脂溢性角化病皮损中Smad4 mRNA表达水平的变化

目的探讨转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号转导途径中共有Smad——Samd4 mRNA在脂溢性角化病皮损中的表达水平及其意义。方法应用反转录-实时定量聚合酶链反应(RT and quantitative Real-Time PCR)方法分别检测脂溢性角化病皮损与正常对照皮肤中Smad4的mRNA表达情况。结果脂溢性角化病皮损中Smad4的mRNA表达水平显著低于正常对照皮肤。结论脂溢性角化病皮损中Smad4表达下调可能干扰TGF-β信号下传,使TGF-β抑制上皮过度增生的作用不能有效发挥,从而促进了脂溢性角化病皮损中表皮的过度增生。     

脂溢性角化病皮损区Smurf1和Smurf2表达增强

目的 探讨脂溢性角化病皮损区Smad泛素化调节因子1和2(Smad ubiquitination regulatory factor 1 and 2, Smurf1, 2)的表达及其意义.方法 采用实时定量聚合酶链式反应(quantitative Real-time PCR,RT-PCR)和免疫组织化学技术分别检测脂溢性角化病皮损和对照正常皮肤中Smurf1和2的表达情况.结果 与对照正常皮肤相比,脂溢性角化病皮损中Smurf1和2表达水平上调.结论 脂溢性角化病皮损中Smurf1和2的过度表达可干扰转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)信号转导通路,可能使TGF-β抑制上皮增生的作用不能有效发挥,促进了脂溢性角化病表皮的过度增生.     

脂溢性角化病皮损的表皮中TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体表达下调

目的探讨转化生长因子-β受体（tmnsforming growth factor β receptor,TGF—βR）在脂溢性角化病皮损中表达水平的变化及其意义。方法采用实时定量聚合酶链式反应（quantitative real—time PCR）和S-P免疫组织化学技术分别检测脂溢性角化病及正常对照皮肤中Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受体（TGF—βRⅠ,TGF—βRⅡ）的表达。结果TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ在脂溢性角化病皮损表皮中的表达较正常表皮显著降低。结论脂溢性角化病皮损中表皮TGF-β受体表达下调有助于表皮细胞的异常增生,促进了该表皮肿瘤的形成。     

子宫内膜样腺癌间质细胞和癌细胞TGFβR/Smads的表达

目的探讨子宫内膜间质细胞转化生长因子β受体（TGFβR）、Smad蛋白（Sma-and Mad-related protein )信号通路的状态和癌细胞TGFβR/Smads信号通路的关系,及其这一信号通路可能对子宫内膜癌发生发展的影响。方法采用SP免疫组化方法检测12例子宫肌瘤、18例子宫内膜样腺癌中TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达。结果在正常子宫内膜细胞中均有TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达,正常子宫内膜腺体上皮细胞和间质细胞中TGFβR蛋白与Smads蛋白的表达一致,两者成正相关（r=0.86, r=0.78）;子宫内膜癌癌细胞和间质细胞中TGFβR/Smads蛋白的表达不一,子宫内膜癌本身的间质细胞TGFβR/Smads蛋白表达缺陷。结论正常子宫增生期／分泌期内膜细胞存在TGFβR/Smads信号表达,子宫内膜癌本身的间质细胞存在TGFβR/Smads信号缺陷;探讨内膜间质细胞TGFβR/Smads信号通路作用,为内膜癌的基因治疗提供了新的靶点。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对大鼠肾成纤维细胞转化生长因子β1/Smad信号途径的作用研究

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂阻断转化生长因子（TGF）β1致肾间质纤维化作用的机制，探讨其抗肾间质纤维化的潜在作用。方法体外培养大鼠肾成纤维细胞株（NRK／49F），观察PPARγ配体15d-PGJ2及其激动剂曲格列酮和齐格列酮对TGFβ1诱导的纤维连接蛋白（FN）mRNA表达的影响。利用Western印迹技术观察PPARγ激动剂对TGFβ1诱导的FN和Smad蛋白表达的影响。结果（1）与1ng／ml TGFβ1组比较，5ng／ml TGFβ1组FN mRNA表达量增加了3．6倍（P〈0．01），5ng／ml TGFβ1刺激24h时较刺激前增加了2．4倍（P〈0．01），TGFβ1诱导FN mRNA表达呈一定范围内的剂量（0—5ne／ml）和时间（0—24h）依赖效应。（2）与5ng／ml TGFβ1组比较，10μmol 15d-PGJ2、曲格列酮和齐格列酮预处理组FN mRNA表达量分别降低37．3％、41．5％和22．7％，FN蛋白表达量分别降低20．6％、38．1％和28．6％。（3）5ng／ml TGFβ1以时间（0．2h）依赖方式诱导p-Smad2／3蛋白表达量增加，作用1h时达到高峰；5ng／ml TGFβ1组p-Smad2／3蛋白表达量较对照组和2ng／ml TGFβ1组分别增加3．42倍和0．97倍。（4）15d-PGJ2、曲格列酮和齐格列酮预处理组p-Smad2／3蛋白表达量与5ng／ml TGFβ1组比较分别降低61．2％、53．0％和59．S％。3种药物干预组之间p-Smad2／3蛋白表达量比较差异无统计学意义，各组Smad2和Smad3蛋白表达量无显著变化。结论PPART激动剂可以抑制TGFβ1诱导的肾间质成纤维细胞细胞外基质合成，其机制可能与阻断TGF-β1／Smad信号途径有关，提示PPARγ激动剂具有抗肾间质纤维化的潜在作用，可能成为延缓终末期肾功能衰竭的治疗新手段之一。     

寻常性银屑病皮损区表皮Smad4表达下调

目的 探讨转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号转导途径中共有Smad(Smad4)在寻常性银屑病皮损中的表达水平及其意义.方法 采用反转录-实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-Time RT-PCR)和免疫组化技术分别检测寻常性银屑病皮损和正常对照皮肤中Smad4 mRNA及其蛋白质的表达情况.结果 寻常性银屑病皮损中Smad4 mRNA及其蛋白质表达水平显著低于正常对照皮肤.结论 寻常性银屑病皮损表皮中Smad4表达下调可干扰TGF-β信号转导,有助于寻常性银屑病皮损中表皮增殖状态的形成.     

FOXP3在正常人皮肤和表皮肿瘤中的表达及意义

目的   探讨叉头状转录因子P3（forkhead box protein-3,FOXP3）在正常人皮肤和不同表皮肿瘤皮损中的表达及意义。方法   应用免疫组织化学EnVision法检测20例脂溢性角化、19例日光性角化、21例鲍恩病、13例鳞状细胞癌及13例正常人皮肤中FOXP3的表达。结果   脂溢性角化、日光性角化、鲍恩病、鳞状细胞癌皮损中FOXP3+淋巴细胞阳性率均高于正常皮肤（P＜0.01）;脂溢性角化、日光性角化、鲍恩病、鳞状细胞癌间FOXP3+淋巴细胞阳性率差异有统计学意义（P＜0.01）;日光性角化FOXP3+淋巴细胞阳性率高于脂溢性角化（P＜0.05）;鲍恩病、鳞状细胞癌FOXP3+淋巴细胞阳性率均高于日光性角化（P＜0.05）,而其在鲍恩病与鳞状细胞癌间表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论   FOXP3+淋巴细胞在表皮良性肿瘤、癌前病变、恶性肿瘤中的表达呈逐渐增高趋势,在表皮肿瘤的免疫逃逸中发挥重要作用,促进了其发生发展。     

参芪解毒汤对腺嘌呤所致慢性肾衰大鼠肾组织转化生长因子β1和Smad2、3表达的影响

目的：观察参芪解毒汤对腺嘌呤诱导的慢性肾衰大鼠肾脏组织转化生长因子p1（transforming growth factor—β1,TGF—β1）、Smad2和Smad3蛋白表达的影响,探讨参芪解毒汤治疗慢性肾衰竭（chronic renal failure,CRF）的作用机制。方法：将90只健康Wistar雄性大鼠随机分成正常对照组、模型组、氯沙坦组、低剂量参芪解毒汤组、中剂量参芪解毒汤组和高剂量参芪解毒汤组。腺嘌呤灌胃复制慢性肾衰大鼠模型,检测造模后血浆肌酐（ereatinine,Cr）、尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）水平判断造模是否成功。治疗8周后,检测血浆Cr、BUN、三酰甘油（triacylglycerol,TAG）、胆固醇（cholesterol,Ch01）和白蛋白（albuminous,ALB）水平,HE染色观察大鼠肾脏组织病理学变化,蛋白印迹法检测肾组织TGF—β1、Smad2和Smad3蛋白的表达情况。结果：与治疗前相比,氯沙坦组和低、中、高剂量参芪解毒汤组Cr、BUN水平明显降低（Pd0．01）;治疗后,各治疗组Cr、BUN和Chol水平低于模型组（P〈0.01,P〈0．05）,ALB水平高于模型组（P〈0.01）。病理结果显示,各治疗组大鼠的肾组织病理损伤明显轻于模型组。蛋白印迹法检测提示各治疗组肾组织TGF—β1、Smad2和Smad3的蛋白表达低于模型组（P〈0．01）。结论：参芪解毒汤通过抑制TGF-β1／Smads信号传导通路发挥抗肾脏纤维化作用,减缓CRF进程。     

脂溢性角化病中TGF-α及EGFr的表达

目的 :探讨转化生长因子α(TGF α)和表皮生长因子受体 (EGFr)在脂溢性角化病 (seborrheickeratosis,SK)发病机制中的作用。方法 :采用免疫组化SP法检测 30例脂溢性角化病 (SK)组织中TGF α和EGFr的原位表达 ,并选用 1 0例正常皮肤组织作为对照。结果 :SK组中TGF α、EGFr的阳性表达程度分别显著高于对照组。结论 :SK组织中存在TGF α和EGFr的过度表达 ,这种异常高表达的TGF α和EGFr可能通过参与SK的自分泌生长环路而与SK的增生发展有关     

慢病毒介导Smad7基因对角膜基质细胞增殖与纤维增生的抑制作用

【摘要】 目的 探讨慢病毒介导的Smad7基因转导能否抑制角膜基质细胞的增殖和纤维增生反应。方法 培养SD大鼠的角膜基质细胞,慢病毒载体介导转染Smad7基因或空质粒基因,分别建立Smad7阳性细胞克隆及空质粒阳性细胞克隆。角膜基质细胞进行分组：①正常细胞组：正常基质细胞,不加TGFβ2;②TGFβ2对照组：正常基质细胞加TGFβ2共孵育;③空质粒组：感染空质粒慢病毒的阳性细胞,加TGFβ2共孵育;④Smad7组：感染Smad7慢病毒的阳性细胞,加TGFβ2共孵育。TGFβ2的终浓度为10ng/ml。在TGFβ2刺激2h后Western blot检测TGFβ/Smad信号传导因子Smad2蛋白的磷酸化蛋白（phosphorylated Smad2,p-Smad2）。TGFβ2刺激48h后Western blot和real-time PCR检测α-SMA（α-smooth muscle actin）、Ki67、Ⅲ型胶原蛋白（Type Ⅲ collagen, ColⅢ）mRNA和蛋白的表达。MTT法检测基质细胞生长活性。结果 Smad7基因转导抑制了Smad2蛋白的磷酸化,减少了Ki67、α-SMA和胶原III mRNA和蛋白的表达,角膜基质细胞的生长活性也下降。结论 Smad7基因转导可阻断大鼠角膜基质细胞TGFβ信号传导通路,减少Smad2的磷酸化,阻止基质细胞的活化增殖,阻断基质细胞向肌纤维母细胞的转化,并且减少胶原蛋白III的合成,从而抑制角膜基质细胞增殖和纤维增生。     

Smad3选择性调节TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨转化生长因子β1（TGF-β1）信号转导通路下游信号分子Smad2、Smad3在TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）成骨分化中的作用。方法采用RT-PCR、Western blot检测TGF-β1促MSCs成骨分化过程中Smad2、Smad3mRNA和蛋白表达的变化;脂质体介导稳定转染Smad3ΔC,间接免疫荧光试验鉴定;采用RT-PCR检测转染细胞中碱性磷酸酶（ALP）和核心结合因子（cbfa1）mRNA的表达,用对硝基苯磷酸盐（PNP）法检测细胞ALP活性,用茜素红染色法检测细胞矿化能力,观察Smad3ΔC对MSCs成骨分化的影响。结果在TGF-β1刺激后24h,MSCs中Smad3的mRNA和蛋白表达量明显减少（P〈0.01）,而整个刺激过程中,Smad2的mRNA和蛋白表达量无明显变化（P〉0.05）;稳定转染细胞中c-Myc抗原阳性表达;受TGF-β1刺激后,MSCs和V-MSCs（空载体转染组）中ALP、cbfa1mRNA的表达水平、矿化能力明显高于Smad3ΔC-MSCs;随TGF-β1刺激时间延长,Smad3ΔC-MSCs中ALP活性增加缓慢,仅于48h有明显增加（P〈0.05）,但与同时段MSCs和V-MSCs中ALP活性相比,差异有极显著性意义（P〈0.01）。结论TGF-β1促进MSCs成骨分化这一生物学效应的输出受Smad3特异性和选择性的调节。     

信号传导蛋白Smad2和Smad3的研究进展

Smad蛋自家族是近年来发现的新的细胞内信号转导蛋白,哺乳类中共发现了有8种不同的Smad蛋白.可分为3个不同的亚族:R-Smad、Co-Smad和I-Smad.Smad2和Smad3属于R-Smad,本文从Smad2和Smad3的结构、功能以及相关蛋白等多个方面探讨Smad2和Smad3在TGF-Bl信号转导中的不同作用.     

黄芪注射液抑制胰腺纤维化大鼠TGF-β_1和Smad2/3表达的研究

目的通过研究黄芪注射液对实验性胰腺纤维化大鼠TGF-β1及其Smad2/3表达影响,探索其缓解胰腺纤维化的机制。方法大鼠随机分为5组,模型组和治疗组采用胰胆管注射2%TNBS溶液的方法制备慢性胰腺纤维化大鼠模型,治疗组分别给予低、中、高剂量的黄芪注射液治疗;造模后第6周,免疫组化检测胰腺TGF-β1、Smad2/3和Ⅰ型胶原的表达。结果与模型组相比,随着黄芪注射液剂量的增加,治疗组大鼠胰腺TGF-β1、Smad2/3和Ⅰ型胶原表达逐渐减少（P〈0.05）,具有统计学意义。结论黄芪注射液可以阻断TGF-β1的Smad2/3信号通路,缓解胰腺的纤维化。     

银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝脏Smad2/3表达的影响

目的观察银杏叶提取物(GbE)对肝组织Smad2/3表达的影响,探讨GbE抗肝纤维化的作用机制。方法采用CCl4诱导大鼠肝纤维化,同时分别以200、100、50mg/(kg.d)的GbE进行干预,并设复方鳖甲软肝片为对照组,6周后取肝组织,原位杂交及免疫组化技术分别检测肝组织Smad2/3mRNA及蛋白的表达。结果模型组大鼠肝组织Smad2/3mRNA及蛋白的表达正常组明显增高,应用不同剂量的GbE及复方鳖甲软肝片干预后肝组织Smad2/3mRNA及蛋白较模型组显著下降。结论 GbE降低Smad2/3mRNA及蛋白表达可能是其抗肝纤维化作用的重要机制之一。     

MAPK抑制因子对HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核转位的影响

目的 探究3种丝裂原活化蛋白激酶( MAPK)抑制因子对转化生长因子-β( TGF-β)活化的大鼠肝星状细胞( HSC)中Smad2/3磷酸化及Smad4 核转位的影响. 方法采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶原位肝灌流法分离正常大鼠HSC并传代培养,分别用细胞外信号调节激酶( ERK)、c-Jun氨基末端激酶( JNK )、p38 抑制因子( PD98059、SP600125、SB203580 )与HSC共同培养,再加入TGF-β1活化细胞,采用免疫沉淀和 Western blot 法检测 pSmad2C、pSmad2L、pS-mad3L蛋白表达;采用细胞免疫荧光法检测Smad4 蛋白表达及细胞内定位情况. 结果 Western blot显示静息状态下HSC几乎不表达 pSmad2C 而低表达 pSmad2L、pSmad3L, TGF-β1刺激后显著上调上述磷酸化蛋白表达, p38 抑制因子(1、3 μmol/L)、ERK 抑制因子(1 μmol/L)对 Smad2C、Smad2L、Smad3L 磷酸化无显著影响;p38 抑制因子( 10μmol/L)降低了 pSmad3L 蛋白表达;ERK 抑制因子( 3、10μmol/L)降低了pSmad2C蛋白表达;JNK抑制因子(1、3、10μmol/L)减少了 pSmad2C、pSmad2L、pSmad3L 蛋白表达.TGF-β1刺激可明显诱导Smad4核转位,而3种MAPK抑制因子不同程度地抑制TGF-β1 诱导的Smad4 转位入核. 结论 在 HSC 细胞中 TGF-β1 可能通过活化 JNK 通路促进Smad2/3磷酸化,活化ERK、JNK、p38 通路促进Smad4 核转位.     

鳖甲煎改良方对大鼠肝纤维化的作用及其机制研究

目的探讨鳖甲煎改良方对大鼠肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的作用及其机制。方法 SD雄性大鼠90只,随机分6组,每组15只,其中以40%CCl4处理(3 ml/kg)8周复制中毒肝纤维化模型(模型组),复制模型的同时分别用鳖甲煎改良方高剂量组28.4 g/(kg.d)、中剂量组14.2 g/(kg.d)、低剂量组7.1 g/(kg.d)灌胃治疗并且以复方鳖甲软肝片灌胃0.6 g/(kg.d)作阳性对照组治疗6周。以复制模型同样方式与用量于右后腿皮下注射橄榄油及生理盐水灌胃(10 ml/kg.d)作空白对照组。苏木精-伊红(HE)染色观察各组8周后肝纤维化变化程度,RT-PCR检测其转化生长因子β1(transforming growth factor beta one,TGF-β1)、Smad3及Smad7变化,免疫组化(S-P法)观测TGF-β1、smad3、smad7表达情况。结果 8周后,与模型组比较,鳖甲煎改良方高、中、低剂量组和复方鳖甲软肝片组肝小叶结构破坏明显减轻,部分肝细胞脂肪变性,炎性细胞浸润与少量胶原纤维形成;肝组织TGF-β1与Smad3的mRNA及蛋白表达显著减少(P<0.01),smad7 mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.01)且鳖甲煎改良方高、中、低剂量组和复方鳖甲软肝片组疗效并无显著差异。结论鳖甲煎改良方能显著改善大鼠肝纤维化,其作用机制可能与鳖甲煎改良方调控TGF-β/smad信号通路有关。     

Smads蛋白和转化生长因子β1在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的表达

目的观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道结构重塑的病理特征和气道慢性炎症的特点,探讨Smad 3、Smad 7和转化生长因子β1(TGF-β1)在COPD中的作用及其相互关系。方法将30只健康Wistar大鼠随机分为3组,正常对照组、盐水对照组和COPD组,通过气管内注射脂多糖和被动吸烟的方法建立COPD大鼠模型,检测动脉血气、支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数及病理形态学等指标,采用免疫组化法检测肺组织Smad 3、Smad 7和TGF-β1的表达。结果①BALF细胞总数:COPD组为(8.35±0.88)×108/L,正常对照组为(1.46±0.96)×108/L,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);②气道炎症病理学评分:COPD组为(69.30±4.99)分,正常对照组为(18.56±2.46)分,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);③肺泡腔直径:COPD组为(92.58±4.32)μm,正常对照组为(47.22±12.95)μm,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。④免疫组化指数:COPD组的Smad 3S、mad 7和TGF-β1表达分别为(4.37±0.15)分、(1.78±0.29)分和(3.97±0.20)分,正常对照组分别为(1.58±0.36)分、(2.68±0.44)分和(0.74±0.18)分,COPD组的Smad 3和TGF-β1表达显著高于正常对照组(P均<0.05),Smad 7表达则显著低于正常对照组(P<0.05)。结论多种炎性细胞参与COPD的发病;COPD气道重构的病理特征主要为小气道平滑肌不规则增生和细胞外基质沉积;Smad 3和TGF-β1在COPD的发病中起重要作用,而Smad 7对TGF-β1的负反馈抑制作用缺乏。     

Smad3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建Smad3基因RNAi慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的Smad3基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I和EcoR I双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSmad3慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用GC-shSmad3、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,构建出了Smad3 shRNA的慢病毒载体GC-shSmad3.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为3×103TU/ml.结论 成功构建Smad3基因RNAi慢病毒载体.     

肝纤维化和损肝因子的分子生物学研究

肝损伤是一个复杂的过程,各种致病因素可导致肝细胞变性、坏死和肝功能的改变。研究表明,一些细胞因子和炎性介质介导或参与了肝组织的损伤,并构成复杂的网络系统,直接或间接的损害了肝细胞。这些因子在肝脏疾病的发病机制中具有重要的作用。本文就肝损伤和其因子的关系予以综述。