5-氟尿嘧啶对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制及半数抑制浓度

目的:国内外一些学者使用传统抗代谢药物5-氟尿嘧啶防止纤维化,在治疗瘢痕疙瘩方面取得了一定的临床疗效,但对其药物作用机制以及临床药物应用的浓度尚无确切认定.实验拟进一步验证5-氟尿嘧啶对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制以及半数抑制浓度.方法:实验于2006-09/2007-07在安徽医科大学微生物教研室及安徽医科大学附属医院中心实验室完成.①实验材料:6例瘢痕疙瘩(耳垂、大腿各1例、胸前、上臂各2例)均为安徽医科大学附属医院整形外科手术病例,均无系统性疾病和激素、其他药物注射史,对用于实验的所取组织患者均知情同意.治疗方案经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:成纤维细胞体外原代培养,待细胞融合后传代,实验所用细胞均为处于4～8代对数生长期的成纤维细胞.将不同浓度5-氟尿嘧啶(0.1,0.2,0.4,0.8,1.6 g/L)分别对4～8代瘢痕疙瘩成纤维细胞进行干预72 h.再选用接近IC50的5个浓度:0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 g/L,作为余下实验浓度.③实验评估:采用四甲基偶氮唑盐比色法检测各浓度药物对成纤维细胞的抑制率,计算5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞的半数抑制浓度(IC50)值.应用流式细胞术分析法观察5-氟尿嘧啶干预后瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞周期变化及细胞凋亡百分率;应用Hoechst 33258荧光染色法观察凋亡成纤维细胞的形态学特征.结果:6例瘢痕疙瘩标本原代培养成纤维细胞成活良好,均用于实验,进入结果分析.①0.1,0.2,0.4,0.8,1.6 g/L 5-氟尿嘧啶干预72 h 后,细胞抑制率组间两两比较差异均有显著性(P ＜ 0.01).作图得半数抑制浓度IC50为(0.400±0.032)g/L.②0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 g/L 5-氟尿嘧啶干预48 h 后,细胞凋亡率组间两两比较差异显著(P ＜ 0.05),与对照组比较,差异有显著性意义(P ＜ 0.01);实验组与对照组细胞周期百分数比较,表现为G0/G1期停滞,S期减少,各组间两两比较差异有显著性意义(P ＜ 0.05).③各浓度5-氟尿嘧啶干预48 h 后,Hoechst 33258荧光染色观察成纤维细胞均发生不同程度凋亡.结论:5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用.低浓度、短周期注射5-氟尿嘧啶可能是治疗瘢痕疙瘩的一种新思路.     

5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和转化生长因子βI型受体表达的影响

背景：很多实验已证明5-氟尿嘧啶应用于瘢痕疙瘩治疗可收到良好的效果。但作者所查针对5-氟尿嘧啶经由转化生长因子B信号通路作用于瘢痕疙瘩分子机制的报道较少。目的：实验拟观察5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和转化生长因子BI型受体表达的影响。设计、时间及地点：细胞观察实验，于2007-02／10在安徽医科大学微生物教研室完成。材料：标本分别取自因瘢痕疙瘩入院的6例整形手术患者。方法：①瘢痕疙瘩组织成纤维细胞原代培养，取4—6代传代细胞加入5个不同浓度5-氟尿嘧啶（10，20，40，80，160μmol／L）干预24，48，72h。②待细胞长至80％汇合时，加入5氟尿嘧啶配成10，20，30μmol／L3个药物干预浓度组，每组再加入转化生长因子β1继续培养。设空白对照和单纯加转化生长因子β1（5μg／L）的阳性对照。主要观察指标：①利用四甲基偶氮唑盐法测定瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力。②蛋白免疫印迹检测各组瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad7和转化生长因子βI型受体的表达。结果：①5氟尿嘧啶浓度为10，20μmol／L作用24h时未发现成纤维细胞死亡，与空白对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）：其他浓度下作用各组均有显著的成纤维细胞死亡现象（P〈0．01）。②与空白对照组相比，转化生长因子β1组Smad7表达明显减弱，转化生长因子βI型受体表达则显著增强（P均〈0．01）。③加入5-氟尿嘧啶干预后可显著增强Smad7的表达，且在5氟尿嘧啶浓度为20μmol／L时的表达最强（P〈0．01）。④不同浓度5-氟尿嘧啶对转化生长因子βI型受体表达无明显影响。结论：5-氟尿嘧啶浓度为10～20μmol／L时无细胞毒性，与转化生长因子β1共同培养成纤维细胞，能够提高该细胞转化生长因子β1诱导的Smad7表达，但对于转化生长因子βI型受体的表达没有明显影响。     

姜黄素对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响

背景：近期研究提示姜黄素可能是一种抗纤维化制剂。目的：以瘢痕疙瘩成纤维细胞为靶细胞，观察不同浓度姜黄素对瘢痕疙瘩成纤维细胞合成胶原的影响。设计、时间及地点：随机对照实验，于2006-10／2007—11在懈放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科完成。材料：瘢痕疙瘩患者的手术标本5份，患者均知情同意。治疗方案经医院医学伦理委员会批准。姜黄素为美国Sigma公司产品。方法：瘢痕疙瘩成纤维细胞体外原代培养，待细胞融合后传代，取第3-6代对数生长期的成纤维细胞用于实验。将不同浓度姜黄素（5，10，20μmol／L）分别对瘢痕疙瘩成纤维细胞干预24～48h，以空白组做对照。主要观察指标：蛋白免疫印迹检测姜黄素作用瘢痕疙瘩成纤维细胞后结缔组织生长因子的表达。荧光定量聚合酶链反应检测姜黄素作用瘢痕疙瘩成纤维细胞后Ⅰ、Ⅲ型前胶原及结缔组织生长因子基因的表达。结果：①姜黄素作用瘢痕疙瘩成纤维细胞48h后，结缔组织生长因子蛋白的表达减少，均低于对照组（P〈0.01）。②与对照组相比，不同浓度姜黄素干预组Ⅰ、Ⅲ型前胶原及结缔组织生长因子表达均降低（P〈0．01），并且Ⅰ型前胶原表达随着药物浓度的增加，有逐渐降低的趋势，成明显的量效关系。姜黄素20μmol／L组Ⅲ型前胶原表达低于姜黄素10μmol／L组，但差异无显著性意义（P〉O．05），姜黄素10μmol／L组结缔组织生长因子表达低于姜黄素5μmol／L组，但差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：姜黄素对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成有明显抑制作用，其作用机制可能与姜黄素抑制结缔组织生长因子在瘢痕疙瘩成纤维细胞的表达有关。     

5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和转化生长因子βⅠ型受体表达的影响

背景:很多实验已证明5-氟尿嘧啶应用于瘢痕疙瘩治疗可收到良好的效果.但作者所查针对5-氟尿嘧啶经由转化生长因子β信号通路作用于瘢痕疙瘩分子机制的报道较少.目的:实验拟观察5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和转化生长因子βⅠ型受体表达的影响.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-02/10在安徽医科大学微生物教研室完成.材料:标本分别取自因瘢痕疙瘩入院的6例整形手术患者.方法:①瘢痕疙瘩组织成纤维细胞原代培养,取4～6代传代细胞加入5个不同浓度5-氟尿嘧啶(10,20,40,80,160 μmol/L)干预24,48,72 h.②待细胞长至80%汇合时,加入5-氟尿嘧啶配成10,20,30 μmol/L 3个药物干预浓度组,每组再加入转化生长因子β1继续培养.设空白对照和单纯加转化生长因子β1(5 μg/L)的阳性对照.主要观察指标:①利用四甲基偶氮唑盐法测定瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力.②蛋白免疫印迹检测各组瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad7和转化生长因子βⅠ型受体的表达.结果:①5-氟尿嘧啶浓度为10,20 μmol/L 作用24 h 时未发现成纤维细胞死亡,与空白对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05);其他浓度下作用各组均有显著的成纤维细胞死亡现象(P < 0.01).②与空白对照组相比,转化生长因子β1组Smad7表达明显减弱,转化生长因子βⅠ型受体表达则显著增强(P均 < 0.01).③加入5-氟尿嘧啶干预后可显著增强Smad7的表达,且在5-氟尿嘧啶浓度为20 μmol/L 时的表达最强(P < 0.01).④不同浓度5-氟尿嘧啶对转化生长因子βⅠ型受体表达无明显影响.结论:5-氟尿嘧啶浓度为10～20 μmol/L 时无细胞毒性,与转化生长因子β1共同培养成纤维细胞,能够提高该细胞转化生长因子β1诱导的Smad7表达,但对于转化生长因子βⅠ型受体的表达没有明显影响.     

三七总甙对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用

目的：观察三七总甙对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成的作用，以寻找治疗人瘢痕疙瘩的有效药物。方法：体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞，分别应用噻唑蓝(MTT)比色法和H^3-脯氨酸掺入法检测三七总甙作用后细胞增殖及胶原合成的变化。结果：与空白对照组相比，三七总甙含量在0．5，1．0和1．5g／L时均能够显著抑制成纤维细胞增殖及胶原合成(P&;lt;0．01)，但在1．5g／L时对细胞具有毒性作用。结论：三七总甙具有体外抗纤维化作用，可能成为治疗瘢痕疙瘩的有效药物。     

fas基因和p53基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的结构异常与其功能的关系

目的：人体内瘢痕疙瘩成纤维细胞对生长因子的需要量，以及对生长抑制因子的反应都与正常成纤维细胞不同。探讨，fas基因和P53基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的结构变化与其功能的关系。方法：实验于2001-03／09在解放军第一军医大学热带病研究所完成。采用聚合酶链反应-单链构象多态性及基因测序技术，以增生性瘢痕及正常皮肤为对照，检测瘢痕疙瘩组织标本中成纤维细胞fas全基因编码序列和p53基因突变高发区外显子4～6的基因结构，以其变化判断在瘢痕形成中抑制细胞进程及介导细胞凋亡的功能。结果：瘢痕疙瘩fas基因外显子6，8，9及p53基因外显子4，5，6均存在突变，对照组未发现突变。结论：正常皮肤fas和P53基因结构无变异，瘢痕疙瘩成纤维细胞，fas基因和p53基因外显子的突变，致介导细胞凋亡及抑制细胞进程等功能丧失．与瘢痕疹瘩的形成有关。     

成纤维细胞分泌胶原蛋白与5-氟尿嘧啶的时间抑制效应

目的:观察5-氟尿嘧啶干预体外培养病理性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的作用及其时效关系。方法:实验于2005-05/2006-06在安徽医科大学微生物教研室完成。①原代细胞培养成纤维细胞:手术取4例增生性瘢痕、4例瘢痕疙瘩、4例正常皮肤组织,按文献方法进行成纤维细胞原代培养,待细胞融合后传代。②取4～6代传代细胞接种于96孔板,利用四唑盐比色法测定25g/L浓度5-氟尿嘧啶干预不同时间(1,2,5,10,15,30min)后3种体外培养成纤维细胞的增殖能力,统计得出最佳时效。③利用3H-脯氨酸掺入法检测经5-氟尿嘧啶干预不同时间后成纤维细胞的胶原蛋白分泌能力。结果:①原代培养成纤维细胞全部成活,形态良好,经5-氟尿嘧啶干预后细胞形态未发生明显变化。②四甲基偶氮唑盐法测3种不同来源成纤维细胞未干预时增殖能力,瘢痕疙瘩成纤维细胞>正常皮肤成纤维细胞(t=3.542,P<0.01),增生性瘢痕成纤维细胞>正常皮肤成纤维细胞(t=3.257,P<0.01);5-氟尿嘧啶干预成纤维细胞10min与5min比较,其对成纤维细胞的抑制效果增高(正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩3种成纤维细胞10minA值依次为0.389±0.027,0.418±0.051,0.554±0.021;5minA值依次为0.537±0.033,0.589±0.074,0.783±0.015,q=3.80～4.18,P<0.05),与30min比较,差异无显著性。③干预10min3H-脯氨酸掺入量与空白对照组比较明显下降,差异有显著性(q=3.82～3.96,P<0.05),与5min干预组比较,差异均有显著性(q=3.96～4.14,P<0.05),与30min比较,差异无统计学意义。结论:5-氟尿嘧啶可有效抑制病理性瘢痕及正常皮肤来源的成纤维细胞体外增殖和胶原合成,干预10min时效应最佳。     

苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响

目的：研究苦参碱对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(fibroblast，FB)作用的机制。方法：实验于2000-01／2004-06在武装警察部队总医院烧伤整形科实验室完成。将苦参碱以不同浓度梯度作用于体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，采用四唑盐比色法检测苦参碱对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响，采用免疫组织化学检测增殖性细胞核抗原(proliferativecell nuclear antigen，PCNA)的表达，采用流式细胞仪对异硫氰荧光素一连接素V／碘化丙啶双染情况(FITC-Armexin V／PI)检测细胞凋亡率。结果：苦参碱在O．10-10g／L对人瘢痕疙瘩成纤维细胞呈剂量依赖性增殖抑制作用；增殖性细胞核抗原经苦参碱作用后表达明显减弱；FTTC-Armexin V／P1示苦参碱组的凋亡率为40．7，对照组为1．6(P＜O．01)。     

姜黄素对瘢痕疙瘩成纤维细胞周期及其核转录因子kB信号转导通路的影晌

背景：有研究表明姜黄素具有抗器官纤维化的作用,具抑制增殖及诱导G0／G1期细胞累积的作用,但姜黄索可否影响瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞周期,活化核转录因子kB通路,从而抑制瘢痕增宅至今少有报道。目的：观察姜黄素对体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞周期的影响及其核转录因子kB信号转导通路的变化。方法：瘢痕疙瘩成纤维细胞进行体外原代培养,待细胞融合后传代,取第6-8代对数生长期的成纤维细胞用于实验将不匣浓度姜黄索（10,20,30,40,50,60IJmol／L）分别对瘢痕疙瘩成纤维细胞干预。用流式细胞仪测定细胞周期：免疫组织化学法检测核转录因子kB的表达。结果与结论：姜黄素呈剂量和时间依赖性抑制成纤维细胞的增生（P〈0.05）,使细胞周期停滞在G1期,核转录因kB表逆随姜黄素剂量的增大而减小（P〈0.05）。结果显示,姜黄索能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,并使细胞周期停滞往G1期,姜黄索可能通过抑制核转录因子kB信号转导通路的活化,从而发挥其机纤维化的作用。     

体内外不同环境下成纤维细胞丝裂素原激活蛋白激酶的变化

目的：观察脱离体内环境因素时成纤维细胞中信号蛋白表达及细胞生物学特性的变化。方法：瘢痕疙瘩和正常皮肤（作为阴性对照）均来自北京大学第三医院成形科手术患者各6例。取小块瘢痕疙瘩和正常皮肤组织，用组织块接种法进行成纤维细胞原代培养后，进行细胞传代。试验所用为第5-8代细胞。①评价信号蛋白的含量，用体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶的积分吸光度值。②评价信号蛋白的活化强度，用体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶的平均积分吸光度值。③评价信号蛋白的活化程度用活化率值（磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值&;#247;p44／42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值）。结果：①p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶平均积分吸光度值比较：瘢痕疙瘩成纤维细胞均低于正常皮肤成纤维细胞（0．023&;#177;0．005和0．025&;#177;0．005，0．030&;#177;0．000和0．042&;#177;0．004，P〈0．05）。②p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值比较：瘢痕疙瘩成纤维细胞p44／42丝裂原活化蛋白激酶高于正常皮肤成纤维细胞（6048．7&;#177;1576．2，3006．3&;#177;174．4，P〈0．05），瘢痕疙瘩成纤维细胞磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶与正常皮肤成纤维细胞无差异（4876．0&;#177;895．8，3966．5&;#177;533．1，P〉0．05）。③p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶活化率比较：瘢痕疙瘩成纤维细胞低于正常皮肤成纤维细胞（0．830&;#177;0．134，1．319&;#177;0．156，P〈0．05）。结论：成纤维细胞在脱离生物体内环境后，其生物学特性发生改变。体外细胞培养中，磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶的表达水平在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞间无明显差别，而p44／42丝裂原活化蛋白激酶的活化程度和活化强度在正常皮肤成纤维细胞明显高于瘢痕疙瘩成纤维细胞。     

同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内的定居能力

背景：骨髓间充质干细胞具有极强的自我复制能力和多向分化潜能，但当体外分离培养的骨髓基质干细胞移植到体内后，其分布和定居情况不明，这关系到骨髓基质干细胞是否可以作为靶细胞治疗应用于临床。 目的：探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞（MSCs），经不同途径移植到同种异体大鼠，其定居于肝脏的能力。 设计：析因设计。 单位：广东省第二人民医院普外科／中山大学博士后科研基地，南方医科大学珠江医院普通外科，中山大学附属第三医院器官移植科。 材料：实验于2003—01／2004-12在解放军第一军医大学基础部药理教研室完成。选取清洁级成年SD大鼠36只，随机分为5组：CCL4＋门静脉移植组（6只）、门静脉移植对照组（6只）、CCL4＋尾静脉移植组（6只）、尾静脉移植对照组（6只）、混合组（12只）。 方法：①从大鼠骨髓中分离培养获取骨髓间充质干细胞，以绿色荧光蛋白进行标记，体外扩增后，以细针移植骨髓间充质干细胞悬液，移植量为0．5mL／100g。②CCL4＋门静脉移植组：骨髓间充质干细胞移植前3d，每天按20g／L的CCL4 2．5mL／kg体质量灌胃饲养，首次计量加倍，标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植。门静脉移植对照组：骨髓间充质干细胞移植前正常饲养，标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植。CCL4＋尾静脉移植组：骨髓间充质干细胞移植前3d，每天按20g／L的CCL4 2．5mL／kg体质量灌胃饲养，首次计量加倍，标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植。尾静脉移植对照组：移植前正常饲养，标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植。混合组：前4组条件下，各设2只大鼠移植未标记的骨髓间充质干细胞；另设CCL4喂养3d和正常喂养大鼠各2只，不行骨髓间充质干细胞移植。③于移植后的第3，7天，通过荧光定量     

儿童造血干细胞移植后出血性膀胱炎：临床特征与危险因素

背景：出血性膀胱炎是造血干细胞移植后常见并发症之一，探讨其临床特征及发病的危险因素对改善造血干细胞移植效果有重要应用意义。 目的：观察小儿造血干细胞移植后出血性膀胱炎发病情况，并分析其临床特点以及发病危险因素。 设计：病例分析。 单位：中山大学附属第二医院儿科造血干细胞移植中心。 对象：选择1998—10/2004-06在中山大学附属第二医院儿科HSCT中心88例接受脐血移植与外周血造血干细胞移植患儿，男49例，女39例，年龄2-18岁，平均8．0岁。所有患儿家属对治疗知情同意。实验经过医院伦理委员会批准许可。 方法：①患儿预处理方案主要有环磷酰胺（120～200mg／kg）和马利兰（Bu，14-20mg／kg）组成为主的化疗方案。以及环磷酰胺联合全淋巴照射（2—8Gy）或全身照射（2．8Gy）组成的放疗方案。②按文献[7]及[8]标准诊断及对出血性膀胱炎分类：观察患者出血性膀胱炎发生率、临床特征、实验室检查及治疗与转归：分析年龄、性别、供受者人类白细胞抗原配型、移植病种、移植类型、移植方式、急性移植物抗宿主病的发生、巨细胞病毒感染对出血性膀胱炎发生的影响。 主要观察指标：①患儿出血性膀胱炎发生率。②临床特征与实验室检查。③治疗与转归。④出血性膀胱炎发生的危险因素。 结果：纳入患儿88例均进入结果分析。①出血性膀胱炎发生率：16例（18．2％，16，88）患儿发生出血性膀胱炎，其中轻度11例（68．7％），重度5例。②临床特征与实验室检查：患儿均有血尿，其中典型尿频、尿急、尿痛及肉眼血尿8例（50．O％）；肉眼血尿10例（62．5％）：11例蛋白尿（＋～＋＋＋），7例白细胞增高。③治疗与转归：所有出血性膀胱炎患儿均痊愈，病程2～53d。④出血性膀胱炎发生危险因素：受者移植年龄?     

兔腰椎间盘退行性病变模型的建立及影像学改变

背景：建立最佳的椎间盘退行性病变动物模型对了解椎间盘退行性病变的发生机制、预防与治疗均具有重要意义。 目的：以针刺损伤制备兔椎间盘退行性病变模型，通过X射线及MRI分析针刺损伤对椎间盘高度及退行性病变的影响。 设计：随机对照观察。 单位：解放军第二军医大学长海医院骨科。 材料：实验于2005—06／2006—04在解放军第二军医大学长海医院动物中心完成，选用6只健康新西兰大白兔，雌雄不拘，平均6月龄，体质量平均为2．5kg，均来自解放军第二军医大学长海医院动物中心，许可证号码为SCXK（hu）2002-0006。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 方法：①采用腹膜后入路对实验兔腰椎进行手术，以L3-4椎间盘为正常对照，不做处置；L4-5椎间盘作为假手术，只进行暴露；L5-6椎间盘暴露后用24G针头从椎间盘的前外侧针刺3次。②分别于术前及术后4周采用Simens公司CR机拍摄腰椎正侧位X射线片，测量L3-4，L4-5及L5-6椎间隙高度，计算与术前椎间隙高度比值；采用Simens Avanto 1．5T医用超导型磁共振扫描仪检测各节段腰椎间盘T2加权信号，根据信号强度记分，4分为正常椎间盘，髓核内信号均匀、明亮：3分为轻微退行性病变椎间盘，T2加权信号部分降低：2分为中度椎间盘退行性病变，T2加权信号明显降低；1分为重度椎间盘退行性病变，其T2加权信号明显降低，而且伴有椎间隙狭窄。 主要观察指标：①腰椎X射线侧位片椎间盘高度变化。②椎间盘退行性病变程度。结果：纳入实验兔6只，均进入结果分析，无脱落。①椎间盘高度变化：L3-4及L4-5术后与术前椎间盘高度比分别为0．9825±0.01708，0．9725±0．01708，均高于L5-6椎间盘高度比（0．5500±0．02582），差异有统计学意义（P〈0．01）。②腰椎MRI的T2加权像上观察椎间盘退行性     

MTT法检测黄芪和丹参对人乳腺干细胞体外增殖的影响

目的：文献报道黄芪和丹参均可诱导间质干细胞向神经细胞分化。实验以乳腺癌患者乳腺再生为最终目的，通过MTT比色法分析不同剂量黄芪和丹参对体外分离培养的乳腺成体干细胞增殖的影响。 方法：实验于2006—0912007—09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室完成。①对象：女性非家族性乳腺癌癌旁病理证实为正常的乳腺组织取自吉林大学第一医院乳腺外科，共24例，患者年龄29-45岁，对治疗及实验均签署知情同意书。②实验方法：取切除的正常乳腺组织，去除血管及脂肪，剪碎至1．0mm’块，组织块消化培养传代后应用免疫磁珠分离收集MUC^-、ESA^＋标记的细胞，即乳腺成体干细胞，按1×10^8L^-1。密度接种于96孔培养板，无血清培养48h后更换培养基，设立4组：空白对照组不加任何药物；黄芪注射液组分为25，50，100，200mI几4个亚剂量；丹参注射液组分为12．5，25，50，100mL/L 4个亚剂量；黄芪＋丹参复合注射液组分为（25＋12．5），（50＋25），（100＋50），（200＋100）mL/L 4个亚剂量。③实验评估：各组加入对应药物后培养72h，加入5g/L MTT溶液20μL，再加入二甲基亚砜振荡溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值，分析乳腺干细胞的增殖情况。 结果：①乳腺细胞形态观察：乳腺组织原代培养后形成腺上皮细胞和肌上皮细胞。②乳腺干细胞增殖检测：黄芪注射液以50mL/L为界，剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强（P〈0．01），达200mL/L时产生抑制作用（P〈0．05）。丹参注射液剂量在12．5～100mL/L范围内变动时，均能够促进乳腺成体干细胞的增殖（P〉0．05）。黄芪与丹参复合注射液以（100＋50）mL/L为界，复合剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强（P〈0．01），且复合用药效果好于单独用药，当剂量达到（200＋100）mL/     

中老年人群小肠脂肪酸结合蛋白FABP2基因54位密码子多态性与血脂水平的关系

背景：有研究表明，在不同人群中，突变型54TFABP2与血脂障碍以及代谢综合征的其他特征相关。 目的：调查中老年人群小肠脂肪酸结合蛋白FABP2基因多态性频率分布，分析突变型54TFABP2基因与血脂水平的关系。 设计：病例一对照分析。 单位：河北北方学院生物化学教研室和解放军第二五一医院检验科。 对象：选择2003—10/2005-04在解放军第二五一医院体检中心进行体检的中老年人469名，男217名，平均年龄（56±10）岁；女252名，平均年龄（55±13）岁。除外肝、肾功能异常者，相互间无血缘关系；患者均对本实验均知情同意。实验已经医院伦理委员会批准。 方法：①空腹12h后，采用全自动生化仪（Olympus AU6400）测定血浆总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B水平。②采集空腹静脉血1mL，枸橼酸钠抗凝，分离白细胞，蛋白酶K消化，酚，氯仿抽提基因组DNA。采用PCR-限制性片段长度多态性技术检测各组基因型分布频率。 主要观察指标：①血脂水平。②FABP254位点基因型分布频率。 结果：①频率分布：男性54A／TFABP2基因型频率分布为A／A0．48，A／T0．42，T／T0．10：女性为A／A0．44，A／T0．46，T／T0．10。男性和女性突变型54T等位基因频率分别为0．31，0．33。男女间频率分布情况比较，差异无显著性意义（P〉0．05）。②血脂：男性，54T等位基因携带者血浆低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B高于54A等位基因携带者，差异有显著性意义（P〈0．05）；女性，54T等位基因携带者血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇高于54A等位基因携带者，差异有显著性意义（P〈0．05）。 结论：在中老年人群中，FABP2基因多态性频率分布与性别无关；54TFABP2基因携带者有高血脂特征。     

三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较

背景：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态，但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题。 目的：制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层，观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态。 设计：多样本观察比较。 单位：海南医学院附属医院生殖医学中心。 材料：实验于2006—04／2007—07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞系HN—1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕12．6-14．5d的胎鼠11只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 方法：胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏，按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素c处理2．0—3．0h后，按1 × 10^8 L^-1密度接种于明胶包被的中心皿内，UPd,鼠胚胎成纤维细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按1：0，3：1，1：1，1：3，0：1比例混合，然后以1 × 10^8 L^-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态，并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 主要观察指标：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较。②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长?     

激活Hacat细胞表面Toll样受体促进创面愈合的机制

目的：细胞表面Toll样受体对激发先天性免疫、抵抗微生物感染有重要作用。最近研究发现激活细胞表面Toll样受体不仅可以预防微生物感染，还可以促进组织再生。实验通过脂多糖激活体外培养的角质细胞株Hacat细胞表面Toll样受体，观察其促进创面愈合的可能机制。 方法：实验于2007-07在解放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科完成。①实验分组及方法：角质细胞株Hacat由解放军第四军医大学西京医院皮肤科馈赠；脂多糖为Sigma公司产品；小鼠抗入Toll样受体2单克隆抗体、兔抗人Toll样受体4多克隆抗体购于ebioscience公司。体外培养Hacat细胞，根据脂多糖（500ng/L）与Hacat细胞共培养24，48，72h将细胞随机分为脂多糖作用24h组、脂多糖作用48h组、脂多糖作用72h组，另设对照组，只加溶剂二甲基亚枫。②实验评估：蛋自免疫印迹技术检测脂多糖对Hacat细胞Toll样受体2、Toll样受体4及核因子KB表达的影响：荧光定量聚合酶链反应检测脂多糖作用后Hacat细胞内基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子的表达。 结果：光学显微镜下正常入皮肤表皮及角质细胞Toll样受体2、Toll样受体4表达呈蓝黑色：脂多糖作用于Hacat细胞24，48，72h后Toll样受体2、Toll样受体4、核因子-κB表达均高于对照组（P〈0．01）。与对照组相比，其他3组基质金属蛋白酶3及血管内皮生长因子表达均增高（P〈0．01，P〈0．05）。脂多糖作用24h组基质金属蛋白酶9表达与对照组差异无显著性（P〉0．05），脂多糖作用48，72h组与对照组比较，差异显著（P〈0．05）。 结论：激活Hacat细胞表面Toll样受体有促进创面愈合作用，其机制可能与脂多糖作用了：Toll样受体从而激活核因子KB信号传导通路促进细胞释放基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子等因素有关?     

葛根素抑制乙醇诱导骨髓基质细胞成脂分化的实验

背景：动物实验证明乙醇可引起股骨头内脂肪积聚，导致骨坏死：分子生物学实验证明乙醇能够诱导骨髓基质细胞成脂分化：若某种药物能够对抗乙醇诱导骨髓基质细胞的成脂分化作用，则可能防治酒精性骨坏死。 目的：从细胞生物学角度观察葛根索对抗酒精诱导骨髓基质细胞成脂分化作用，探讨葛根素对酒精性骨坏死的防治作用． 设计：随机对照实验． 单位：郑州大学第一附属医院骨科和郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室。 材料：实验于2000-04／2002-12在郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室实验室完成。选用清洁级健康昆明小鼠50只，6～8周龄，雌雄不拘：获取双侧股骨骨髓细胞，细胞接种密度1．5×10^6／cm^2．置入6孔及24孔培养板内，随机分组，每孔作为1个样本，每组为24个样本. 方法：分离培养小鼠骨髓基质细胞，随机分为3组：模型组（给予乙醇0．09mol／L处理细胞），实验组（乙醇0．09mol／L和葛根素终浓度为0．01g／L），对照组（无乙醇和葛根素）。苏丹Ⅲ染色，光镜下脂肪细胞计数；测定细胞内三酰甘油含量、碱性磷酸酶活性和细胞培养液中的骨钙素含量。 主要观察指标：①3组小鼠骨髓基质细胞分化为脂肪细胞结果。②3组小鼠骨髓基质细胞内三酰甘油含量。③3组小鼠骨髓基质细胞内碱性磷酸酶活性值：④3组细胞培养液中骨钙素含量。 结果：Ⅲ处理细胞并培养21d后，实验组、对照组中脂肪细胞均比模型组显著为少。模型组中脂肪细胞数是实验组的8．9倍，是对照组的15．6倍[（319．17±19．92），（35．92±23．77）（20.42±12．15）个／cm^2,P〈0．001]。②处理细胞并培养21d后，实验组和对照组中三酰甘油含量均明显低于模型组[（4．15±1．92）和（3．42±1．60），（11．55±4．42）μg／孔，P〈0．     

人胚嗅鞘细胞与鼠胚胎脊髓组织联合移植对大鼠脊髓损伤的治疗

背景：脊髓损伤高发且后果严重，至今尚无有效措施挽救丧失的神经功能，哺乳动物嗅觉系统的一类特殊胶质细胞的移植引起关注。 目的：观察人胚嗅鞘细胞和大鼠胚胎脊髓共同移植在促进大鼠横断脊髓轴索再生方面是否产生协同作用。 设计：开放性实验。 单位：无锡第三人民医院细胞室，苏州大学附属第一医院神经外科，东南大学附属中大医院神经外科。 材料：实验于2002—09／2004—10在无锡市第三人民医院细胞实验室完成。①选取清洁级成年雌性SD大鼠36只，随机数字表法分成4组：人胚嗅鞘细胞组10只、鼠胚胎脊髓组10只、联合移植组10只，模型组6只。②取12周左右的流产新鲜人胚胎（产妇知情同意）用于嗅鞘细胞的培养纯化。③取孕14d的SD大鼠1只，施行剖腹手术将胎鼠连同胎膜一同取出，用于新鲜胚胎脊髓的制备。 方法：①4组大鼠均建立脊髓半切洞模型。模型组在损伤洞腔内填塞明胶海绵加全培养基8μL，在损伤上下各1mm处注射相同培养基2μL；人胚嗅鞘细胞组明胶上给予嗅鞘细胞悬液8μL，损伤上下各1mm处注射细胞悬液2μL；鼠胚胎脊髓组将组织碎块直接填塞在洞腔内，外覆明胶；联合移植组将同样大小的胚胎脊髓填塞在洞腔内，然后用微量加样器将8μL的嗅鞘细胞悬液注入洞腔，外覆明胶，在洞腔上下各1mm处注射细胞悬液2μL，按层缝合肌层皮肤。②定期对各组大鼠进行行为学评定，结合病理学观察，并通过辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺逆行示踪技术，评价嗅鞘细胞和胚胎脊髓对神经元存活、纤维再生的影响。 主要观察指标：①人胚嗅鞘细胞体外培养及纯化。②体外免疫细胞化学分析。③大鼠后肢运动功能BBB评分测定结果。④移植物及受损脊髓修复的免疫组化检测结果。⑤辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺示踪对各组被     

胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的体外试验

目的：胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长因子之一，其对内皮细胞凋亡影响的报道不多。实验拟验证和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及可能机制。 方法：实验于2006—12／2007—07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所完成。①实验材料及分组处理：取人新鲜脐带（产妇或家属签署知情同意书）分离培养人脐静脉内皮细胞，分为：胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）＋胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）组、正常对照组。分别在细胞培养24h后加入。②实验评估：采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活力；DAPI细胞核荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率的测定；并进行内皮细胞caspase-3活性的检测。 结果：①氧化型低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖，胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化型低密度脂蛋白共同加入后，细胞增殖率明显上升（P〈0．05）。②氧化型低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡，而加入胰岛素样生长因子I刺激后细胞凋亡率降低（P〈0．05）。③caspase-3活性检测表明与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白能明显上调caspase-3的表达，而胰岛素样生长因子Ⅰ＋氧化型低密度脂蛋白组caspase-3活性则降低（P〈0．05）。 结论：胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡具有抑制作用，可能与其下调caspase-3蛋白表达有关。