广西1例人田鼠巴贝虫感染巢式PCR鉴定及其同事感染调查

目的确诊1例国内感染田鼠巴贝虫的病例,对患者周边同事进行调查,初步了解田鼠巴贝虫在广西人群中的分布情况。方法提取患者及相关人士血液DNA,共计121份,进行巢式PCR鉴定。以扩增患者18S rRNA基因为分子标记,与GenBank中各巴贝虫序列进行同源性分析,采用最大似然率法(maximum likelihood)构建系统进化树,分析亲缘关系。结果患者感染田鼠巴贝虫病,患者周边同事共40人感染,阳性率为33.06%(40/121);田鼠巴贝虫的系统分类属于感染人的巴贝虫类,与感染牛、犬的巴贝虫亲缘关系较远。结论田鼠巴贝虫在患者周边同事中感染率较高,对接触人员具潜在的感染风险,应加强预防和控制。     

巢式PCR扩增恶性疟原虫DHFR基因直接测试序列的意义

目的巢式PCR方法扩增恶性疟原虫DHFR基因直接进行DNA序列测序。方法在巢式PCR程序中,设置2次退火(退火45℃45 s;退火65℃1 min),产生足量的DNA模板,进行其序列测试。结果共测试2组样本,dhfr基因序列全长218样本为647 bp,217样本为692 bp,其中218样本在170、193、341位点发生变异。结论该方法省时,节约材料,可满足现场快速调查恶性疟原虫耐药基因的要求。     

冠心病患者线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因片段的重排

采用玻璃粉微量吸附法获取DNA直接作为PCR反应的模板,利用巢式PCR技术,检测冠心病患者血细胞内编码细胞色素C氧化酶亚基II的线粒体DNA扩增片段多态性,探讨线粒体DNA的片段缺失与动脉粥样硬化发生发展的关系。研究发现在全部冠心病患者编码细胞色素C氧化酶亚基II的基因中出现了大约100bp的缺失片段,其中1例冠心病患者中还出现了大约450bp核基因组和600bp的线粒体DNA扩增片段,而在正常对照老人中没有出现片状的重排现象,表明冠心病患者中存在该基因片段的缺失和模板量减少的现象,该基因可能参与了冠状动脉弱样硬化的形成与发展,编码呼吸链复合物一些亚基线粒体DNA片段的重排可能是动脉粥样硬化进行性发展的恶化因素。     

牛源隐孢子虫上海分离株的巢式PCR鉴定

目的 用巢式PCR鉴定1株自然感染的上海牛源隐孢子虫。 方法 改良抗酸染色法检查含隐孢子虫卵囊的牛粪,油镜下观察卵囊形态,测量大小。以牛粪中的隐孢子虫卵囊DNA为模板,根据隐孢子虫18S rRNA序列设计2对引物,巢式PCR扩增目的片段,测序,同源性比对,并运用MEGA4.0软件构建系统发育树。 结果 上海牛源隐孢子虫分离株卵囊呈圆形或椭圆形,大小为（5.6±0.49）mm×（5.2±0.51）mm。扩增出的18S rRNA基因片段为812 bp。上海牛源隐孢子虫分离株的18S rRNA与巴西的牛隐孢子虫（Cryptospridium bovis,GenＢank登录号为151935628）序列一致性为100%,两者在种系发育树上为同一分支,亲缘关系最近;与中国青海、蒙古国、美国、突尼斯等地的牛隐孢子虫序列一致性均为99%。 结论 上海牛源隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫（C. bovis）。     

五条蚋细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的生物信息学分析

以五条蚋基因组DNA为模板PCR扩增其COⅠ基因序列,将所得片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选阳性克隆。经PCR与双酶切鉴定,获得阳性重组质粒pMT18-T-COⅠ,测序后作序列分析和同源性比较。结果表明,从五条蚋DNA中扩增出COⅠ基因及5′端tRNA-Tyr基因和3′端tRNA-Leu基因部分片段共1 621 bp,其中COⅠ基因序列长度为1 542 bp(GenBank登录号为DQ534949),与预期相符,该基因开放阅读框编码513个氨基酸,编码蛋白等电点为5.84,相对分子质量为M_r5 650,具有COⅠ基因的核心保守结构域。与GenBank已知基因(登录号为AY251520)的序列一致性为99%。     

巢式PCR—RFLP法对江西省乙型肝炎病毒Bj和Ba基因亚型的初步鉴定

随着HBV基因型研究的深入,研究表明,HBV基因亚型和基因型一样,也具有明显的地域分布,如日本以Bj亚型为主,中国以Ba基因亚型为主[1].那么,在以B基因型HBV感染为主的江西省[2]是否也以Ba基因亚型为主呢?本研究采用Sugauchi等[3] 的巢式PCR-RFLP法检测江西省HBV基因亚型的分布情况, 以期进一步了解HBV基因亚型与临床相关性.     

广州市白纹伊蚊细胞色素C氧化酶亚基Ι基因遗传多态性分析

目的 探索广州市白纹伊蚊线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因（COI）序列的特征,分析同一城市不同环境下白纹伊蚊的遗传变异。方法 单蚊抽提广州市不同点采集的白纹伊蚊基因组DNA,扩增细胞色素C氧化酶亚基I基因片段,联合单链构象多态性PCR（PCR-SSCP）技术分析COI基因片段多态性并筛选部分样品进行克隆测序,用软件比对分析序列的差异。结果 广州市不同采样点白纹伊蚊PCR扩增后获得709bp的COI基因部分序列,序列分析出现12个变异位点,变异率为1.69%。聚类分析显示广州株白纹伊蚊不同采样点的群体间出现部分分化。结论 广州市不同采样点的白纹伊蚊线粒体COI基因出现部分遗传多态性,可能与城市化发展下白纹伊蚊孳生环境的变化有一定关系。     

利用细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ分析青海藏区细粒棘球绦虫系统发育学

目的 囊型包虫病是一种广泛流行且危害严重的人兽共患寄生虫病。本文旨在分析流行于青南地区细粒棘球绦虫系统发育学及基因多态性。方法 本文利用线粒体 DNA细胞色素氧化酶亚单位 Ⅰ (COX Ⅰ )分子对收集到的流行于青海省的59例包虫病样本进行测序。总计71条序列(其中12条来自GenBank)碱基通过Clustal X软件比对,构建贝叶斯进化树。结果 流行于青海省包虫病样本大部分与细粒棘球绦虫G1型聚在一枝,还有三个样本与多房棘球绦虫(AB018440)聚在一枝。虽大部分棘球绦虫基因型属于G1型,但各自的基因型各不相同,具有丰富的多样性。结论 流行于青海省细粒棘球绦虫系统发育学比我们想象复杂。     

日本血吸虫 NADH脱氢酶 1和细胞色素 C氧化酶 1基因部分序列

目的 :测定和比较日本血吸虫浙江株和安徽株 NADH脱氢酶 1( NADH1)和细胞色素 C氧化酶 1( Cytc1)基因部分序列。方法:用 PCR方法从特定的引物扩增出 NADH1和 Cytc1DNA基因 ,然后进行测序。结果 :获得两株日本血吸虫成虫 NADH1和 Cytc1基因及其序列。结论 :两株日本血吸虫成虫 NADH1基因及其部分序列除第 382位核苷酸不同 ( C/T)外 ,其余的均相同。两株日本血吸虫成虫Cytc1基因及其部分序列完全相同。     

氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性调查

目的调查中国延边朝鲜族是否存在NAD（P）H氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性。方法收集136例延边朝鲜族人的抗凝血，应用PCR．RFLP法检测p22phox基因第242位基因多态性。结果CC基因型频率为0．904，CT＋ TT基因型频率为0．096，C等位基因频率为0．952，T等位基因频率为0．048。结论延边朝鲜族人存在p22phoxC242T基因多态性，并且存在种族差异。     

利用PCR扩增及基因合成构建Adnectin半随机核糖体展示文库

目的构建Adnectin半随机的核糖体(mRNA)展示文库。方法分析Adnectin核糖体展示文库结构序列的编码氨基酸序列,利用无意突变建立酶切位点,使用PCR扩增和基因合成两种方法相结合,构建Adnectin半随机核糖体展示文库,通过限制性内切酶及DNA测序证实序列正确性,对文库转化菌的滴定和插入失活蓝白菌斑筛查和计数测定计算文库的库容。结果经测序证实文库结构的正确性,文库的库容为1.54×1013/m L。结论成功构建Adnectin半随机的核糖体展示文库,方法简单,库容量大,该文库的建成为亲和各种相关蛋白的Adnectin结合序列奠定基础。     

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法.方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101～108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法.     

日本血吸虫 NADH脱氢酶 1和细胞色素 C氧化酶 1基因部分序列(英文)

目的 :测定和比较日本血吸虫浙江株和安徽株 NADH脱氢酶 1( NADH1)和细胞色素 C氧化酶 1( Cytc1)基因部分序列。方法 :用 PCR方法从特定的引物扩增出 NADH1和 Cytc1DNA基因 ,然后进行测序。结果 :获得两株日本血吸虫成虫 NADH1和 Cytc1基因及其序列。结论 :两株日本血吸虫成虫 NADH1基因及其部分序列除第 382位核苷酸不同 ( C/T)外 ,其余的均相同。两株日本血吸虫成虫 Cytc1基因及其部分序列完全相同。     

猪逆转录病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的开发一种能够准确、灵敏、特异检测猪逆转录病毒(PERV)的荧光定量PCR方法。方法根据GenBank数据库中PERV Gag基因的高度保守序列,设计1对特异性引物,建立用于检测PERV的SYBR GreenⅠqPCR检测方法,并验证其灵敏性、重复性和特异性。结果建立的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.998。该方法检测PERV下限为2.04×10^(2)copies/μl,批内批间变异程度较低,变异系数小于2%,且与PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和SVA等均无交叉反应。利用该qPCR方法对采集的49份猪组织样品进行检测,阳性率为81.63%,高于普通PCR阳性检出率的73.47%。结论建立的快速、定量检测PERV的SYBR Green I qPCR方法敏感、特异,具有一定的应用前景。     

云南省临沧市小管福寿螺COⅠ基因多态性分析

目的 通过对云南省临沧市小管福寿螺（Pomacea canaliculata）COⅠ基因的遗传标记分析,了解当地小管福寿螺基因多态性,为云南省后续开展广州管圆线虫病监测提供科学依据。方法 对采自云南省临沧市孟定镇38份小管福寿螺样本进行COⅠ基因扩增,并将PCR产物测序。运用MEGA 6.06软件Kimura?2参数模型,对来自于GenBank的福寿螺单倍型与本研究获得单倍型一起进行系统进化树构建和个体间遗传距离计算,分析其遗传多样性。结果 共获得31条序列,分属3种单倍型（Haplotype1~Haplotype3）,其中Haplotype1的频率较高,占整个样本的83.9%（26/31）。3种单倍型与小管福寿螺的遗传距离最小,为0 ~ 0.052;而与Pila conica的遗传距离最大,为0.021 ~ 0.239。进一步进化分析表明,3种单倍型均为小管福寿螺,与来自日本熊本（GenBank登录号：AB 433769）、中国香港（GenBank登录号：KT 313034）和美国夏威夷（GenBank登录号：EU 523129）的小管福寿螺序列聚成一大支,具有较近的亲缘关系;而与P. insularum（GenBank登录号：EF 514942）、P. camena（GenBank登录号：EF 515059）等序列的亲缘关系较远。结论 云南省临沧市存在小管福寿螺,本研究获得的3种单倍型之间存在较大的遗传分化。     

细胞色素氧化酶P4502C9基因多态性与冠心病及血脂水平的关系

目的 探讨细胞色素氧化酶P450 2C9(CYP2C9)基因多态性与冠心病和血脂水平的相关性.方法 应用聚合酶链反应和基因测序方法,检测218例经冠状动脉造影确诊冠心痛或有明确心肌梗死的患者及200例经冠状动脉造影排除冠心病的对照者的CYP2C9基因型,并对突变基因型者和野生基因型者的血脂按常规方法测定并进行比较分析.结果 冠心病组突变型CYP2C9*3基因发生率显著高于非冠心病对照组(P<0.05),突变型CYP2C9*3基因型者和野生型CYP2C9*1基因型者血脂水平差异无统计学意义.结论 CYP2C9基因多态性与冠心痛的发生可能相关,但未发现与血脂水平有相关性.     

应用半重叠TCRγ引物扩增TCRγ基因重排检测淋巴细胞白血病的研究

采用更加敏感的半重叠式T细胞受体（TCR）γ链特异性引物的多聚酶链反应（PCR）法,对28例急性淋巴细胞白血病（ALL）初治、完全缓解（CR）及骨髓移植（BMT）患儿的骨髓标本进行检测,用消化煮沸及酚抽提法分别对所有骨髓标本进行DNA提取,将PCR结果进行比较。结果表明,消化煮沸法用于微量标本的DNA提取优于酚抽提法。28例ALL患儿中16例检出TCRγ特异性条带,其中微小残留病（MRD）组18例;阳性检出12例,其中免疫分型标记为B细胞型的4例（25.0%）,免疫标记为T细胞型者全部出现TCRγ阳性条带。表明TCRγ基因重排并非克隆性T细胞增生所特有,部分ALL患儿存在双克隆重排。     

美洲钩虫及十二指肠钩虫细胞色素C氧化酶1基因测序

目的：比较美洲钩虫及十二指肠钩虫线粒体细胞色素Ｃ氧化酶１（ＣＯ１）基因序列,确定两种钩虫间ＣＯ１基因差异。方法：现场采集钩虫成虫样本,蛋白酶Ｋ消化抽提线粒体基因组ＤＮＡ,ＰＣＲ方法扩增ＣＯ１基因,ＤＮＡ测序及分析。结果：ＰＣＲ扩增获得约７００ｂｐ美洲钩虫及十二指肠钩虫ＣＯ１基因片段,其序列比较显示两种钩虫ＣＯ１基因同源性达８９．７％,存在特定的核苷酸差异。结论：ＣＯ１基因可作为鉴别两种人体钩虫虫种标记性基因。     

PCR检测HBV前C/C基因启动子区变异与肝细胞癌的关系

目的研究聚合酶链反应(PCR)检测乙型肝炎病毒(HBV)前C/C基因启动子区变异与肝细胞癌(HCC)的关系。方法纳入2016年3月至2018年9月本院35例HCC患者(观察组)与35例HBV感染者(对照组),所有患者均提取血清DNA,采用PCR扩增对HBV前C/C基因启动子区进行测序,对比两组患者基因变异位点和基因型分布。结果观察组HBV前C/C子区24例发生变异,其中G189617例,G18997例,对照组HBV前C/C子区7例变异,其中G18962例,G18995例,两组HBV前C/C子区变异率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。HCC患者基因亚型Ba型7例,C1亚型16例,C2型12例,对照组分别为4例,17例及14例。两组基因分型比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论HBV前C/C基因启动子区变异与HCC发生密切相关,其中HBV前C/C子区G1896变异可增加癌变风险。     

湖北省庙河地区钉螺细胞色素C氧化酶1基因差异的研究

目的　比较湖北省庙河沿岸地区钉螺CO1基因序列的差异 ,探讨光壳螺与肋壳螺差异的原因。方法　在该地区选 7个点 (上游 4个点 ,下游 3个点 )采集钉螺 ,用CTAB法提取钉螺基因组DNA ,PCR方法扩增CO1基因 ,纯化后测序 ,运用ESEE软件排序并比较变异位点 ,观察各点钉螺的CO1基因单倍体型 ,运用PHYLIP软件计算遗传距离 ,绘制基因进化树。结果　获得CO1基因大小为 638bp ,上游和下游累积变异位点数分别为 2 9和 46,两者差异具有显著性 ;各采集点内钉螺按变异位点多少可分为两组 ;各采集点间存在有相同的基因单倍体型 ;上游和下游螺群之间的遗传距离为 0 0 2 2 1± 0 0 10 5 ;在FITCH绘制的基因进化树上 ,上游和下游地区钉螺交错分布在同一亚种不同的两个分支中。结论　在不同的生态环境下 ,下游地区钉螺CO1基因的变异强度比上游大 ;庙河各采集点螺群间存在一定的基因流动 ;庙河地区螺群属湖北钉螺湖北亚种 (O h hupensis) ,可能存在着两种不同进化速率的螺群。