肠上皮细胞中性氨基酸载体B0AT1的真核表达及稳定转染体系的建立

目的: 构建可表达人中性氨基酸载体B0AT1基因的真核表达载体,建立重组质粒转染的Hela细胞系,筛选出稳定表达人B0AT1的细胞株. 方法: 提取人正常小肠上皮细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出B0AT1基因片段,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后,将其插入至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-B0AT1,转化E.coli DH5α菌株感受态细胞,将阳性克隆脂质体法转染Hela细胞,经G418筛选获得稳定表达株,用RT-PCR法检测B0AT1基因的mRNA表达. 结果: 从小肠上皮细胞中成功克隆到人B0AT1基因.酶切和序列测定表明已成功构建真核表达载体pcDNA3.1-B0AT1,将此重组质粒转染的Hela细胞,可稳定表达人B0AT1基因,并筛选出稳定表达B0AT1的Hela细胞系.氨基酸摄取实验证实,转染pcDNA3.1-B0AT1的Hela细胞具有B0AT1基因的生物学活性. 结论: 重组人中性氨基酸载体B0AT1克隆成功,并在Hela细胞中获得稳定表达.     

HO-1真核表达质粒的构建及在肾小管上皮细胞中的表达

[目的]构建HO-1基因真核表达质粒,转染大鼠肾小管上皮细胞,检测其在细胞中的表达效果.[方法]从大鼠肾组织中提取总RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增大鼠HO-1基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )中,运用脂质体将重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1转染大鼠肾小管上皮细胞,通过RT-PCR和Western blot分析HO-1基因细胞转染及表达的效果. [结果]成功构建了HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1.RT-PCR及Western blot分析显示,HO-1基因能转染大鼠肾小管上度细胞并在细胞内有效表达. [结论]HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1的成功构建及其在肾小管上皮细胞中的有效表达为深入研究其生物学作用奠定了基础.     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

奈瑟氏淋球菌外膜蛋白PIA基因的克隆、真核表达与鉴定

目的克隆奈瑟氏淋球菌外膜蛋白PIA基因,构建稳定的真核重组表达载体,并在HELA细胞中表达。方法根据淋球菌PIA基因序列,利用Primer Premier5.0生物学软件设计一对特异性扩增引物,以淋球菌国际标准株基因组DNA为模板,PCR扩增除掉信号肽后PIA基因开放读码框（ORF）,将其插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建含目的基因的pcDNA3.1（＋）/PIA重组质粒,PCR及酶切鉴定重组载体,脂质体转染HELA细胞,以间接免疫荧光法检测PIA基因在HELA细胞中的表达。结果成功构建了pcDNA3.1（＋）/PIA重组质粒;pcDNA3.1（＋）/PIA能在HELA细胞中高效表达PIA蛋白。结论重组质粒pcDNA3.1（＋）/PIA构建成功并在HELA细胞中高效表达了PIA蛋白,为该蛋白的抗原性及功能学研究奠定了基础。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的：构建真核表达质粒pcDNA3／gD，并在体外COS-7细胞中进行表达。方法：体外PCR扩增出gD糖蛋白基因，克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后，转染COS-7细胞，用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果：构建了pcDNA3／gD真核表达质粒，经原位ELISA证实，转染，COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合，证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论：柯建的重组真核表达质粒pcDNA3／gD能够在COS-7细胞中表达。     

Angiostatin和Fas基因对人结肠癌的协同抑制作用

目的 探讨血管生成抑素Angiosmtin(AS)基因和Fas基因对人结肠癌细胞系LOVO的协同抑制作用.方法 构建pcDNA3-AS和pcDNA3-Fas质粒,用脂质体法分别将AS、Fas、AS和Fas基因转染体外培养的人结肠癌细胞系LOVO,用Western blot法检测目的 基因的表达,用MTT法检测转染AS和Fas基因对体外培养的人结肠癌细胞生长的影响.通过瘤内注射分别将AS、Fas、AS和Fas基因转染裸鼠皮下移植的人结肠癌肿瘤,检测首次基因转染后14 d肿瘤的大小.结果 基因转染后12、24、48和72h,Fas和AS共转染组及Fas组对人结肠癌LOVO细胞的抑制作用明显强于对照组(P＜0.01).质粒转染后14 d,Fas和AS共转染组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组、Fas组和AS组(P＜0.05);Fas组和AS组的肿瘤体积明显小于对照组(P＜0.05).结论 AS和Fas基因对体内人结肠癌有协同抑制作用.     

周期型马来丝虫基因稳定转染细胞株的建立

摘要:目的　将含周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Bm-CPI）基因的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染人宫颈癌细胞（Hela细胞）获得重组质粒稳定转染细胞株,为重组蛋白的获得提供基础。方法　将成功构建的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞,通过RT-PCR和SDS-PAGE鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。结果　重组真核表达质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞后,d 14可见G418抗性细胞株开始形成。G418抗性Hela细胞株筛选、扩大培养后RT-PCR扩增出621bp左右的目的条带;SDS-PAGE检测获得了明显的目的条带。结论　实验证实pcDNA3.1（+）-Bm-CPI重组质粒被成功转入Hela细胞,并获得稳定表达;为进一步研究Bm-CPI表达、蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。     

C/EBPα基因对子宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移能力的作用分析

目的:探索CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)基因对HeLa细胞增殖和定向迁移的影响。方法:用MTT方法检测C/EBPα基因重组质粒转染组、空质粒转染组和未转染组对HeLa细胞增殖的影响。用Transwell侵袭转移模型评价He-La细胞的迁移情况。其中,不同上室中分别加入C/EBPα基因重组质粒转染组、空质粒转染组和未转染组的HeLa细胞,下室中加入含20%FBS的培养基。结果:C/EBPα基因重组质粒转染组、转染空质粒组和未转染HeLa细胞组的吸光度值分别为0.21±0.01、0.24±0.01和0.24±0.02,重组质粒转染组与空质粒转染组和未转染HeLa细胞组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验发现重组质粒转染组与空质粒转染组和未转染HeLa细胞组相比,细胞迁移能力减弱,细胞穿膜数分别为12.0±2.2、39.0±3.2和39.6±2.6,重组质粒转染组与空质粒转染组和未转染HeLa细胞组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:C/EBPα基因能抑制子宫颈癌HeLa细胞的增殖和迁移能力。     

Adr亚型乙型肝炎病毒转染细胞模型的构建

目的建立乙型肝炎病毒（HBV）复制状态的细胞模型。方法利用分子亚克隆技术。将9600bp的adr亚型HBV全基因克隆至pcDNA3的EcoRI和HindⅢ位点构建pcDNA3—3HBV，通过脂质体介导的方法转染HepG2细胞，G418筛选。结果成功构建了质粒pcDNA3—3HBV，稳定转染后培养上清，ELISA检测结果显示，HBSAg、HBeAg阳性，且PCR检测前S／S基因阳性。PCR证实转染细胞中有HBVcccDNA存在，RT—PCR证实HBVS基因mRNA的表达。结论重组质粒pcDNA3．3HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制。     

结核杆菌含信号肽的Mtb8.4真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆结核杆菌含信号肽的Mtb8．4(MS)基因，导入真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组质粒pcDNA3．1( )-MS，并在真核细胞中进行表达。方法：提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR圹增，获得含信号肽的Mtb8．4(MS)基因后，与pcDNA3．1( )载体进行连接重组，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定；重组质粒转染COS-7细胞48h后，用RT—PCR方法鉴定MS在转录水平的表达情况。结果：pcDNA3．1( )-MS真核表达载体构建成功；转染COS-7细胞后，MS在转录水平成功表达。结论：pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒的构建以及MS在COS-7细胞中的成功表达，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1( )-MSDNA疫苗奠定了基础。     

过表达GCNF对HeLa细胞生物学行为的影响

目的:将成功构建的人pcDNA3.1-GCNF真核表达载体瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,观察GCNF基因对HeLa细胞生物学功能的影响。方法:将重组质粒pcDNA3.1-GCNF转染HeLa细胞,通过MTT比色法、基质胶黏附实验和Transwell侵袭试验对转染后HeLa细胞增殖、黏附和侵袭力进行分析。结果:成功获得瞬时转染的pcDNA3.1-GCNF HeLa细胞,转染目的基因组(0.239±0.014)与转染空质粒组(0.198±0.020)及未转染组(0.204±0.012)相比,细胞增殖最快(P<0.05)。转染目的基因后细胞粘附、侵袭力未见明显改变。结论:GCNF基因促进了体外培养的宫颈癌HeLa细胞增殖,但对HeLa细胞粘附、侵袭力没有明显的影响。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

丙型肝炎病毒基因1b型F蛋白对人肝细胞癌细胞株凋亡的影响

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因1b型F蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 构建真核表达重组质粒pcDNA3.0-F-EGFP,并利用Lipofectamine 2000转染人肝细胞癌细胞系HepG2,同时设pcDNA3.0-C-EGFP-HepG2阳性对照、pcDNA3.0-HcpG2为阴性对照及未转染HepG2为空白对照,以Act-D、TNFα诱导四组细胞系发生凋亡,Annexin V-FITC/PI双染检测肿瘤细胞凋亡率,并使用细胞凋亡DNALadder检测,进一步验证HCV 1b型F蛋白在肝细胞凋亡的生物学功能效应.结果 pcDNA3.0-F-EGFP-HepG2细胞系在发生凋亡的时间上比peDNA3.0-C-EGFP-HepG2快,但相对空白质粒转染组及未转染HepG2细胞系有明显延迟,凋亡的发生率也明显低于阴性对照及空白对照细胞系(P<0.001).结论 外源性基因HCV 1b型F的引入及表达,对HepG2细胞的凋亡有抑制作用.     

人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.     

hMAM与人HSP70融合基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(hHSP70)融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,经酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70。将重组载体电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果:成功扩增了人HSP70基因与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

CYP2B1新型自杀基因的真核表达载体的构建和瞬时表达

目的构建一种新型的CYP2B1自杀基因表达载体并检测其在肿瘤细胞中的表达。方法根据gene bank中鼠CYP2B1基因的核苷酸序列设计一对引物，以pc3／2B1为模板进行PCR扩增，将PCR CYP2B1基因产物定向插入到pcDNA3．0中．构建CYP2B1基因表达载体pcDNA3．0／CYP2B1；通过酶切、PCR及测序鉴定重组体。采用脂质体介导法将pcDNA3．0／CYP2B1转染三种肿瘤细胞株，RT—PCR检测CYP2B1基因在各细胞株中的表达。结果目的片段均成功插入相应的载体中，CMV启动子调控下的CYP2B1基因在不同的肿瘤细胞株中实现了表达。结论CMV启动子调控的CYP2B1真核基因表达栽体是肿瘤基因治疗中一种新型、高效的治疗载体、     

肿瘤转移抑制基因nm23-H1在人肺癌细胞的表达及其检测

目的：选择已分离鉴定的人巨细胞肺癌细胞高转移亚型PGBEl，转染肿瘤转移抑制基因nm23-H1，以获得稳定表达nm23-H1基因的人肺癌细胞株。方法：采用亚克隆方法获得pcDNA3．1（-）／nm23-H1真核表达载体并进行双酶切和测序鉴定；应用脂质体转染法将重组质粒转染PGBE1细胞；用G418筛选获得阳性细胞克隆，命名为pcDNA3．1（-）／nm23-H1-PGBE1细胞株；用RT-PCR法半定量检测nm23-H1基因的mRNA表达水平和免疫组化法检测nm23-H1基因的蛋白质表达。结果：真核表达载体pcDNA3．1（-）中正确插入了具有完整阅读框的nm23-H1基因；倒置显微镜下观察到经G418筛选出的稳定转染的PGBE1细胞，形成“小岛”；RT-PCR和免疫组化显示转染的细胞中nm23-H1 mRNA和蛋白质水平表达均增高。结论：建立了稳定表达nm23-H1基因的PGBE1转染细胞株，可用于进一步研究肿瘤转移的分子机制。