抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用

探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对人肝癌细胞系HepG2致凋亡的作用。常规培养人肝癌细胞系HepG2,流式细胞术定量分析检测HepG2细胞表面DR5的表达。MTT法检测mDRA-6的细胞毒性作用;Annexin V-FITC/PI双色标记HepG2细胞,流式细胞术定量分析检测细胞凋亡率;在荧光显微镜下观察mDRA-6对HepG2细胞形态变化的影响。结果显示,HepG2细胞表面有DR5表达,其平均表达百分率为40%。MTT法检测显示在40 mg/L mDRA-6浓度下可杀伤42%的细胞;Hoechst33258染色证实杀伤作用是通过细胞凋亡实现的经流式细胞术检测显示,3 mg/L的mDRA-6作用HepG2细胞6 h导致24.61%的细胞发生凋亡;在荧光显微镜下可观察到mDRA-6诱导导致HepG2细胞呈现典型细胞凋亡的形态特征。上述结果表明,mDRA-6能够诱导人肝癌细胞系HepG2凋亡。     

抗人DR5单克隆抗体对白血病U937细胞凋亡的作用

目的：研究鼠抗人DR5单克隆抗体（mDRA-6）对白血病细胞U937的凋亡诱导作用。方法：光镜下观察mDRA。6作用后U937细胞的形态变化；流式细胞术检测15937细胞表面DR5表达率；MTT法检测mDRA-6对U937细胞生长的影响；AnnexinV—FITC／PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率；琼脂糖凝胶电泳检测U937细胞DNA的片段化降解；JC-1单染流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位改变。结果：mDRA-6作用U937细胞后呈现典型的细胞凋亡特征；MTT法检测显示mDRA-6作用U937细胞24小时死亡率为61．09％，并呈时间、浓度依赖性；流式细胞仪检测显示10mg/L的mDRA-6作用4小时，U937细胞凋亡率为79．12％；琼脂糖凝胶电泳显示DNA呈现明显梯状带型；mDRA-6作用U937细胞后线粒体膜电位明显下降。结论：mDRA-6能够诱导白血病U937细胞凋亡，是具有诱导细胞凋亡活性的功能性抗体。     

肝细胞生长因子拮抗放线菌素D诱导的肝细胞凋亡及机制探讨

目的： 探讨肝细胞生长因子（HGF）对放线菌素D (ActD)诱导HL7702肝细胞凋亡的拮抗作用及可能机制。 方法： 本实验采用HL7702正常人肝细胞株，MTT法检测ActD对肝细胞存活力的影响；Hoechst33342进行凋亡形态学染色；DNA凝胶电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡数量；Western blotting方法检测细胞总Akt及磷酸化Akt蛋白的表达。 结果： ActD可以诱导HL7702肝细胞凋亡，其浓度在0.25-8 mg/L范围内呈现剂量效应关系；PI3K特异性抑制剂wortmannin能够增强ActD诱导的肝细胞凋亡作用；肝细胞生长因子(HGF)对ActD诱导的肝细胞凋亡有拮抗作用，在一定剂量范围内呈现剂量效应关系；并且HGF能够激活PI3K/Akt信号转导途径；进一步用wortmannin阻断PI3K/Akt信号途径后，HGF的拮抗凋亡作用被抑制。 结论： 一定剂量的ActD可以诱导肝细胞凋亡；wortmannin能够增强ActD诱导肝细胞凋亡的作用；HGF对ActD诱导的这种细胞凋亡有明显的拮抗作用，并且HGF的抗凋亡作用与其激活细胞内PI3K/Akt信号转导通路有关。     

柚皮素增强抗人DR5单抗对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用

探讨柚皮素增强抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用及可能机制。MTT法检测柚皮素及抗人DR5单抗对人肝癌细胞系HepG2的生长抑制作用;Annexin V/PI双染分析细胞凋亡;蛋白免疫印记检测Caspase 8的表达;流式细胞术检测HepG2细胞表面DR5的表达。结果显示,10 mg/L的mDRA-6作用于HepG2细胞12 h后细胞增殖抑制率为39%;10 mg/L的mDRA-6分别与200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L柚皮素共同作用于HepG2细胞后细胞增殖抑制率分别增加至58%、79%、85%;Annexin V/PI双染及流式细胞术检测结果表明,2 mg/L的mDRA-6作用细胞12 h后细胞凋亡率为16%,2 mg/L的mDRA-6和400μmol/L柚皮素共同作用于HepG2细胞12 h后细胞凋亡率增加为63%;mDRA-6和柚皮素共同作用于HepG2细胞后,蛋白免疫印记结果显示Caspase 8的激活片段明显显现,流式细胞术检测HepG2细胞表面DR5的表达,其基础表达率为49%,400μmol/L柚皮素作用于HepG2细胞12后,HepG2细胞表面DR5的表达率增加为81%。实验显示柚皮素可增强抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用,其可能机制为柚皮素诱导HepG2细胞表面DR5受体表达上调所致。     

抗人DR5单抗致白血病U937细胞凋亡的作用机制

目的探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对白血病细胞U937凋亡诱导作用及机制。方法 MTT法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测mDRA-6对U937细胞的生长抑制及凋亡诱导作用,Western blotting检测caspase8、10、3、9及Cytochome C在U937细胞凋亡过程中的表达及激活情况;选用caspase8、10、3抑制剂预处理U937细胞,观察是否抑制mDRA-6对U937细胞的凋亡诱导作用。结果MTT结果显示:10mg/L的mDRA-6作用U937细胞24h,细胞死亡率为61.09%,呈时间、浓度依赖性;流式细胞仪检测显示mDRA-6作用4h,细胞凋亡率为69.03%;Western blotting结果显示caspase10、3、9及Cytochome C均有活性片断表达,而caspase8无明显激活;caspase10和caspase3抑制剂部分抑制mDRA-6的凋亡诱导作用,caspase8抑制剂作用不明显。结论抗人DR5单克隆抗体mDRA-6通过死亡受体和线粒体途径诱导白血病U937细胞凋亡。     

死亡受体5在内毒素诱导人肝细胞凋亡中的作用

探讨内毒素(LPS)在体外直接作用于LO2细胞引起凋亡及可能机制。将LO2细胞常规培养7 h贴壁后,分为对照组、内毒素处理组、抗人DR5单抗mDRA-6处理组及联合组(内毒素+mDRA-6)。然后在倒置显微镜下观察LO2细胞形态变化;MTT法检测内毒素对LO2细胞生长的影响;流式细胞术检测LO2细胞表面DR5的表达率;Annexin-V和PI双染法检测细胞凋亡率。结果:经内毒素处理的LO2细胞呈现明显的凋亡形态特征,出现核固缩、染色质边缘化、凋亡小体形成。流式细胞术分析表明:对照组LO2细胞表面DR5的表达率为4.8%,用内毒素(10 mg/L)处理12 h后,DR5表达率上调为37.76%。LO2细胞12 h凋亡率:内毒素处理组、抗人DR5单抗mDRA-6处理组、内毒素联合mDRA-6组细胞凋亡率分别为37.78%(早期凋亡21.65%,晚期凋亡16.13%)、29.58%(早期凋亡18.21%,晚期凋亡11.37%)和65.81%(早期凋亡50.61%,晚期凋亡15.20%)(P<0.05)。细胞凋亡率与内毒素的剂量及细胞表面DR5的表达呈相关性。结论:LPS对LO2细胞的杀伤作用主要通过诱导凋亡,细胞表面DR5受体的表达上调可促进这种凋亡作用。     

抗DR5单克隆抗体-mDRA-6对白血病细胞的凋亡诱导作用

目的:观察抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体(mAb)-mDRA-6对白血病细胞的凋亡作用。方法:DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,融合筛选抗DR5杂交瘤细胞,制备抗人DR5mAb-mDRA-6;荧光显微镜下观察mDRA-6作用下白血病细胞Jurkat、HL-60、K562的形态变化;MTT法测定不同浓度的mDRA-6对Jurkat、HL-60、K562细胞存活率的影响;通过FITC-Annexin V及PI标记细胞,以流式细胞术检测mDRA-6对Jurkat、HL-60、K562细胞凋亡率的影响。结果:mDRA-6导致Jurkat、HL-60细胞染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成;mDRA-6对Jurkat、HL-60细胞具有明显的杀伤作用,但对K562的杀伤作用较弱,25mg/L的mDRA-6作用12h,Jurkat、HL-60、K562细胞死亡率分别为88.76%,59.76%,5.18%。Annexin V及PI双染显示1mg/L的mDRA-6作用10h,Jurkat细胞凋亡率为86.06%,10mg/L的mDRA-6作用10h,HL-60细胞凋亡率为48.11%,但10mg/L的mDRA-6作用K562细胞10h,细胞凋亡不明显。结论:抗DR5mAb mDRA-6能够诱导白血病细胞凋亡,不同的白血病细胞株对mDRA-6的敏感性不同。     

低浓度乙醇对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用

目的探讨低浓度乙醇对人肝癌Hep G2细胞的杀伤作用,及其作用机制。方法以体外培养的人肝癌Hep G2细胞为研究对象,MTT法检测细胞毒性,吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)染色观察细胞凋亡形态,2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)法检测Hep G2细胞内活性氧族(ROS)水平,罗丹明123(Rh123)染色检测线粒体膜电位变化,免疫荧光法检测Caspase-9表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 MTT显示,低浓度乙醇呈时间依赖性和剂量依赖性抑制Hep G2细胞增殖,1.0、1.6mol/L乙醇作用6h后,细胞内ROS、Caspase-9荧光强度均显著高于对照组(P0.01,n=20),Rh123荧光强度显著低于对照组(P0.01,n=20);高内涵活细胞成像系统可见细胞核固缩呈圆珠状凋亡特征;流式细胞术显示,1.0mol/L乙醇作用6h可诱导27.92%Hep G2细胞凋亡,5.4%细胞坏死;1.6mol/L乙醇作用6h可诱导31.22%Hep G2细胞凋亡,15.1%Hep G2细胞坏死。结论低浓度乙醇可通过升高细胞内ROS水平,降低线粒体膜电位,上调Caspase-9表达,通过线粒体途径诱导Hep G2细胞凋亡。     

肝细胞生长因子在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下对原代肝星状细胞增殖及凋亡的影响**☆

背景：活化的肝星状细胞是肝纤维化的关键因素,研究表明肝细胞生长因子能促进星状细胞凋亡,其具体机制可能与增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导星状细胞凋亡有关。 目的：观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下,肝细胞生长因子对原代肝星状细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其可能机制。 方法：将SD大鼠原代肝星状细胞复苏、传代,细胞增殖明显时用于实验。实验分为4组：空白对照组为单纯肝星状细胞培养;肝细胞生长因子组：将100 μg/L肝细胞生长因子作用于肝星状细胞;TRAIL组：将2 mg/L的TRAIL作用于肝星状细胞;肝细胞生长因子+TRAIL组：将肝细胞生长因子预先刺激肝星状细胞24 h,再加入2 mg/L TRAIL。 结果与结论：MTT检测显示肝细胞生长因子及TRAIL分别在50~200 μg/L、0.5~1.5 mg/L各浓度下对肝星状细胞增殖抑制率无影响,TRAIL在2 mg/L作用下对肝星状细胞有抑制作用。流式细胞仪检测肝细胞生长因子+TRAIL组的中晚期凋亡率明显高于空白对照组及肝细胞生长因子组(P < 0.05);肝细胞生长因子+TRAIL组DR5荧光强度明显高于其他3组(P < 0.01)。提示在TRAIL作用下,肝细胞生长因子能促进肝星状细胞的凋亡、抑制其增殖。可能与肝细胞生长因子上调活化肝星状细胞表面DR5表达有关。      

多西环素诱导单核细胞系THP-1凋亡的实验研究

目的： 研究多西环素诱导THP-1细胞凋亡的作用。方法： 以PMA诱导THP-1细胞分化贴壁，分别按0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L的浓度梯度加入多西环素，作用12 h或48 h，设空白对照组。观察细胞形态变化，采用MTT法检测THP-1细胞活性，AnnexinⅤ和PI双染色后用流式细胞仪检测THP-1细胞早期凋亡，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测THP-1细胞晚期凋亡。结果： 随着多西环素浓度增高，THP-1细胞收缩变圆，细胞间距增宽乃至完全分离，死亡、崩解的THP-1细胞逐渐增多。MTT法显示随着多西环素作用浓度增高，活性THP-1细胞数量逐渐下降。流式细胞仪检测和TUNEL检测显示THP-1细胞的早期凋亡和晚期凋亡率均伴随多西环素作用浓度的升高而升高。结论： 本实验首次阐明多西环素可以诱导人THP-1细胞凋亡，其效应呈明显的剂量依赖关系。     

抗人DR5抗体mDRA- 6细胞毒作用机制分析

目的:探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mAb)mDRA-6对Jurkat细胞的细胞毒作用及其机制。方法:以流式细胞术测定mAbmDRA-6对Jurkat细胞的细胞毒作用和细胞凋亡作用,以及caspase8、9的抑制剂对mAbmDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡的影响。在荧光显微镜下,观察mAbmDRA-6对Jurkat细胞形态的影响。以琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat细胞中的DNA片段化。结果:mAbmDRA-6对Jurkat细胞具有显著的细胞毒作用,并呈剂量和时间依赖性。经mAbmDRA-6处理后,Jurkat细胞可出现典型的细胞凋亡的形态特征:细胞膜皱缩,出泡,染色质浓缩,形成凋亡小体等。经mAbmDRA-6处理后,Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂,并可导致Jurkat细胞中的DNA片段化。caspase8的抑制剂可明显抑制mAbmDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡,caspase9的抑制剂的影响很小。结论:mAbmDRA-6可通过死亡受体信号传导途径诱导Jurakt细胞凋亡,对Jurkat细胞产生细胞毒作用,其在以TRAIL/DR5系统进行的肿瘤治疗和探讨DR5功能结构域方面具有广阔的应用前景。     

抗DR5单抗增强顺铂诱导HeLa细胞凋亡作用的研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)主要通过死亡受体5(death recep- tor,DR5)诱导肿瘤细胞凋亡。本文旨在探讨顺铂对HeLa细胞表面DR5分子表达影响及抗DR5单抗mDRA-6对顺铂诱导HeLa细胞凋亡增强作用。用间接免疫荧光染色结合流式细胞术分析DR5分子表达;MTT法检测HeLa细胞毒作用;用AnnexinV/PI双染试剂盒检测细胞凋亡率;荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学改变。结果:正常HeLa细胞表面DR5表达量为30.01%,顺铂不能上调HeLa细胞表面DR5表达;mDRA-6可以明显提高顺铂对HeLa细胞的细胞毒作用,且存在剂量效应关系。IC_(50)值约为12.5μg/ml。研究结果表明,mDRA-6能够明显增强顺铂对HeLa细胞的细胞毒及细胞凋亡作用。     

芹菜素对小鼠T淋巴细胞体外增殖、细胞周期和凋亡的影响

目的:研究芹菜素(AP)对小鼠T 细胞体外增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法:无菌分离小鼠淋巴结和胸腺细胞,MTT 法检测不同浓度(25、50、100、150、200 μmol/L)的AP 对多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)诱导的T 细胞增殖的影响,PI 染色结合流式细胞术(FCM)分析细胞周期的分布,Annexin V-FITC/PI 双染色结合FCM 检测AP 对T细胞凋亡的影响,以及AP与地塞米松(DEX)共同作用下T 细胞凋亡的变化,并用MTT 法检测该药物浓度对T细胞的毒性作用.结果:25～200 μmol/L AP对T细胞无药物毒性作用,并明显抑制ConA诱导的T 细胞增殖(P<0.01),使细胞周期停滞在G0/G1期,且呈剂量依赖关系;各浓度AP对T细胞凋亡均具有抑制作用,并明显抑制DEX诱导的T细胞凋亡(P<0.01),且呈剂量依赖关系.结论:在一定浓度范围内,AP 明显抑制ConA诱导的小鼠T细胞体外增殖,使细胞周期停滞G0/G1期,并明显抑制T 细胞凋亡.     

穿心莲内酯对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增值细胞核抗原蛋白表达的影响

目的 探讨穿心莲内酯（AD）对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的影响。方法 应用酸性磷酸酶（APA）法检测细胞增殖抑制率,荧光显微镜观察细胞形态,Annexin V-FITC/PI双染法、流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率, Rh123染色FCM检测细胞线粒体膜电位,免疫细胞化学法检测细胞PCNA蛋白表达。结果AD呈时间、剂量依赖性抑制A431细胞生长增殖;且同一时间点50mg/L、100mg/L AD组与溶媒对照组相比差异显著（P＜0.05）。AD组作用A431细胞24h时,部分细胞核染色质出现典型凋亡形态学改变。不同浓度AD作用A431细胞24h,早期凋亡率、晚期凋亡及坏死率均随AD浓度升高而逐渐增加,且50mg/L、100mg/L AD组与溶媒对照组相比差异显著（P＜0.05）。AD作用A431 24h细胞内PCNA蛋白随AD浓度升高表达逐渐减少。AD作用A431细胞24h后,线粒体膜电位下降明显,与溶媒对照组相比较,50mg/L、100mg/L AD组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 AD可明显抑制A431细胞生长增殖,其抑制细胞增殖可能与下调PCNA蛋白表达有关。AD能诱导A431细胞凋亡,其凋亡机制可能与细胞线粒体膜电位下降有关。     

抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)诱导Jurkat细胞凋亡活性研究

目的：观察抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的死亡受体5（DR5）单克隆抗体——mDRA-6对Jut-kat细胞的凋亡作用。方法：DR5蛋白免疫BALB／c小鼠，融合筛选抗DR5杂交瘤细胞，制备抗人DR5单抗——mDRA-6；光镜下观察mDRA-6作用下Jurkat细胞形态变化；MTT方法计算mDRA-6不同浓度、不同作用时间对Jurkat细胞凋亡率影响。结果：mDRA-6致Jurkat细胞染色质边集、断裂，细胞出芽，凋亡小体形成；MTT法显示mDRA-6具有明显的Jurkat细胞杀伤作用，0.1μg／ml的mDRA-6即可使Jurkat细胞存活率降至77．2％；25．6μg／ml的mDRA-6作用8小时，可使Jurkat细胞存活率降至28．4％；Annexin v及PI双染显示1μg／ml的mDRA-6作用10小时，Jurkat细胞凋亡率达81．82％。结论：抗DR5单抗——mDRA-6具有高效诱导Jurkat细胞凋亡的活性。