五条蚋细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的生物信息学分析

以五条蚋基因组DNA为模板PCR扩增其COⅠ基因序列,将所得片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选阳性克隆。经PCR与双酶切鉴定,获得阳性重组质粒pMT18-T-COⅠ,测序后作序列分析和同源性比较。结果表明,从五条蚋DNA中扩增出COⅠ基因及5′端tRNA-Tyr基因和3′端tRNA-Leu基因部分片段共1 621 bp,其中COⅠ基因序列长度为1 542 bp(GenBank登录号为DQ534949),与预期相符,该基因开放阅读框编码513个氨基酸,编码蛋白等电点为5.84,相对分子质量为M_r5 650,具有COⅠ基因的核心保守结构域。与GenBank已知基因(登录号为AY251520)的序列一致性为99%。     

中缅边境恶性疟原虫Pfcrt基因76位点突变研究

目的 检测分析中缅边境恶性疟原虫氯喹抗性基因(pfcrt)及其76位点氨基酸的突变情况。方法 采用巢式PCR方法扩增含76位点的pfcrt基因,并对扩增产物进行限制性内切酶及测序分析。结果 对恶性疟现症病人血样作pfcrt基因的巢式PCR扩增,目的基因片段(145 bp)检出率为74.05%(117/158),对PCR扩增阳性的产物进行RELP分析,检查突变型酶切片段,突变率为95.73%(112/117)。 结论 恶性疟原虫pfcrt基因可以作为一个分子标记用于监测中缅边境地区恶性疟原虫的氯喹抗性。     

分离自HIV阳性者的弓形虫与RH株GRA6基因比较

目的 目的 对分离自大理地区的HIV阳性者感染的弓形虫与RH株进行致密颗粒抗原 （GRA6） 基因的对比分析。方 方 法 法 采用巢式PCR方法对大理HIV阳性者血液样本与RH株基因组进行扩增, 选取GRA6基因阳性扩增产物, 用MseⅠ 内切酶进行酶切电泳成像, 并对基因序列进行测定与分析。结果 结果 成功扩增出约800 bp大小的GRA6基因片段, MseⅠ 内切酶内切后得到约600 bp和200 bp 2个条带。测序结果显示, HIV阳性者血样扩增产物与RH株扩增产物的GRA6基 因仅存在2个碱基差异： 第447对碱基处C变成G、 第623对碱基处G变成T, 而且在序列中的146 bp和690 bp处均找到 MseⅠ酶切位点 （TTAA）。结论 结论 初步判断大理地区的HIV阳性者感染的弓形虫基因型与弓形虫RH株一致, 同属基因 Ⅰ型。     

云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫SAGSAG2基因位点分析

目的初步了解云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫的基因型特征。方法运用巢式PCR法对弓形虫SAG2基因的两个片段分别进行基因提取、扩增,然后对PCR产物进行回收纯化、酶切及测序,并与弓形虫基因I型标准株进行对比鉴定。结果从170份HIV阳性者全血样本中分别扩增出35个弓形虫SAG2基因(241、221 bp),从其中扩增阳性的全血样本中各选择4份分别进行酶切,扩增出目的基因片段,进一步从酶切样本中选择2份与弓形虫基因标准株RH株进行对比,酶切SAG2基因(241 bp)显示血液样本基因型为Ⅰ型或Ⅱ型,酶切SAG2基因(221 bp)确定基因型均为Ⅰ型。结论初步确定云南临沧HIV阳性者弓形虫基因型以Ⅰ型为主。     

云南大理HIV阳性者感染弓形虫表面抗原SAG1和SAG3基因位点的初步分析

目的通过分析云南大理HIV阳性者感染弓形虫表面抗原SAG1和SAG3基因位点,鉴定该地区HIV阳性者感染弓形虫的基因型。方法自云南省艾滋病防治机构收集大理HIV阳性者全血样品291份,运用巢式PCR技术对血样DNA进行弓形虫SAG1和SAG3基因的扩增,扩增产物分别用限制性内切酶Sau96Ⅰ、HaeⅡ和NciⅠ酶切,并对扩增阳性的产物序列进行测定与分析。结果291份HIV阳性者血样中,成功扩增出弓形虫SAG1基因64份,SAG3基因42份,产物分别为390 bp和225 bp。扩增产物经酶切后电泳,结果显示,64份SAG1基因均得到2个片段,分别为350 bp和50 bp,42份SAG3基因均得到约200 bp大小的条带,与弓形虫基因Ⅰ型标准株(RH株)结果一致。从酶切的标本中选择多份进行测序,结果与基因Ⅰ型标准株SAG1基因序列(登录号为GQ253073)和SAG3基因序列(登录号为JX218225.1)进行比对分析,发现序列一致性分别为99.98%~100%和99.96%~99.98%。结论云南大理HIV阳性者感染弓形虫为基因Ⅰ型。     

武汉地区戊型肝炎病毒开放读码框3的基因序列分析

目的 对武汉地区戊型肝炎病毒(HEV)开放读码框(ORF)3基因序列进行分析,并确定病毒基因型. 方法 收集103份抗-HEV IgM阳性血清,采用逆转录-巢式聚合酶链反应扩增HEV RNA两个基因片段(5020 ～ 5392nt和5347 ～ 5956 nt,EF570133);对PCR产物进行测序,并用ContigExpress将测序结果拼接(含有ORF3基因),对ORF3基因序列进行分析.结果 103份抗-HEV IgM阳性血清中HEV RNA两个基因片段均扩增出来的样本为18份,18株HEV ORF3基因全长均为345 bp,编码114个氨基酸.各毒株间的核苷酸同源性为92.5％ ～ 99.4％,与基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型HEV的核苷酸同源性分别为83.5％ ～ 86.7％、83.2％ ～ 85.2％、84.6％ ～ 87.2％、92.0％ ～ 96.5％;系统进化分析表明该18株HEV均为基因Ⅳ型. 结论 武汉地区HEV主要为基因Ⅳ型,ORF3基因序列可用于同源进化分析.     

巢式PCR扩增SSU rRNA基因确诊1例三日疟原虫感染

目的 通过巢式PCR扩增18SSU rRNA基因片段确诊三日疟原虫的感染,减少三日疟的漏诊和误诊.方法 采用18SSU rRNA基因片段,通过巢式PCR方法,用镜检确诊的间日疟和恶性疟滤纸血样本进行对照,检测1例可疑疟疾患者滤纸血样本.结果 通过种间特异性引物的巢式PCR扩增后,间日疟及恶性疟确诊样本均扩增出相应的12...     

云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫SAG2 基因位点分析

目的 目的 初步了解云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫的基因型特征。方法 方法 运用巢式PCR法对弓形虫SAG2基 因的两个片段分别进行基因提取、 扩增, 然后对PCR产物进行回收纯化、 酶切及测序, 并与弓形虫基因I型标准株进行对 比鉴定。结果 结果 从170份HIV阳性者全血样本中分别扩增出35个弓形虫SAG2基因 （241、 221 bp）, 从其中扩增阳性的全 血样本中各选择4份分别进行酶切, 扩增出目的基因片段, 进一步从酶切样本中选择2份与弓形虫基因标准株RH株进 行对比, 酶切SAG2基因 （241 bp） 显示血液样本基因型为Ⅰ型或Ⅱ型, 酶切SAG2基因 （221 bp） 确定基因型均为Ⅰ型。结 结 论 论 初步确定云南临沧HIV阳性者弓形虫基因型以Ⅰ型为主。     

云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫SAG2 基因位点分析

目的 目的 初步了解云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫的基因型特征。方法 方法 运用巢式PCR法对弓形虫SAG2基 因的两个片段分别进行基因提取、 扩增, 然后对PCR产物进行回收纯化、 酶切及测序, 并与弓形虫基因I型标准株进行对 比鉴定。结果 结果 从170份HIV阳性者全血样本中分别扩增出35个弓形虫SAG2基因 （241、 221 bp）, 从其中扩增阳性的全 血样本中各选择4份分别进行酶切, 扩增出目的基因片段, 进一步从酶切样本中选择2份与弓形虫基因标准株RH株进 行对比, 酶切SAG2基因 （241 bp） 显示血液样本基因型为Ⅰ型或Ⅱ型, 酶切SAG2基因 （221 bp） 确定基因型均为Ⅰ型。结 结 论 论 初步确定云南临沧HIV阳性者弓形虫基因型以Ⅰ型为主。     

广西两地理株钉螺COⅠ基因分析及其与邻近四省钉螺亲缘关系的比较

目的 了解广西两地理株钉螺细胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ,CO Ⅰ)基因的差异性,探讨广西钉螺与周边邻近4省钉螺的亲缘关系.方法 采集广西靖西有肋、横县光壳钉螺,提取DNA,PCR扩增CO Ⅰ基因并测序.登录GenBank检索出云南大理、四川绵竹、湖南岳阳、湖北汉阳4地钉螺的CO Ⅰ基因序列...     

18Sr RNA基因巢式PCR-RFLP分析两株牛源隐孢子虫分离株

目的18S rRNA巢式聚合酶链反应(Nested PCR)-限制片段长度多态性(restriction fragment length polymor-phism,RFLP)鉴定上海(简称SH-BOV)和徐州(简称XZ-BOV)两株牛源隐孢子虫。方法改良-抗酸染色确定感染隐孢子虫的上海株和徐州株牛粪,提取DNA后经18S rRNA基因巢式PCR扩增,扩增产物测序后用Blast和MEGA软件进行同源性和系统发育分析。同时扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切,且XZ-BOV扩增产物用DdeⅠ酶切后进行RFLP分析。结果通过18S rRNA基因分析,SH-BOV与1株巴西牛隐孢子虫Cryptospridiumbovis同源性为100%,种系发育树上两者在同一分支;XZ-BOV与安氏隐孢子虫C.andersoni同源性为99%,种系发育树上两者在同一分支。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切后,可鉴别出SH-BOV为C.bovis,XZ-BOV为C.andersoni或C.muris。XZ-BOV扩增产物用DdeⅠ酶切后可鉴别出XZ-BOV为C.andersoni。结论上海株牛源隐孢子虫(SH-BOV)鉴定为牛隐孢子虫(C.bovis),徐州株牛源隐孢子虫(XZ-BOV)鉴定为安氏隐孢子虫(C.andersoni)。     

日本血吸虫组织蛋白酶L1基因的编码区全序列分析及克隆

目的 分析日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因编码区的完整序列,并定向克隆到真核表达质粒pcD-NA3中。 方法 从日本血吸虫成虫提取总RNA,进行反向巢式RT-PCR,T载体克隆后测序。PCR扩增SjCL1基因的编码区序列,并将扩增产物克隆到pcDNA3质粒的BamHI和Xhol位点上。结果 通过反向巢式RT-PCR扩增出332 bp SjCL1基因5’端序列,测序后与报道的SiCL1基因部分序列拼接,可得到一个编码317个氨基酸的完整编码区序列。PCR特异性扩增出SjCL1编码区基因序列,其大小约为1 kb。经酶切、PCR鉴定和测序表明所构建的质粒pcDNA-SjCL1中含有所扩增的基因序列。 结论 构建了含SjCL1基因的编码区序列的真核表达质粒pcDNA-SjCL1。     

蓝氏贾第鞭毛虫表面变异抗原反义mRNA的鉴定

目的鉴定编码蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)表面变异抗原(VSP)的正义和反义mRNA。方法采用Trizol法抽提贾第虫单克隆滋养体总RNA,SMART法逆转录合成cDNA。设计合成针对VSPs基因3′端保守区域的特异性引物(内、外引物各1条),结合SMART引物采用巢式PCR分别扩增得到来源于正义和反义mRNA的cDNA片段。将PCR产物与pGEM-T载体连接并测序,测序结果与GenBank库中的已知序列进行比对。根据测序结果设计特异性引物,以巢式PCR产物为模板,进行正义和反义cDNA的检测。结果巢式PCR显示,VSP正义mRNA和反义mRNA的cDNA均被成功扩增,电泳鉴定扩到产物分别位于0.1~4kb和0.2~2kb。经克隆、测序和序列比对,共获得34个贾第虫VSP编码序列,其中5个来源于正义mRNA的扩增产物,29个来源于反义mRNA的扩增产物,所得VSP编码基因均含有贾第虫VSP mRNA N端变异区和C端特异性保守区。根据5个正义mRNA序列设计的特异性引物在正义mRNA均得到扩增产物,而在反义mRNA仅有4个得到扩增产物。从29个反义mRNA序列中挑选3个设计特异性引物进行PCR,正义mRNA和反义mRNA均得到扩增产物。结论贾第虫VSP基因转录的多个正义mRNA和反义mRNA序列同时存在,该基因存在转录后基因沉默调节机制。     

不同感染来源疟原虫虫株的18S sRNA基因同源性分析

目的分析云南省不同感染来源疟原虫株的遗传差异。方法采集不同地区疟疾患者的血样,利用巢式PCR扩增疟原虫18SsRNA基因,扩增产物进行双向测序分析,以分子进化树描述18SsRNA基因序列的同源程度。结果对2012年8月~2013年8月期间诊断为云南当地感染的全部疟疾患者22例及感染地为缅甸、非洲、老挝的13例疟疾患者血样进行18SsRNA基因巢式PCR扩增,8份检出恶性疟原虫目的基因片段(205bp)、35份检出间日疟原虫目标片段(120bp)。对43份PCR扩增阳性产物进行测序分析,其中8株恶性疟原虫的18SsRNA基因进化树显示属云南本地感染的虫株与非洲虫株分布在不同亚支,但均与鸡疟原虫(Plasmodium gallinaceum)(Accession:M61723)遗传进化关系较近;35株间日疟原虫的18SsRNA基因进化树显示所有虫株均集中在一个进化分支内,与食蟹猴疟原虫(P.cynomolgi)(Accession:L07559)遗传关系较近,89%的云南本地感染虫株与南美两个虫株(Accession:X13926、U03079)同在一个进化亚支。结论恶性疟原虫不同地理株的18SsRNA基因序列差异性较间日疟原虫株间的差异性更明显。     

用pfcrt点突变基因检测技术检测恶性疟原虫氯喹抗药性的初步研究

目的　建立一种恶性疟原虫氯喹抗药性基因pfcrt点突变的检测方法,以判断是否存在氯喹抗药性。方法　根据恶性疟原虫pfcrt基因序列设计巢式PCR引物,以恶性疟原虫DNA为模板扩增出一条包含第76位密码子的DNA片段;扩增产物经限制性内切酶Apo I消化,用琼脂糖凝胶电泳观察恶性疟原虫pfcrt等位基因是否为突变型。结果　31份样本经巢式PCR扩增均出现14 0 bp左右的特异性片段。酶切消化后,9份滤纸血样本中有4例出现1条14 0 bp左右的片段,为突变型pfcrt等位基因,其余5份出现97bp与4 8bp两种酶切片段,为野生型pfcrt等位基因;2 2份血涂片样本中有10份突变型,突变率为4 5 .16 %。14例突变样本中,有1例体内实验氯喹治疗有效。结论　巢式PCR- RFL P法可以快速、高效的检测恶性疟原虫pfcrt基因76位密码子的点突变,并且能够初步应用于恶性疟原虫氯喹抗药性的鉴别。     

猪囊尾蚴跨膜蛋白T24基因的克隆及序列分析

目的 寻找猪囊尾蚴病新的免疫学候选诊断分子.方法 设计合成引物,用PCR法从猪囊尾蚴cDNA文库中扩增出猪囊尾蚴跨膜蛋白T24基因编码序列,将其与线性克隆载体PMD-18T连接,分别进行酶切和PCR鉴定及DNA测序证实.结果 PCR法扩增出一条长度约678 bp的特异性片段,将重组质粒PMD-18T-T24作BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片段,对插入片段的测序结果表明,T24具有一个长度为678 bp的完整开放阅读框,编码225个氨基酸,理论分子量为23.91 kDa,与GenBank收录的猪囊尾蚴T24基因(编号为AY211879)具有高度的同源性(99.85%).结论 猪囊尾蚴跨膜蛋白T24编码基因克隆成功,为进一步的表达、鉴定及免疫诊断研究奠定了基础.     

21-羟化酶缺乏症全基因测序诊断方法的建立

目的 建立一种特异、可靠的21-羟化酶缺乏症的分子诊断方法.方法通过基因序列比对,寻找CYP21A2基因及其假幕因CYP21A1P中碱基不同的位点,在差异明显处设计真基因的巢式PCR引物,通过对PCR扩增产物直接测序,评估该基因诊断方法的特异性和准确性.用11名正常人测序以证实该方法的可靠性,并用该方法对1例21-羟化酶缺乏症病人的父母进行基因突变的诊断以验证其可行性.结果扩增出3.8 kb的CYP21A2全长基因,其中包含CYP21A2和CYP21A1P基因之间86个碱基差异位点.通过PCR产物直接测序,发现在86个差异碱基中,有97.4%(167/172)的位点的碱基和真基因CYP21A2序列相同.表明该方法可以特异性地扩增CYP21A2基因序列.在1例病人分子生物学诊断为21-羟化酶缺乏症的病人父母中,均检出有CYP21A2基因的I174N杂合突变.结论建它了一种基于PCR产物直接测序的可靠的CYP21A2全基因测序的方法,该方法能够避免假基因的干扰,特异性地扩增CYP21A2基因序列,可用于21-羟化酶缺乏症的分子诊断.     

湖北钉螺COⅠ序列差异的扩展研究

目的 研究中国21株湖北钉螺细胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ,CO Ⅰ)基因序列差异和各地域株的亚种分化.方法 收集中国4省7地湖北钉螺标本,提取基因组DNA后,PCR扩增CO Ⅰ基因部分片段并进行序列测定.加入原有14株钉螺CO Ⅰ序列,用Clustal X进行序列比对后输入MEGA软件计算...     

FTA-巢式PCR方法鉴定溶组织内阿米巴原虫的初步研究

目的建立一种简便,快速的FTA-巢式PCR方法用于鉴定粪便中溶组织内阿米巴原虫(Entamoeba histolytica, E.h).方法 收集门诊腹泻病人新鲜粪便,用光学显微镜进行初步检查.用FTA卡抽提镜检结果为阳性的粪便DNA,根据溶组织内阿米巴原虫的SSU -rRNA序列设计引物,进行巢式PCR扩增,对PCR产物进行琼脂糖凝胶分析,并对阳性产物进行测序和序列比对分析.结果 根据光学显微镜检测结果,挑选了44例镜检结果为阿米巴原虫阳性的腹泻病人粪便.经FTA-巢式PCR扩增,其中20例样本可扩增出427 bp左右的目的条带,目的条带的测序和序列分析结果表明为溶组织内阿米巴原虫.镜检方法与巢式PCR方法的阳性符合率为45.45%(20/44),将E.h与形态学相似的其他内阿米巴原虫进行了鉴定和区分.结论 本研究建立的FTA-巢式PCR方法具有简单,快速,准确等优点,为临床检验和流行病学调查中E.h的鉴别诊断提供了新的技术方法.     

阴道毛滴虫与人型支原体共生对AP33基因序列的影响

目的研究河南地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生情况,并观察其共生对阴道毛滴虫AP33基因序列的影响。方法应用人型支原体及AP33基因的特异性引物对41株阴道毛滴虫临床分离株进行PCR扩增,扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,对AP33基因扩增产物测序,测序结果与GenBank已知序列比对,绘制进化树。结果有34株阴道毛滴虫扩增出人型支原体的特异性片段,大小为334bp;所有虫株均扩增出AP33基因特异性片段,碱基序列相似性为96．8％～99．3％,有多个位点发生突变。进化树分析提示人型支原体的共生对AP33基因序列有一定影响。结论河南地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生具有普遍性,其共生对阴道毛滴虫的基因序列有一定影响。