1997～2000年我国华东地区HIV-1分离株抗原决定簇氨基酸及其编码核苷酸序列的变化

①目的 对1997-2000年来自华东地区52例HIV-1分离株env基因C2-V3区序列及其V3环顶端主要中和抗原决定簇（PND）氨基酸序列的变化规律进行分析。②方法 以来自同时期上述地区的HIV-1感染者PBMC基因组为模板，采用套式PCR扩增HIV-1env基因C2-V3区片段，产物经克隆，测序。DNA测序结果经DNA Star软件分析HIV-1分离株的基因分型，比较HIV-1膜蛋白V3环顶端PND相关用八肽氨基酸及其编码核苷酸序列的变化特征及出现频率并测其共享序列。③结果 1997-2000年华东地区HIV-1分离株的基因分型有7个，分别属于HIV-1M亚群的A-G亚型。分离株间的基因离散率为1.2%-5.8%。同时发现了env基因双V3区变异的HIV-1自然突变朱（Genbank AF220245)。分析52株PND相关八肽基因序列，其中以第2、3、7位氨基酸及其编码核苷酸的变化最为显著，分别为11.5%，9.6%，9.6%，且3组共享序列相关的八肽亲水性有明显差异。④结论 1997-2000年华东地区HIV-1流行呈现多个型别共同，混合流行的特征，膜蛋白PND的八肽基因序列呈现多样性变化，新的HIV-1膜蛋白双V3区变异株的发现可能与病毒重组，免疫逃避及致病机制有关。     

HIV相关神经认知紊乱患者配对组织来源的HIV-1 env基因特征分析

目的：探讨人类免疫缺陷病毒相关神经认知紊乱（HIV associated neurocognitive disorder, HAND）患者不同组织中HIV-1 env基因的变异进化特征。方法通过国际HIV痴呆量表筛选出HAND患者,获得其血浆及脑脊液来源的HIV-1 env基因核苷酸序列,回顾性分析遗传多样性、氨基酸长度、潜在糖基化位点（PNGS）、辅助受体利用以及特征性氨基酸的特点及组织间差异。结果本研究纳入4例HAND患者共57条HIV-1 env基因V3-C4序列（血浆来源29条,脑脊液来源28条）。脑脊液中的HIV-1遗传多样性高于血浆来源毒株,差异有统计学意义（遗传多样性变异度中位数分别为0.053和0.007,P=0.043）。3例患者脑脊液与血浆来源的毒株均使用CCR5辅助受体,其中2例患者脑脊液（患者D 158 bp,患者F 158 bp）中的HIV-1 V3-C4区氨基酸长度中位数明显长于血浆来源（患者D 156 bp,P=0.017;患者F 157 bp,P=0.003）。脑脊液与血浆中HIV-1 env基因序列相比共有16个氨基酸位点存在明显差异,62.5%（10/16）分布在V4区。结论 HAND患者脑脊液和血浆中的HIV-1 env基因特征存在差异,脑脊液中的HIV-1准种遗传多样性更高。     

人类免疫缺陷病毒1型在垂直传播的个体间病毒基因型和准种的差异性的实验研究

目的通过对人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)在垂直传播的个体间病毒基因型和准种的差异性研究揭示HIV-1在垂直传播过程中的变异规律.方法提取HIV-1感染母亲及其子女共4例的血浆中总RNA,通过逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)获得HIV-1包膜蛋白(env)基因的C2-V5区域片段,纯化后装入T载体,转化至Top10大肠埃希菌内增殖,通过蓝白筛选获得阳性克隆,阳性克隆为模板行PCR,产物进行构象敏感性凝胶电泳(conformation sensitive gel electrophoresis,CSGE)分析,挑选优势准种和劣势准种测序.结果第1对母亲准种复杂性较其子女低,母子之间各准种的核苷酸序列高度同源,均为C亚型;第2对母亲准种复杂性较其子女高,母子之间各准种的核苷酸序列高度同源,母子均为AE亚型.结论HIV-1在垂直传播过程中亚型不发生变化,病毒准种在传播过程中可能具有选择性,进入新宿主后因环境变化而被重新筛选,二者可能共同导致优势/劣势准种的变化.此外,母婴之间准种的复杂性与其宿主的免疫状态有关.     

山东省HIV-1分离株env基因C2-V3区序列测定

①目的 了解山东省1型人类免疫缺陷病毒（HIV－1）的分子流行病学特征。②方法 应用套式聚合酶链反应扩增8例HIV－1前病毒基因组的env基因C2－V3区,扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接,克隆于大肠杆菌中,提取阳性克隆的重组质粒进行测序,用PHYLIP软件分析核苷酸及氨基酸序列。③结果 8株HIV－1毒株V3环顶端的四肽基序均为GPGR,氨基酸变异不显著,各株间基因离散率为1.0%-5.2%,侧翼区碱基的变异频率明显高于V3区,并发现1例毒株出现双V3环现象。④结论 山东省的HIV－1分离株以B亚型HIV－1毒株为主,同时发现的双V3环变异现象,可能是HIV－1毒株逃避宿主免疫系统攻击的一种新模式。     

安徽阜阳既往献血人群HIV-1感染者基因变异特征的研究

目的研究安徽省阜阳市既往献血人群中HIV-1感染者体内病毒流行株的亚型及序列变异特征。方法用巢式聚合酶链反应（nested-PCR）对HIV-1外膜蛋白（env）基因和核心蛋白（gag）基因进行扩增,获得244例患者的env基因V3-C3及其邻近区域序列和245例患者的gag基因区序列,应用MEGA软件进行分析,同时结合患者的疾病进展阶段进行相关性研究。结果系统进化树显示安徽省阜阳市患者体内HIV病毒的env和gag区序列属泰国B亚型;env和gag区的组内基因距离分别为9．11％和3．59％;按CD4细胞绝对计数分层,随CD4细胞绝对计数降低,env、Gag组内基因距离明显升高;随病毒载量水平增加,各组基因距离有增大的趋势,且差异均有统计学意义（P〈0．001）。env区V3环序列13份长期不进展者7份顶端四肽为GPGQ,53份缓慢进展者33份顶端四肽为GPGR,两者间差异有统计学意义（P=0．038）。结论安徽省阜阳市既往献血人群HIV-1感染者体内的病毒流行株是B′亚型。CD4和病毒载量作为疾病进程不同阶段的指标,与病毒变异有相关性,即随CD4降低、病毒载量升高病毒组内基因距离增大。HIV B′亚型V3环顶端四肽随疾病进展由GPGQ为主变为GPGR为主。     

经垂直传播的HIV-1 env区突变准种改变HLA限制性CTL表位的初步研究

目的探索经垂直传播HIV-1env区突变准种改变HLA限制性CTL表位的方式机制。方法从2对垂直传播的HIV-1感染者血清内提取HIV-1核酸,逆转录-套式PCR（RT-nestedPCR）扩增,产物克隆后,挑选阳性克隆行CSGE分析,对优势,劣势准种克隆测序分析,对氨基酸序列中可能的CTL表位进行分析。结果第一对母子：母亲YJ体内存在HIV-1准种env区CTL表位在其54d的女儿WYF体内都存在,而WYF体内存在一株突变准种,其CTL表位在YJ体内HIV-1准种中不存在;第二对母子：母亲CM和其12mo的儿子ZDB体内HIV-1env准种无相同的CTL表位。结论HIV-1在垂直传播后,随着时间的延长,母子之间HIV-1env区突变准种所导致HLA限制性CTL表位发生改变概率增大。     

广西防城港市HIV-1流行株env基因C2V3区序列特征及亚型分析

目的了解近期防城港市HIV-1流行毒株env基因C2V3区亚型及分布特征,为防城港市防治艾滋病工作提供科学依据。方法于2017年10月～2018年4月在防城港市人民医院收集199例定点随访的接受抗病毒治疗的HIV感染者或艾滋病病人(human immunodeficiency virus/acquired immunodeficiency syndrome,HIV/AIDS)的流行病学调查信息和10 ml外周血。从外周血白细胞中提取前病毒DNA,用巢式聚合酶链反应对获得的HIV-1前病毒DNA env C2V3区基因片段进行扩增,并进行DNA测序,获得的DNA序列信息使用Sequencher 5.1、MEGA 5.0软件进行清理和分析。结果本研究共收集199例HIV/AIDS,其人口学特征主要以年龄18～49岁为主,占53.70%;职业以农民和待业为主,分别占42.59%、45.37%;学历以初中及以下为主,占89.81%;民族以汉族为主,占75.93%;传播途径以异性传播为主,占93.52%。成功扩增HIV-1env C2V3区基因108例,其中CRF01_AE(Circulating Recombinant Forms,CRF)亚型103例,CRF BC亚型3例,B、CRF59_01B亚型各1例。发现8种gp120 V3环顶端四肽,其中以GPGQ为主,占50.00%;其次为GPGR和GPGK,分别占22.22%、12.96%。预测辅助受体为CXCR4(chemo-kine receptor 4) 59例,占54.63%;其次是CCR5辅助受体(chemo-kine receptor 5)30例,占27.78%;CXCR4/CCR5辅助受体19例,占17.59%。结论防城港市主要流行HIV-1 CRF01_AE亚型,其流行毒株亚型存在多态性。防城港市HIV-1型CRF01_AE毒株膜区V3环氨基酸顶端四肽存在较高的多态性,使用CXCR4辅助受体的HIV-1毒株比例高于用CCR5辅助受体的毒株。     

HepG2.2.15细胞株中乙型肝炎病毒基因异质性的实验研究

目的以乙型肝炎病毒(HBV)前C/C基因的异质性来探讨在HepG2.2.15细胞体内是否存在HBV准种.方法依据Genebank中HBV ayw亚型全基因序列,选择保守区域设计出特异性多聚酶链反应引物,自HepG2.2.15细胞培养上清液中扩增HBV前C/C基因序列,克隆入pGEM-T Easy载体,挑选15个克隆测序以比较病毒的变异程度.结果测序发现HepG2.2.15细胞HBV前C/C基因存在异质性,碱基序列之间的同源性大于93%,突变类型全部为碱基替换.结论 HepG2.2.15细胞内存在HBV准种.     

来自同一供者的不同HIV-1感染者体内病毒包膜序列变异性分析

目的 调查同一供体来源HIV-1病毒包膜序列变异情况,为进一步进行表型特征、病毒感染能力以及抗病毒免疫研究奠定基础.方法 从6例同一来源HIV-1感染者外周血单个核细胞中提取DNA,设计跨病毒包膜的保守引物,进行PCR扩增,将扩增产物克隆至质粒载体,筛选阳性克隆进行序列测定.采用生物信息学方法对其进行系统发育特征以及编码氨基酸的变异性进行了分析.结果 共获得6个有完整开放读码框的包膜克隆.在6个克隆中,包膜糖蛋白gp120内变异程度大的区域分别为信号肽区、可变区V1/V2区、恒定区C2区内近V3区部分、V4区和V5区.变异包括点突变、氨基酸插入或缺失等.系统树分析发现所获得病毒克隆与中国分离株BCNB03聚集成一束.结论 构建并鉴定了6个HIV-1包膜克隆.同一来源的HIV包膜糖蛋白在不同受者体内发生了较大变异.     

武汉地区戊型肝炎病毒基因型及ORF3基因序列准种特点

目的 研究武汉地区戊型肝炎病毒（HEV）基因型及HEV开放读码框架3（ORF3）基因序列的准种特点。方法 应用逆转录-巢式聚合酶链反应法（RT-nested-PCR）扩增HEV开放读码框架2（ORF2）的部分序列，选取其中25份进行测序，用Clustal X和Mega软件比较武汉地区HEV序列与4个HEV主要代表株序列；并扩增其中2份HEV开放读码框架3（ORF3）的全部序列，克隆入pMD18-TVector，其中1例挑选30个克隆进行DNA测序。结果 25例HEV-ORF2核苷酸同源性为82．61％～98．55％，与Ⅰ型（缅甸株）、Ⅱ型（墨西哥株）、Ⅲ型（美国株）、Ⅳ型（中国／台湾株）核苷酸同源性分别为76．52％～81．74％、70．43％～73．04％、76．52％～81．16％和84．35％～88．70％。来源于同一患者ORF3区全基因组不同克隆之间的碱基序列同源性为97．97％～99．71％，与Ⅳ型（中国／台湾株）核苷酸同源性为89．86％～99．71％。ORF3区可检出点突变、缺失突变、短序列的插入突变。结论 武汉地区散发性戊型肝炎患者以HEV Ⅳ型感染为主。多克隆测序结果提示患者体内HEV呈现准种群共存，HEV-ORF3C末端第2个富含脯氨酸区多有点突变，点突变不影响脯氨酸表达，这些变异的临床意义值得进一步研究。     

HBV准种变异与阿德福韦酯治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎持续疗效的关系

目的观察阿德福韦脂治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者HBV聚合酶（HBV-P）基因序列的准种组成及变异特点,探讨其与抗病毒疗效的关系。方法巢式PCR法扩增HBV-P基因中覆盖B区-E区序列的基因片段,PCR产物纯化后直接测序。用DNASTAR软件的CLUSTALV方法对HBVDNAP基因片段的核苷酸和氨基酸差异、变异类型进行分析,以评估HBV准种复杂性。128例HBeAg阳性慢性乙肝患者予阿德福韦酯10mg,每日一片口服,抗病毒治疗48-96周,疗效评估包括HBVDNA血清学、HBeAg/HBeAb血清学转换及生化学应答。观察阿德福韦酯治疗完全应答组、部分应答组和无应答组病人治疗24周、48周、96周的准种组成特点,并分析其与疗效的关系。结果 128例患者应用阿德福韦酯治疗两年,完全应答23例,部分应答86例,无应答19例。HBVDNA转阴率50.8%（65/128）,HBeAg血清转阴率为21.1%（27/128）,ALT复常率为60.9%（78/128）。7例患者产生了病毒变耐药变异,其中4例为rtn236T变异,2例为rtA181V变异,1例为rtN236T和rtA181V联合变异,耐药率为5.4%。所有患者HBV准种变异在治疗24周、48周、96周时均具有不同程度的改变,无应答组24周与48周时HBV准种复杂性显著高于完全应答组（P〈0.001）。结论慢性乙型肝炎患者血清HBVP区存在准种现象,且该区准种随宿主病程进展可发生动态变化。HBVP区准种变异的复杂性及异质性与慢性乙型肝炎患者阿德福韦酯抗病毒治疗的持续疗效存在负向相关性。     

丙型肝炎病毒感染自然过程中准种的构成变化

目的 观察慢性丙型肝炎患者与自然阴转者外周血HCV准种构成的变化规律。方法 应用基因扩增、分子克隆和测序的方法,对未接受过治疗的4例慢性丙型肝炎患者与4例自然阴转者前后10年血清中丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(C)区与包膜2(E2)区基因片段进行了序列分析及遗传进化关系比较。结果 4例慢性丙型肝炎患者10年前后血清HCV C区和其中2名患者E2区准种群体组内与组间遗传距离没有明显差异。与自然阴转者相比,慢性丙型肝炎患者外周血HCV C区和E2区准种群体组内平均遗传距离较大。在同一患者体内．HCV E2区准种群体组内遗传距离比C区组内遗传距离大,且二者遗传距离大小之间存在相关关系(rs=0．8095)。结论 在丙型肝炎疾病的自然病程中HCV准种构成可长期保持稳定;HCV准种遗传变异度大小可能与丙型肝炎疾病的转归相关。     

慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒DNA序列异质性及准种特点的研究

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)基因异质性来探讨HBV准种群在慢性感染者中的存在状态。方法应用聚合酶链反应（PCR)法,自18例慢性患者血清中分别扩增前C／C基因、P基因逆转录酶区(RT)、HBV全S区、X基因和全基因组序列,克隆人pGEM Teasy质粒,挑选81克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果除外大段缺失突变的克隆,来源于同一患者前C／C区、RT区、全S区、X区和全基因组不同克隆之间的碱基序列同源性分别为98．0％-99．1％、98．7％-99．3％、97．5％-100％、93．0％-98．20A,和96．6％-97．5％。前C区A83点突变、C抗原内部缺失较为常见,缺失突变、终止替换突变、短序列的插入或缺失突变造成的移框突变在各个区域中均可检出,X基因(核心蛋白启动子区,CP)内部缺失突变不仅导致X蛋白羧基端的多样性,而且调控HBeAg的表达。编码截短型表面抗原中蛋白和缺陷病毒基因亦在患者外周血中。结论 多区域测序结果提示HBV慢性患者体内HBV呈现准种群共存,X区(CP区)内存在热点缺失突变区,CP区的变异可能影响前C蛋白的表达,这些变异可能与患者不良预后有关。病毒蛋白的氨基酸的替换突变表现的个体特异性值得进一步研究。     

我国人类免疫缺陷病毒-1主要流行株外膜蛋白基因V3-V4区及其临近区域的特征性氨基酸分析

目的鉴定我国HIV-1主要流行毒株亚型的env,V3-V4区及其临近区域的特征性氨基酸,并阐明其在追踪传染源和研究疫苗中的作用。方法应用nested—PCR对157份来自我国12个省份的HIV-1毒株env区序列进行扩增,并使用ABI377型测序仪测序,然后应用BLAST、GCG、MEGA和VESPA等生物学软件或程序对env基因V3-V4区及其临近区域序列进行基因型鉴定、系统树分析及特征性氨基酸鉴定。结果157份样本包括54份B′(34．40％)、61份B′／C(38．85％)和42份CRF01-AE(26．75％)毒株。系统树分析结果显示,B′亚型毒株序列均与B．CN．RL42十分接近,B′／C毒株主要与97CN54A和97CNGX6F聚成一簇。而CRF01—AE序列与THCM240和97CNGX2F聚在一起．而且分别聚成明显不同的两个亚组。特征性氨基酸分析发现,我国B′和B′／C毒株分别具有8个保守的特征性氨基酸,而且与代表株的相同位点氨基酸基本一致。而CRF01-AE重组毒株具有11个保守的特征性氨基酸,其中有9个位点与97CNGX2F和TH.CM240不一致。包括这9个特征性氨基酸的样本主要来自除云南省以外的其他省份。结论目前流行于我国的B′和B′／C毒株具有单一的共同传染源,而CRF01-AE毒株可能是通过不同输入源或不同传播途径先后从泰国传入我国的。这将对我国艾滋病防治策略的制定和正在进行的疫苗研究具有重要的指导意义。     

HIV-1中国流行株的生物学表型与V3环序列变异相关性初步研究

目的分析我国HIV-1流行株的生物学表型及其与V3环序列变异的相关性。方法采用传统的共培养方法从HIV-1感染者新鲜外周血单个核细胞(PBMC)中分离病毒并在MT-2细胞上测定分离株的融合诱导性,用表达CD4和趋化因子受体CCR5或CXCR4的GHOST(3)测定毒株的辅助受体利用情况,用巢式一聚合酶链反应(nest—PCR)扩增V3环及两侧区序列并对其序列进行测定,用GCG软件分析氨基酸序列。结果在所分析的5个原代毒株中,LTG0213和LTG0214为合胞体诱导型(SI),利用CXCR4辅助受体;XJN0021、XJN0091和SHXDC0041为非合胞体诱导型(NSI),利用CCR5辅助受体。X4／SI病毒和RS／NSI病毒在V3环氨基酸序列方面,存在明显的区别。CCR5表型中国株第8、11、18及第25位氨基酸的共同基序为：8-TXXS／GXXXXXXR／QXXXXXXE／D-25,CXCR4表型株在这些位置出现碱性氨基酸取代(第25位除外),引进正电荷。结论HIV-1中国流行株的生物学表型与V3环序列变异密切相关,V3环上第8、11、18及第25位积累碱性氨基酸(或由酸性氨基酸转变为中性氨基酸),可以使病毒由NSI／R5表型转变为SI／X4表型,可以根据V3环氨基酸序列预测病毒的生物学表型。