人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗阿尔茨海默病APP+转基因鼠的

目的：评估人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗阿尔茨海默病APP转基因鼠的有效性和安全性。 方法：饲养转基因APP+胎鼠,定期合笼,利用PCR技术快速鉴定转基因鼠,以刚果红染色法观察脑组织切片中的β-淀粉样蛋白沉积。严格无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜,体外分离培养羊膜间充质干细胞,至第3代经尾静脉移植。Morris水迷宫测试移植前后小鼠学习、记忆能力。移植当天开始称重,每隔三天一次,持续三周。移植后解剖小鼠,收集全血并分离血清,进行心、肝、肾功能的血液生化和12项肿瘤标记物检测,对该细胞治疗的安全性作综合评价。 结果：移植后小鼠学习、记忆能力明显增强。移植组动物的体重增长趋势与对照组相比无明显差异（P＞0.05）,未见肿瘤和死亡发生。血液生化和12项肿瘤标记物各指标无明显差异（P＞0.05）。 结论：人羊膜间充质干细胞尾静脉移植治疗阿尔茨海默氏症小鼠明显促进小鼠学习、记忆能力,未见致死致瘤现象发生,心、肝、肾功能未受影响。利用该种干细胞移植治疗阿尔茨海默氏病是安全可行的。     

人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗转基因APP+小鼠的机制***◆

背景：研究发现APP基因与阿尔茨海默病发病密切相关。课题组前期实验发现人羊膜间充质干细胞静脉移植可以促进阿尔茨海默病APP+转基因小鼠的学习,记忆能力改善。 目的：探讨人羊膜间充质干细胞尾静脉移植后,能否归巢到小鼠脑组织中,并分化为相关的中枢神经细胞,治疗阿尔茨海默病。 方法：无菌条件下体外分离培养人羊膜间充质干细胞,传至第3代将细胞浓度调整为1×109 L-1,经尾静脉注入0.5 mL至细胞移植组转APP+基因小鼠体内;对照组经尾静脉注入同体积的生理盐水;正常组转APP-基因小鼠不给予任何干预措施。采用免疫组化方法检测、测定Brdu标记的人第3代羊膜间充质干细胞在小鼠脑组织中的表达,各组小鼠脑组织中GFAP、Nestin和NSE的表达。 结果与结论：光镜下观察可见,移植组小鼠脑组织中大部分细胞核被染成蓝色,但有一些细胞核被染成棕色或褐色,Brdu呈阳性。与对照组相比,移植组小鼠脑组织中的GFAP增加了近4倍,表达显著增加,甚至超过正常组的表达(P < 0.05);Nestin的表达则显著升高,增加了近10%,但是还比正常组低了近20%(P < 0.05)。NSE的表达降低了近1/3,但仍高于正常组(P < 0.05)。表明人羊膜间充质干细胞尾静脉移植治疗阿尔茨海默病可能是通过羊膜间充质干细胞归巢到转基因APP+小鼠脑组织中,并分化成中枢神经细胞的途径实现的。 关键词：人羊膜间充质干细胞;转基因APP+小鼠;尾静脉移植;胶质纤维蛋白;巢蛋白;神经元特异性烯醇化酶     

人羊膜间充质干细胞联合神经生长因子及纤维蛋白胶移植治疗大鼠脑损伤

背景：以往对间充质干细胞分化的报道多为体外培养，甚少涉及宿主体内间充质干细胞的分化及辅助因子对其分化的影响。 目的：探讨人羊膜间充质干细胞移植对脑损伤大鼠行为学和空间学习记忆能力的影响，以及神经生长因子、纤维蛋白胶在人羊膜间充质干细胞移植中的作用。 设计、时间及地点：细胞学体内对照观察，于2006-07/2007-01在郑州大学医学院完成。 材料：正常足月剖腹产胎儿的胎盘由郑州大学第一附属医院妇产科提供。Wistar大鼠90只，随机分为5组：假手术组、模型对照组、细胞移植组、细胞+神经生长因子组、细胞+纤维蛋白胶组，18只/组。 方法：无菌条件下钝性分离胎盘脐带面的羊膜，经胰酶消化制成单细胞悬液，贴壁法纯化扩增，传至第3代的人羊膜间充质干细胞备用。假手术组只开颅钻孔不进行硬膜外撞击，其余4组大鼠均采用自由落体硬膜外撞击法建立脑损伤模型。造模1 d后，模型对照组在损伤区分点注射生理盐水40 μL；细胞移植组注射含1×107个人羊膜间充质干细胞的等量生理盐水；细胞+神经生长因子组在细胞移植组基础上于造模后连续2周每日腹腔注射0.5 μg神经生长因子；细胞+纤维蛋白胶组注射人羊膜间充质干细胞与纤维蛋白胶混合液40 μL；假手术组不行细胞移植。 主要观察指标：行为学评分，Morris水迷宫检测潜伏期，脑组织切片免疫组化染色检测神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果：移植后7 d，与模型对照组比较，细胞移植组、细胞+神经生长因子组、细胞+纤维蛋白胶组行为学评分均明显升高，但细胞移植组升高幅度明显低于后2组（F=155.322，P < 0.05）。移植后3周，与模型对照组比较，细胞移植组、细胞+神经生长因子组、细胞+纤维蛋白胶组潜伏期均明显缩短，但细胞移植组缩短幅度明显小于后2组（F=22.678，P < 0.05）。移植后4周，人羊膜间充质干细胞能够在大鼠损伤脑组织内分化，与神经生长因子、纤维蛋白胶混合移植可提高神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的阳性表达率（F=705.406，F=424.884，P < 0.05）。 结论：人羊膜间充质干细胞可改善脑损伤大鼠行为能力及空间学习记忆能力，分化后能表达神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白，神经生长因子与纤维蛋白胶均可增强细胞移植治疗效果。     

APP/PS1阿尔茨海默病转基因动物模型前联合异常改变

背景: 阿尔茨海默病研究大多主要集中在淀粉样β蛋白和神经元死亡之间的关系,但是对白质损害研究却鲜有报道。 目的：观察APP/PS1阿尔茨海默病转基因动物模型前联合病理改变特点。 设计、时间及地点：以组织学改变为依据,分组对照观察,于2007-09/2008-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科实验室完成。 材料：雌性转基因APP/PS1小鼠(表达人突变的PS1(M146L)基因和APP (KM670/ 671NL,V717I)基因, 对照组老鼠选用的是没有淀粉样蛋白沉积的雌性PS1小鼠。分为年轻组(2月龄,包括8 只APP/PS1,7只PS1)和老年组(24月龄,包括6 只APP/ PS1,7只PS1)。 方法：利用刚果红和免疫组织化学方法观测该AD转基因模型脑内淀粉样改变;采用氯化金髓鞘染色方法和轴突免疫组织化学染色,利用吸光度方法对前联合轴突密度和髓鞘化程度的染色进行相对吸光度定量分析。 主要观察指标：①细胞内和细胞外淀粉样β蛋白的染色。②在冠状位前联合的平均面积大小测量。③前联合处轴突密度和髓鞘化程度定量相对吸光度值。 结果：在老年组APP/PS1小鼠,大量的刚果红阳性染色出现在皮质,海马以及丘脑, 前联合也出现阳性染色;细胞内淀粉样β蛋白仅出现在年轻组APP/PS1的皮质结构中。在老年组PS1组小鼠,前联合的表面积大小比年轻组PS1和老年组APP/PS1组小鼠都有显著的增长。老年组包括APP/PS1和PS1组轴突的染色都有显著的下降,髓鞘化程度比年轻组有增高趋势。不同表型分析显示,轴突密度和髓鞘化程度在年轻组APP/PS1和PS1组相当;老年APP/PS1组轴突密度比PS1组有显著的下降,老年组APP/PS1小鼠髓鞘化程度与PS1无显著差别。 结论：随着年龄的增长,APP/PS1阿尔茨海默病转基因小鼠模型前联合存在着轴突的丢失,髓鞘相对保持完整。淀粉样β蛋白对轴突有直接的毒性作用。     

五味子酮对APP转基因鼠神经干细胞分化中Tau蛋白过磷酸化水平的影响

背景：华中五味子酮有强的抗氧化活性,可高效清除羟自由基和超氧阴离子,对处于活性氧应激状态下的细胞具有保护作用。神经元内神经原纤维缠结主要是由异常磷酸化的Tau蛋白组成,与阿尔茨海默病的严重程度呈正相关。 目的：探讨五味子酮在APP转基因小鼠神经干细胞诱导分化成神经细胞的过程中对Tau蛋白磷酸化的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2006-07/2008-10在郑州大学医学实验中心完成。 材料：自中国协和医科大学遗传动物中心购得APP基因突变小鼠30只,五味子酮由河南省中医研究院药物所提供。 方法：剪取新生APP转基因小鼠尾尖,常规提取DNA,采用PCR法检测动物是否携带有APP基因,APP转基因阳性鼠记为“APP+”,APP转基因阴性鼠记为“APP-”。分别取APP+鼠和APP-鼠海马部位脑组织,体外分离培养神经干细胞,并将纯化的神经干细胞向神经细胞方向诱导分化。将从APP+鼠来源的细胞分为五味子酮组、APP+细胞对照组,将APP-鼠来源的细胞设为APP-细胞对照组。五味子酮组向细胞培养液中加入终浓度为50 μmol/L的五味子酮溶液,余2组加入相同容积的PBS,培养24 h。 主要观察指标：免疫荧光化学和免疫印迹分析测定APP+、APP-细胞Tau蛋白在262、396位点的磷酸化水平。 结果：与APP+细胞对照组比较,五味子酮组细胞荧光强度减轻,Tau[Ps262]、Tau[Ps396]的磷酸化水平均降低,且Tau[Ps396]位点的磷酸化水平降低尤为明显。APP-细胞对照组Tau[Ps262]、Tau[Ps396]磷酸化水平均较低。 结论：在APP转基因小鼠神经干细胞诱导分化过程中,五味子酮可以明显降低Tau蛋白在396、262位点的磷酸化水平,减轻神经元损伤,但其磷酸化程度并未达到阴性细胞水平。     

β-淀粉样蛋白诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中Tau蛋白的过度磷酸化★

背景：大多数学者认为β-淀粉样蛋白是阿尔茨海默病发病的始动因素，而Tau蛋白过度磷酸化可能是阿尔茨海默病最重要的分子病理变化之一。 目的：观察β-淀粉样蛋白25~35对大鼠骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞Tau蛋白磷酸化的影响。 方法：体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，将第4代骨髓间充质干细胞分为两组：实验组中加入预诱导培养基和20 μmol/L β-淀粉样蛋白25~35，24 h后用含2%二甲基亚砜和200 μmol/L丁羟茴醚的DMEM诱导其向神经细胞分化，5 h后收取细胞。对照组诱导方法同实验组，但在诱导过程中未加入β-淀粉样蛋白25~35。 结果与结论：光镜下可见纺锤状的骨髓间充质干细胞诱导后出现长突起，呈现神经细胞样形态，但实验组突起数量和长度均少于对照组；免疫细胞化学法检测两组诱导后的神经元样细胞为神经元特异性烯醇化酶阳性；免疫蛋白印记法证明实验组的GSK-3β、Tau[pSer262]和Tau[pSer396]表达均显著高于对照组。结果提示β-淀粉样蛋白25~35能够通过GSK-3β途径诱导骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞Tau蛋白过度磷酸化。     

体外分离培养小鼠肺间充质干细胞的生物学特性及其对肺损伤干预效果

背景：肺脏含有多种内源性干细胞，分别为来源于内胚层或中胚层的前体细胞，阐明肺组织间充质干细胞的特性有助于了解其在肺损伤中的生物学作用。 目的：观察体外分离培养的小鼠肺组织间充质干细胞生长状态、表面标志、分化功能等生物学特性，探讨其对肺损伤鼠的干预效果。 设计、时间及地点：细胞学体外观察与随机对照动物体内实验，于2005-10/2007-08在解放军军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学实验室完成。 材料：清洁级三四周龄C57BL/6雄鼠，用于分离培养肺组织间充质干细胞；清洁级6~8周龄C57BL/6雌鼠20只，分为细胞移植组、模型对照组，10只/组。 方法：分离雄鼠肺组织，Ⅱ型胶原酶消化后，Ficoll法离心，收集界面层细胞，贴壁法分离培养肺组织间充质干细胞，当细胞接近70%~80%汇合时消化传代。细胞移植组、模型对照组小鼠按20 mg/kg腔注射马利兰抑制骨髓干细胞的迁移后，均建立博莱霉素诱导的肺纤维化模型，造模后细胞移植组尾静脉注入5×105个肺间充质干细胞，模型对照组气管内注射100 μL PBS。14 d后取材，制备肺组织石蜡切片。 主要观察指标：体外培养的肺组织间充质干细胞的生长状态、免疫表型、基因表达、分化潜能、集落形成能力以及静脉移植减轻肺损伤效果。 结果：小鼠肺组织来源的间充质干细胞为成纤维样细胞，在体外能够长期培养和快速扩增；其细胞免疫表型为Sca-1+，CD44+，CD29+，CD105+，CD54+，CD34-，CD45-，CD11b-，c-kit-，CD31-；不表达肺泡上皮细胞标志表面活性蛋白C、水通道蛋白5、clara细胞分泌蛋白，胚胎干细胞标志Oct-4和Nanog基因在培养扩增的细胞中持续表达；能够被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和表达表面活性蛋白C的肺泡2型上皮样细胞；集落形成率约3%；经静脉输注后，细胞移植组肺损伤和纤维化程度较模型对照组减轻，Masson染色显示只有少量血管周围呈阳性，且经骨髓抑制处理后已接近正常肺组织。 结论：体外培养的小鼠肺间充质干细胞能够快速扩增，可向脂肪细胞、成骨细胞和肺泡上皮细胞方向分化；静脉移植后有助于肺组织修复、减轻肺损伤和纤维化程度，且骨髓抑制不影响肺间充质干细胞的保护作用。     

加兰他敏对APP/PS1转基因小鼠海马区星形胶质细活化及C/EBPβ表达的影响

目的研究加兰他敏对APP/PS1转基因小鼠海马区星形胶质细胞活化、C/EBPβ表达及行为学的影响。方法选取10月龄雄性APP/PS1转基因小鼠20只,随机分为模型对照组(10只)和治疗组(10只),同月龄、同背景的C57BL/6野生型雄性小鼠10只作为正常对照组。治疗组皮下注射加兰他敏溶液5mg/kg,2次/d,连续治疗8周,正常对照组和模型对照组给予皮下注射等量生理盐水。应用Morris水迷宫实验于干预治疗8周后开始测定各组小鼠空间学习记忆能力,连续7d,采用免疫组织化学、免疫荧光及Western-blot方法观察各组小鼠海马区星形胶质细胞活化及C/EBPβ表达水平。结果与正常对照组相比,模型对照组和治疗组小鼠Morris检测第5、6天平均逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少(P0.05,P0.05),而治疗组其逃避潜伏期较模型对照组缩短(P0.05),穿越平台次数增多(P0.05);同时治疗组小鼠星形胶质细胞活化被明显抑制,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的阳性表达面积〔(5.003±0.823)%〕及C/EBPβ的表达量(87.711±14.622)较模型对照组〔(7.116±1.040)%,119.920±16.901〕明显减少(P0.05,P0.05)。结论加兰他敏改善APP/PS1转基因AD小鼠的学习记忆能力可能与其抑制星形胶质细胞的活化及C/EBPβ的表达有关。     

脐血间充质干细胞外泌体对APP/PS1小鼠海马神经元的保护作用及其机制

目的 研究脐血间充质干细胞外泌体(MSC-EXO)对阿尔茨海默病(AD)小鼠海马神经元的保护作用及其机制.方法 将20只APP/PS1小鼠随机分为AD+ saline组和AD+ EXO组,每组10只;将10只野生型C57小鼠作为正常对照组.AD+ EXO组小鼠经尾静脉注射EXO悬液,AD+ saline组和对照组小鼠注...     

异种脐带间充质干细胞静脉应用的安全性

背景：人脐带间充质干细胞因其来源丰富,具有较强增殖分化能力,不涉及伦理道德问题,有望成为组织修复与再生工程的首选细胞。但是,对人脐带间充质干细胞异种静脉移植的安全性研究较少。 目的：观察Wistar大鼠静脉输注人脐带间充质干细胞后的安全性。 方法：SPF级Wistar大鼠30只,随机分为空白对照组、阴性对照组、细胞移植组,每组10只,雌雄各半。体外分离扩增人脐带间充质干细胞,细胞移植组大鼠尾静脉一次注射5×106间充质干细胞,注射体积为1 mL;阴性对照组大鼠尾静脉一次注射相同体积50 g/L葡萄糖注射液。注射后每天观察大鼠一般症状,14 d后解剖动物,进行血常规、血生化和脏器病理学检查及脏器质量测定。 结果与结论：细胞移植组大鼠血常规、血生化与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。细胞移植组大鼠脏器组织病理学观察与对照组大鼠无明显光镜下形态学差别。结果提示Wistar大鼠一次性静脉移植人脐带间充质干细胞是安全可行的,人脐带间充质干细胞异种移植对受者无不良影响。