微小RNA-34a调控高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡的初步研究

目的探讨微小RNA-34a(miR-34a)对高糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响。方法将培养的H9c2心肌细胞随机分为3组:正常组(葡萄糖浓度5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度33mmol/L),抑制剂组(miR-34a抑制剂浓度50nmol/L+葡萄糖33mmol/L)。采用定量PCR检测miR-34a和凋亡相关基因Bcl-2基因表达的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2表达的变化;采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果与正常组比较,高糖组心肌H9c2细胞凋亡率明显升高(P<0.05),H9c2细胞miR-34a表达显著上调(P<0.05),H9c2细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达减少(P<0.05)。与高糖组比较,抑制剂组H9c2细胞凋亡明显下降(P<0.05),H9c2细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论 miR-34a能调控高糖所致的H9c2心肌细胞凋亡,可能是通过直接抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达而实现的。     

EMRE对高糖高脂诱导心肌细胞凋亡的影响

目的 研究EMRE分子在高糖/高脂（high glucose and high fat,HGHF）培养的大鼠胚胎心肌细胞H9C2中的表达变化及其在HGHF诱导的心肌细胞凋亡中的作用。方法 H9C2细胞培养分为4组:即正常+siCtrl组（培养基中含5 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L甘露醇和siCtrl,培养24 h）、正常+si-EMRE组（培养基中含5 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L甘露醇和si-EMRE,培养24 h）、HGHF+siCtrl组（培养基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L软脂酸钠和siCtrl,培养24 h）及HGHF+si-EMRE组（培养基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L软脂酸钠和si-EMRE,培养24 h）。用qRT-PCR及Western blot检测EMRE在各组细胞中的表达;用流式细胞术（FCM）分析各组心肌细胞的凋亡;用Western blot检测caspase3与caspase9表达;用荧光探针DCFH-DA检测各组心肌细胞内ROS水平。结果 HGHF诱导心肌细胞EMRE表达升高（mRNA及蛋白水平）;EMRE促进了HGHF诱导的心肌细胞凋亡及ROS的产生;用si-RNA干涉EMRE表达后,由HGHF诱导的细胞凋亡及ROS产生明显减少。结论 EMRE在HGHF诱导的心肌细胞凋亡中发挥重要的促进作用。     

高糖高脂对培养成年大鼠心肌细胞损伤观察及机制初探

目的建立成年大鼠心肌细胞培养模型,观察给予高糖、高脂刺激后是否发生心肌细胞损伤和凋亡,并分析其可能机制。方法将分离所得成年大鼠心肌细胞接种入培养皿后随机分为2组进行培养。正常对照组：以M199培养基（Media199）加入5mmol／L葡萄糖与20mmol／L甘露醇作为正常对照培养基培养细胞;高糖高脂组：以M199加入高糖（25mmol／L葡萄糖）高脂（600μmol／L软脂酸）作为培养基培养模拟糖尿病。培养48h后,分别收集培养基上清与细胞,进行心肌损伤和凋亡指标测定。结果高糖高脂组乳酸脱氢酶（LDH）,细胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9活性显著升高,与正常对照组比较,差异均具有统计学意义（P均〈0．01）。结论在培养的成年大鼠心肌细胞,高糖、高脂可引起心肌细胞损伤和凋亡,这种凋亡与easpase-8和caspase-9依赖的凋亡途径有关。     

瘦素-p38MAPK通路介导高糖对H9c2心肌细胞的损伤

目的 探讨瘦素-p38丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路在高糖损伤H9c2心肌细胞中的作用。方法 应用35 mmol/L葡萄糖处理H9c2心肌细胞以建立高糖损伤细胞模型。应用细胞计数试剂盒检测细胞存活率;双氯荧光素染色荧光显微镜照相测定胞内活性氧水平;Hoechst 33258核染色检测凋亡细胞形态与数量的改变;罗丹明123染色荧光显微镜照相测定线粒体膜电位;Western blot检测瘦素和p38MAPK蛋白的表达水平。结果 35 mmol/L葡萄糖处理H9c2心肌细胞明显促进瘦素的表达。在高糖处理H9c2心肌细胞前,应用50 μg/L瘦素拮抗剂预处理24 h明显抑制高糖对磷酸化p38MAPK表达的上调作用。瘦素拮抗剂预处理24 h或p38MAPK抑制剂（SB203580）预处理60 min均能抑制高糖对H9c2心肌细胞的损伤作用,使细胞存活率升高,凋亡细胞数量减少,活性氧生成及线粒体膜电位丢失减小。结论 瘦素-p38MAPK通路参与高糖对心肌细胞的损伤。     

葡萄糖/葡萄糖氧化酶诱导H9c2心肌细胞凋亡模型的建立

目的 研究不同浓度高糖（glucose,G）/葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GO）对H9c2细胞凋亡的影响,以确定建立H9c2细胞因糖自氧化所致凋亡模型的合适浓度.方法 在含33 mmol/L葡萄糖的高糖培养液中以不同浓度的GO干预H9c2细胞12h,MTT比色法检测H9c2细胞的存活率;光学显微镜下观察H9c2细胞形态学;AnnexinV/PI结合流式细胞仪检测凋亡率;2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）探针检测细胞内活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）水平.结果 （1）随G/GO浓度增加,H9c2细胞的存活率逐渐降低,其中1.6 mU/mL、2 mU/mL、2.4 mU/mL和2.8 mU/mL组存活率显著低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中G（33 mmol/L）/GO（2 mU/mL）的存活率为49.3％±6.7％.（2）随G/GO浓度增加,H9c2细胞的细胞凋亡率逐渐升高,细胞呈现典型的凋亡特征,其中1.6 m U/mL、2 mU/mL、2.4 mU/mL和2.8 mU/mL凋亡率显著高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中G（33 mmol/L）/GO（2 mU/mL）的细胞凋亡率为44.56％±3.02％.（3）G（33 mmol/L）/GO（2 mU/mL）作用H9c2细胞12h时,ROS含量显著高于对照组,差异有统计学意义（荧光强度：47.70％±2.09％ vs.17.59％±0.75％,P＜0.05）.结论 G/GO引起的H9c2细胞氧化应激所致的凋亡有剂量依赖性,G（33 mmol/L）/GO（2 mU/mL）是建立H9c2心肌细胞凋亡模型的合适浓度.     

线粒体乙醛脱氢酶2通过提高细胞自噬改善高糖导致的心肌损伤

目的:明确乙醛脱氢酶2(ALDH2)对高糖状态下H9c2大鼠心肌细胞自噬表达水平的影响及其对细胞存活的作用。方法:以33 mmol/L葡萄糖培养大鼠H9c2心肌细胞72 h。经ALDH2激动剂Alda-1及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预后,用Western blot检测ALDH2、自噬基因相关蛋白5(ATG5)、微管相关蛋白质1轻链3(LC3)的表达水平。用免疫荧光法检测细胞内自噬体的数量,CCK-8法检测细胞的存活率,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:与对照组相比,高糖导致心肌细胞自噬相关蛋白表达水平下降,减少自噬体的数量,降低细胞存活率,增加细胞凋亡;而ALDH2能提高高糖状态下自噬相关蛋白表达水平,增加自噬体的数量,增强细胞的存活率,减少细胞凋亡;应用自噬抑制剂3-MA处置后,可减弱ALDH2的上述作用。结论:ALDH2能够提高高糖状态下心肌细胞的自噬表达水平,提高细胞的存活率,减少细胞凋亡。     

高葡萄糖在正常氧及缺氧条件下对乳鼠心肌细胞存活与凋亡的不同影响

目的探讨高葡萄糖在正常氧及缺氧条件下对乳鼠心肌细胞存活与凋亡的影响。方法原代培养乳鼠心肌细胞,予33mmol/L葡萄糖培养基分别在正常氧及缺氧培养条件培养,同时以5.5mmol/L葡萄糖培养基培养作为对照,氯化钴模拟缺氧环境,台盼兰染色检测细胞存活力,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术和AnnexinV-PI双染法流式细胞仪检测心肌细胞凋亡。结果正常氧条件下,33mmol/L葡萄糖时较5.5mmol/L葡萄糖时乳鼠心肌细胞存活率低(P<0.01),细胞凋亡率高(P<0.01);缺氧条件下,与5.5mmol/L葡萄糖浓度时比较,33mmol/L葡萄糖浓度时,心肌细胞存活率增高(P<0.01),凋亡率降低(P<0.05)。结论在正常氧条件下,高葡萄糖诱导乳鼠心肌细胞凋亡。氯化钴模拟缺氧条件下,高葡萄糖在乳鼠心肌细胞凋亡损伤中发挥保护作用。     

N-乙酰半胱氨酸保护心肌细胞对抗化学性低氧诱导的内质网应激反应

目的探讨活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸能否保护H9c2心肌细胞对抗化学性低氧引起的内质网应激。方法应用化学性低氧模拟物氯化钴处理H9c2心肌细胞,建立化学性低氧损伤心肌细胞的实验模型。在氯化钴处理H9c2心肌细胞前60 min把N-乙酰半胱氨酸加入培养基中,作为预处理。应用CCK-8比色法检测细胞存活率;Hoechst33258染色荧光显微镜照相术检测凋亡心肌细胞的形态学改变;双氯荧光素染色荧光显微镜照相检测细胞内活性氧水平;免疫印迹法检测内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78的表达。结果在100～2 000μmol/L浓度范围内,氯化钴处理H9c2心肌细胞24 h,呈剂量依赖性地抑制细胞存活率。在12～48 h时间范围内,800μmol/L氯化钴处理H9c2心肌细胞呈时间依赖性地抑制细胞存活率。在氯化钴处理H9c2心肌细胞前60 min,应用2 000μmol/L的N-乙酰半胱氨酸不仅能抑制氯化钴对活性氧生成的促进作用,也能明显的抑制氯化钴诱导的细胞凋亡。不同浓度的氯化钴处理H9c2心肌细胞24 h,可使葡萄糖调节蛋白78表达增多,其中800μmol/L的氯化钴处理H9c2心肌细胞24 h时,葡萄糖调节蛋白78表达...     

尾加压素Ⅱ在高糖诱导心肌细胞氧化应激、内质网应激中的作用及机制研究

目的:研究高糖刺激对心肌细胞中尾加压素Ⅱ及其受体表达的影响,并观察高糖刺激下尾加压素Ⅱ对心肌细胞氧化应激/内质网应激通路及其相关信号通路的影响.方法:本实验将原代培养的Wistar大鼠乳鼠心肌细胞培养36 h后,随机分为低糖组(5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、高渗组(5 mmol/L葡萄糖...     

神经调节蛋白1对高糖损伤的心肌细胞的保护作用及其机制

目的:研究神经调节蛋白1(NRG-1)对高糖损伤的心肌细胞的保护作用及其机制。方法:培养大鼠胚胎期心脏组织H9c2心肌细胞,进行分组处理。分别为对照组(不加任何诱导药物处理24 h)、高糖作用组(HG组,用含终浓度33 mmol/L的葡萄糖培养基培养心肌细胞处理24 h)、不同浓度NRG-1作用组(分别在含有33 mmol/L高浓度葡萄糖的培养基中同时加入10、50、250 nmol/L的NRG-1培养心肌细胞处理24 h,设定为N1、N2、N3组)。细胞计数(CCK-8)方法检测各组心肌细胞存活率;流式细胞术检测各组心肌细胞胞内活性氧(ROS)水平和细胞凋亡情况;同时测定各组心肌细胞中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量;蛋白免疫印迹(Western-blot)方法检测各组心肌细胞中NRG-1的受体,即表皮生长因子受体-2(Erb B2)和表皮生长因子受体-4(Erb B4)的表达;原位缺口末端标记法(Tunel)染色检测2型糖尿病心肌病模型大鼠经NRG-1处理后的心肌细胞凋亡。结果:N1组至N3组心肌细胞的存活率由(63.33±3.56)%上升至(85.88±4.55)%;心肌细胞中ROS含量由(33.57±4.23)%下降至(15.88±4.55)%;细胞凋亡率由(36.44±4.86)%下降至(14.77±4.21)%;心肌细胞中Erb B2和Erb B4受体表达随之分别由(0.26±0.04)、(0.39±0.03)上升至(0.84±0.03)、(0.72±0.04),与HG组比差异均有统计学意义(P0.05);CK、LDH酶活力和MDA含量逐渐下降而SOD活性逐渐回升,与HG组比差异均有统计学意义(P0.05)。NRG-1作用的2型糖尿病心肌病模型大鼠心肌组织细胞凋亡也显著下降。结论:NRG-1能够提升高糖作用下心肌细胞存活率,减轻高糖对心肌细胞氧化应激损伤和细胞凋亡,可能通过与心肌细胞中Erb B2/Erb B4受体结合发挥作用。