶向治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动ＣＤ基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡＣＤＮa,脂质体裹 法将重组组织特异性载体pＣＤ２在逆转录病毒包装细胞ＰＡ３１７细胞中进行包装,收获病毒上清后分别转染入高分泌ＣＥＡ的大肠癌细胞ＬoＶo中,经Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后进行体外前药敏感实验及观察旁观者交应,然后再将转基因ＬoＶo细胞接种对裸鼠皮下成     

脂质体介导的CD/5-FC自杀基因体系协同干扰素体内抑瘤及旁观者效应的观察

目的 观察阳离子脂质体介导的CD/5-FC自杀基因体系协同γ-干扰素活体内对肿瘤的抑制效应及远端旁观者效应.方法 采用阳离子脂质体介导CD基冈瞬时转染小鼠肝癌H22及未转染的H22细胞,分别接种于昆明小鼠双侧前腋下皮下;向小鼠体内注射5-FC及γ-干扰素,观察在γ-干扰素协同作用下5-FC对转染瘤体的抑制作用和远处无转染瘤体的抑制即远端旁观者效应.结果 5-FC对转染CD基因侧瘤体抑制明显,抑制率为79.39%(P＜0.05);在γ-干扰素的协同下CD/5-FC的抑瘤作用得到了增强,抑制率为93.47%,与无γ-干扰素协同相比,对癌细胞抑制作用明显增强(P＜0.05);存在远端旁观者效应,远端未转染瘤体的抑制率为54.42%(P＜0.05);在γ-干扰素的协同下远端旁观者效应得到显著增强,抑制率达到88.43%.同无γ-干扰素相比有差异有显著性(P＜0.05).结论 体内CD/5-FC自杀基因体系联合γ-干扰素对肝癌细胞有更好的抑制效应,对肝癌的治疗有很好的应用前景.