独活香豆素对Aβ25-35损伤神经元的保护作用及机制研究

目的:研究独活香豆素对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)损伤神经元的保护作用及可能机制。方法:从新生乳鼠大脑皮层中分离纯化神经元,与Aβ25-35、不同浓度独活香豆素和丹酚酸B共同孵育24 h,用噻唑蓝(MTT)法和乳酸脱氢酶(LDH)测定法检测细胞存活率与LDH释放量,用Hoechst 33258染色检测Aβ25-35诱导的神经元凋亡,用RT-PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表达量。结果:独活香豆素(10、50、100、150μg/ml)能明显提高Aβ25-35(30μM)损伤神经元的存活率,降低LDH释放量,抑制神经元凋亡,以浓度为100μg/ml时作用最显著,作用强度与丹酚酸B相当;独活香豆素能提高神经元Bcl-2 mR-NA、降低Caspase-3 mRNA的表达量。结论:独活香豆素对Aβ25-35损伤神经元具有保护作用,其机制可能与抑制促凋亡基因Caspase-3、促进抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达有关。     

β-细辛醚,丁香酚和远志皂苷对Aβ25-35神经细胞毒性的保护作用

目的:优选β-细辛醚,丁香酚和远志皂苷对Aβ25-35诱导的海马神经细胞的保护作用,确定三者最佳配比。方法:采用体外细胞培养的方法,通过NF染色鉴定,建立大鼠海马神经细胞Aβ25-35损伤模型。利用正交实验设计,测定细胞存活率(MTT法)、乳酸脱氢酶(LDH)活性,确定最佳三种药物最佳配比;通过观察细胞形态,利用Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况。结果:L9(34)正交设计实验结果表明β-细辛醚(20,40,80μmol/L),丁香酚(2,4,8μmol/L),远志皂苷(10,20,40μmol/L)合用的最佳优化配比剂量分别为40μmol/L,2μmol/L,20μmol/L,可显著降低Aβ25-35(1μmol/L)诱导的神经细胞凋亡率(P<0.01)和LDH活性,提高细胞相对生存率。结论:三种药物联用可有效保护海马神经细胞免受β淀粉样蛋白的毒性损伤。     

黄芪甲苷对谷氨酸诱导大鼠海马神经元损伤的保护作用

目的:探讨黄芪甲苷对谷氨酸诱导大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机制。方法:将培养7~9天大鼠海马细胞随机分为对照组、黄芪甲苷组、谷氨酸损伤组、黄芪甲苷预处理组。采用噻唑蓝法测定细胞存活率,比色法测定培养液中乳酸脱氢酶含量,流式细胞仪测定细胞凋亡率;2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠探针法检测细胞中活性氧的水平,酶联免疫吸附法检测细胞上清液中8-羟基脱氧鸟苷的含量。结果:0.1 mmol/L谷氨酸作用于海马神经元24小时后,细胞存活率下降、培养液中乳酸脱氢酶含量、细胞凋亡率、细胞中活性氧的水平及上清液中8-羟基脱氧鸟苷的分泌量均明显升高。于损伤前加入黄芪甲苷(0.08,0.40,2.00mg/L)孵育30 min可以不同程度提高细胞存活能力,减少乳酸脱氢酶的漏出,降低细胞凋亡率和上清液中8-羟基脱氧鸟苷的分泌量,但以0.40,2.00 mg/L黄芪甲苷预处理组效果更明显。单纯黄芪甲苷组存活率、细胞凋亡率与正常对照组相比无显著差异,但细胞中活性氧的水平以及上清液中8-羟基脱氧鸟苷的分泌量明显降低。结论:黄芪甲苷预处理能减轻谷氨酸诱导的海马神损伤,其机制可能与其抗氧化有关。     

清心开窍方对Aβ25-35所致大鼠原代神经元细胞损伤的保护作用

目的：了解清心开窍方对Aβ25-35所致大鼠原代神经细胞损伤的保护作用及其机制。方法：制备17d胎龄大鼠胚胎皮层神经细胞,分为正常对照组、模型组、清心开窍方低、中、高剂量组（6.25、12.5、25 mg·mL-1）。支持培养7 d,除正常组、模型组外,用不同剂量清心开窍方预处理24 h后,连同模型组和终浓度10 umol·L-1的Aβ25-35共同培养,造成神经细胞损伤模型。作用24 h后,以MTT值、培养液乳酸脱氢酶（LDH）水平作为细胞的损伤指标,以线粒体膜电位改变作为凋亡早期指标。结果：清心开窍方可以明显减少LDH漏出,增加MTT值,使低线粒体膜电位细胞的比例减少,抑制细胞凋亡,与模型组比较差异显著（P〈0.05）。结论：清心开窍方对Aβ25-35损伤的大鼠原代神经细胞具有保护作用,其机制可能与清心开窍方干预Aβ25-35诱导的细胞线粒体膜电位下降有关。     

田麻益智颗粒对谷氨酸损伤的原代海马神经元的保护作用

目的:通过观察田麻益智颗粒含药血清对GLu损伤的胎鼠海马神经元的保护作用,探讨田麻益智颗粒对脑损伤神经元的保护机制。方法:取孕7 d Wistar大鼠的胎鼠海马,进行体外培养,并对培养的神经干细胞进行神经元鉴定。部分细胞开始贴壁,贴壁细胞呈圆形结果培养24 h后,大部分细胞己经贴壁生长:分化3 d后神经元胞体增大,突起延长并出现分枝,形成稀疏的网络,7d胞体大,突起长,分枝连接成网,相互联系增多细胞成熟。MTT结果表明,田麻益智颗粒含药血清保护组与Glu损伤模型组相比细胞活性明显升高(P<0.05)。平均值,田麻益智颗粒中剂量组对Glu损伤的神经元细胞保护作用与尼莫地平组的保护作用接近,优于正常组及模型组。说明田麻益智颗粒含药血清对Glu损伤海马神经元有保护作用。免疫荧光结果半定量分析结果标记CAMKII的神经元细胞中,统计分析结果表明正常组平均灰度值为148.6±9.88、保护组灰度值151.0±12.37低于Glu损伤组171.5±6.87(P<0.05),说明保护组中CAMKII的含量与正常组接近,并且较Glu损伤模型组少,中剂量组田麻益智颗粒对谷氨酸损伤神的海马神经元的有较好的保护作用。     

复方灯盏花滴丸对谷氨酸致原代培养大鼠海马神经元凋亡的保护作用

目的:探讨复方灯盏花滴丸对谷氨酸致大鼠原代海马神经了亡凋亡的保护作用及其作用机制.方法:采用中药血清药理学方法,制备含药血清;实验分为空白对照组、模型组、尼莫地平组(0.05 g·kg~(-1)),复方灯盏花滴丸高、低剂量组(5.00,1.25 g·kg~(-1)).原代培养大鼠乳鼠大腑海马神经元,以谷氨酸(终浓度为500μmol·L~(-1))作用20 min复制损伤模型,以5%含药皿清干预,MTT法测定细胞存活率,榆测细胞内Ca~(2+)浓度,Hoechst33342和PI双染法荧光显微镜观察神经细胞形态学变化和细胞坏死和凋亡百分率,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:谷氨酸对原代培养的海马神经元有损伤作用,荧光显微镜观察到细胞核皱缩、碎裂及凋亡小体,海马神经元的存活率下降,坏死、凋亡明显高于对照组,复方灯盏花滴丸高、低剂量组和尼奠地平组能明显对抗谷氨酸引起的神经细胞形态改变,海马神经元存活率明显提高;复方灯盏花滴丸含药血清组细胞凋亡率较谷氨酸损伤组显著降低,细胞内钙超载明显减轻.结论:复方灯盏花滴丸对谷氨酸致大鼠海马神经元的凋亡具有保护作用,其作用机制可能与其能降低细胞内Ca超载有关.     

黄芪甲苷和三七总皂苷配伍对脑缺血再灌注损伤大鼠海马NSCs的保护作用

目的探讨黄芪甲苷(AS)和三七总皂苷(PNS)配伍对脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经干细胞(NSCs)的保护作用。方法无血清法培养新生大鼠海马NSCs,将NSCs分为对照组、缺糖缺氧-再灌注(OGD-R)组、AS和PNS配伍组。对照组常规培养,OGD-R组无糖缺氧处理后常规孵育,AS和PNS配伍组在OGD-R基础上用AS和PNS干预培养。比色法测定NSCs的乳酸脱氢酶(LDH),MTT法测定NSCs存活率,DAPI染色检测NSCs凋亡,Nestin/Brd U染色检测NSCs增殖。结果与对照组比较,OGD-R组NSCs的存活率及DAPI核染、Nestin/Brd U阳性反应显著降低,LDH漏出率显著升高(P0.01)。与OGD-R组比较,AS和PNS组NSCs的存活率、DAPI核染、Nestin/Brd U阳性光密度、面密度及细胞数显著增多,LDH漏出率显著降低(P0.01)。结论 AS和PNS可提高OGD-R新生大鼠海马NSCs的存活率,抑制NSCs凋亡,促进NSCs增殖。     

黄芩苷、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1对过氧化氢所致大鼠海马神经元损伤的保护作用

目的:探讨黄芩苷、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1对过氧化氢所致的大鼠海马神经元损伤的保护作用.方法:采用新生1d SD大鼠海马神经元原代培养,以H2O2(50μM)造成细胞损伤模型,将黄芩苷、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1的高(20μg/ml)和低(0.2μg/ml)两个剂量加入到培养细胞液中.在4h时,检测细胞形态及释放出的LDH活性变化,观察到上述药物对海马神经元损伤的直接保护作用.结果:低剂量黄芩苷和三七皂苷R1与模型组比较,未见明显差异,三种组分高剂量和丹参酮ⅡA低剂量组与模型组比较,均有明显差异.结论:黄芩苷、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1对过氧化氢所致的大鼠海马神经元损伤具有一定的保护作用.     

甘草苷对四氯化碳肝脏毒性的保护作用

离体肝灌流技术最初由英国生理学家 Trowell于 1 942年创立 ,1 95 1年 Miller等人改进了灌流方法 ,首次以此技术进行了血浆蛋白质合成的研究。近年来 ,离体肝灌流技术得到普遍使用 ,被广泛用于药理毒理学研究 ,适用于研究药物或化学物质引起的肝毒性 [1]。本实验采用离体肝灌流技术 ,通过灌流一定量的 CCl4造成肝脏毒性 ,同时给予一定量的甘草苷 ,观察甘草苷对肝脏毒性的保护作用 ,据此分析甘草解毒的物质基础及机制。1　材料1 .1　药品与试剂 :甘草苷由本实验室分离纯化制得 ,经 UV,IR,1H- NMR,13 C- NMR等结构测定与文献报道甘草苷…     

黄芪总苷对地塞米松和β-淀粉样蛋白联合诱导大鼠海马神经元损伤的影响

目的探讨黄芪总苷(astragalosides)对地塞米松(Dexamethasone,DEX)与β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-peptide protein,Aβ)联合诱导大鼠海马神经元损伤的影响。方法通过检测海马神经元细胞活性,探讨黄芪总苷能否抑制Aβ和DEX引起海马神经元活力下降;通过检测海马神经元胞内Ca2+浓度([Ca2+]i),探讨黄芪总苷是否通过降低[Ca2+]i抑制海马神经元凋亡;通过检测P-tau-Thr231蛋白水平,进一步探讨黄芪总苷抗Aβ和DEX引起的海马神经元毒性机制。结果 黄芪总苷(10、20、40μg/mL)对体外DEX(10μmo/L)+Aβ25-35(5μmol/L)引起胎鼠海马神经元的损伤有保护作用(P0.01);黄芪总苷能明显降低DEX(10μmol/L)+Aβ25-35(5μmol/L)升高的海马神经元[Ca2+]i、P-tau蛋白水平(P0.05)。结论黄芪总苷对Aβ和DEX诱导的大鼠海马神经元损伤有一定的保护作用。     

氧化槐定碱对新生大鼠海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤后细胞凋亡的影响

目的:研究氧化槐定碱对原代培养新生大鼠海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤后细胞调亡的影响。方法:以原代培养的新生大鼠海马神经元为研究对象建立氧糖剥夺再灌注损伤模型。Hoechst 33342和TUNEL染色法检测海马神经细胞凋亡,透射电子显微镜术观察凋亡细胞形态学变化,化学比色法测定海马神经细胞Caspase-3、Caspase-9和Caspase-8的活性,免疫蛋白印迹技术和实时荧光定量PCR技术检测凋亡相关因子Cytochrome C、Caspase-3、Bcl-2、Bax和PARP-1的蛋白和mRNA的表达。结果:与正常组比较,损伤组Hoechst 33342和TUNEL染色法显示神经细胞凋亡率明显升高;Caspase-3、Caspase-9和Caspase-8活性显著提高;Cytochrome C、Caspase-3、Bax和PARP-1蛋白和mRNA水平明显上调,Bcl-2蛋白和mRNA水平明显下调,Bcl-2/Bax比率也明显下调。与损伤组比较,氧化槐定碱治疗组(20、5、1.25mg/L)可显著改善氧糖剥夺再灌注损伤所致的神经细胞凋亡的形态学变化,并降低神经细胞凋亡率;明显抑制Caspase-3、Caspase-9和Caspase-8的活性。氧化槐定碱治疗组(20mg/L)可明显抑制Cytochrome C、Caspase-3、Bax和PARP-1蛋白和mRNA表达,增强Bcl-2蛋白和mRNA的表达,使Bcl-2/Bax比率上升。结论:氧化槐定碱通过抗凋亡作用对氧糖剥夺再灌注损伤的大鼠海马神经细胞发挥保护作用。     

树枝状大分子聚酰胺-胺对甘草苷促吸收作用及安全性研究

树枝状大分子聚酰胺-胺(PAMAM dendrimers)是近年来研究较为广泛的树状大分子之一,其表面具有大量可修饰的官能团,内部具有大量空腔,且具有良好的生物相容性、渗透性及稳定性,这些特点使PAMAM dendrimers在药物和基因载体等领域应用广泛,并可能成为新型吸收促进剂。为具体研究PAMAM dendrimers的促吸收作用,该课题选取甘草苷为模型药物,其具有补脾益气、解毒保肝等功效,但有研究表明其经口服后不易被胃肠道吸收,且存在首过效应等,生物利用度较低,因此在临床上尚未被广泛应用。该课题以体内肠道吸收的2个主要决定性因素溶解性和渗透性为核心,通过对甘草苷理化性质的研究,并辅以目前广泛应用的肠渗透性模型Caco-2单层细胞膜,对比分析了含或不含不同表面活性官能团的PAMAM dendrimers的甘草苷溶液跨Caco-2细胞膜转运量,并利用MTT试验分析比较了不同官能团的PAMAM dendrimers对细胞的毒性大小。结果显示,0.1%的G4代PAG能安全、有效的促进甘草苷吸收,并适合进一步开发成新型药用辅料。     

Potential involvement of calcium and nitric oxide in protective effects of puerarin on oxygen-glucose deprivation in cultured hippocampal neurons

The aim of this study was to clarify the mechanisms underlying neuroprotection of puerarin (Pur) against cerebral hypoxia-ischemia. Primary hippocampal cultures were prepared from 2-day-old Sprague-Dawley rats. After 8 days in vitro, the cultures subjected to 3h oxygen/glucose deprivation (OGD). Flow cytometric analysis of annexin-V and propidium iodide (PI) labeling cells found that apoptosis and necrosis were significantly reduced in the cultured hippocampal neurons by addition of Pur during 3h OGD and for the following 24h. Pur (40 and 100 microM) also attenuated glutamate (Glu) induced neuronal damage, suppressing apoptosis and necrosis induced by Glu of 0.5mM. Furthermore, the changes in intracellular Ca(2+) and generation of nitric oxide (NO) were measured by confocal laser scanning microscopy with Fluo-3, a Ca(2+) probe, and diaminofluorescein diacetate (DAF DA), a NO probe, respectively. In agreement with the results from flow cytometric analysis, Pur (40 and 100 microM) markedly slowed down OGD-induced Ca(2+) influx and lowered the intracellular Ca(2+) peak. Meanwhile, NO synthesis induced by OGD was significantly inhibited by Pur. Our findings suggest that Pur can ameliorate hippocampal neuronal death induced by OGD in vitro. The protective effects of Pur are associated with inhibiting the action of glutaminergic transmitter, intracellular Ca(2+) elevation and neuronal NO synthesis.     

Protective effects of methoxyflavone derivatives from black galingale against glutamate induced neurotoxicity in primary cultured rat cortical cells

To examine the neuroprotective effects of black galingale, its protection was tested against glutamate‐induced neurotoxicity in primary cortical cultured neurons. It was found that an aqueous extract of this medicinal plant exhibited significant protection against glutamate‐induced toxicity in primary cultured rat cortical cells. In order to clarify the neuroprotective mechanism(s) of this observed effect, isolation was performed to seek and identify active fractions and components. By such fractionation, bioactive methoxyflavone derivatives were isolated from the methanol extracts from the air‐dried rhizomes of black galingale. 5‐Hydroxy‐3,7,3′,4′‐tetramethoxyflavone exhibited significant neuroprotective activities against glutamate‐induced toxicity, exhibiting cell viability of about 60–70%, at concentrations ranging from 0.1 μm to 10 μm . Therefore, the neuroprotective effect of black galingale might be due to the inhibition of glutamate‐induced toxicity by the methoxyflavone derivatives it contains. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.     

苦参碱对大鼠心肌细胞钙内流影响的实验研究

目的：观察苦参碱对培养SD大鼠心肌细胞内钙浓度的影响。以进一步明确苦参碱抗心律失常的机理，方法：利用培养的乳鼠心肌细胞，负载Fura-2/AM，在不同的条件下（培养液中分别加维拉帕米，氯化钾，不同剂量的苦参碱等），应用图象分析系统，测定心肌细胞内钙荧光强度的变化，间接测定苦参碱对钙内流的影响。结果：高钾环境下心肌细胞内钙荧光强度增高，而苦参碱对此有拮抗作用。结论：苦参碱的钙离子拮抗作用可能是其抗心律失常作用机理之一。     

麝香酮对氰化钠加缺糖致PCl2细胞缺血损伤的保护作用

目的：研究麝香酮对PCl2细胞缺血损伤的影响。方法：在离体培养的PCl2细胞，用NaCN加缺糖造成拟缺血损伤．模型，通过细胞形态学观察、MTT微量比色、培养介质LDH活力测定，研究了麝香酮对该模型的保护作用。结果：10^-7～5 10^-5mol／L范围内，麝香酮呈浓度依赖性地降低NaCN加缺糖造成拟缺血损伤模型培养介质内LDH的释放，其IC50为：43．33μmol／L。在10^-7～5 10^-5mol／L范围内，麝香酮呈浓度依赖性地增加NaCN加缺糖造成拟缺血损伤模型培养介质的MTT比色值，其IC50为30.62μmol／L。结论：麝香酮对PCl2细胞缺血损伤具有保护作用。     

麝香酮对连二亚硫酸钠造成PC12细胞缺氧损伤的保护作用

目的研究麝香酮对PC12细胞缺氧损伤的影响.方法在离体培养的PC12细胞用连二亚硫酸钠造成缺氧损伤模型,通过细胞形态学观察、MTT微量比色、培养介质LDH活力测定,研究了麝香酮对该模型的保护作用.结果5×10-7～5 10-51 mol/L范围内,麝香酮浓度依赖性地降低连二亚硫酸钠造成缺氧损伤模型所致培养介质内LDH的释放,其IC50为43.91μmol/L.在10-7～5×10-4mol/L范围内,麝香酮浓度依赖性地增加连二亚硫酸钠造成缺氧损伤模型培养介质MTT比色值.其IC50为28.31μmol/L.结论麝香酮对连二亚硫酸钠造成PC12细胞缺氧损伤具有保护作用.     

麝香酮对氰化钠加缺糖致PC12细胞缺血损伤的保护作用

目的:研究麝香酮对PC12细胞缺血损伤的影响。方法:在离体培养的PC12细胞,用NaCN加缺糖造成拟缺血损伤模型,通过细胞形态学观察、MTT微量比色、培养介质LDH活力测定,研究了麝香酮对该模型的保护作用。结果:10-7~510-5mol/L范围内,麝香酮呈浓度依赖性地降低NaCN加缺糖造成拟缺血损伤模型培养介质内LDH的释放,其IC50为:43.33μmol/L。在10-7~510-5mol/L范围内,麝香酮呈浓度依赖性地增加NaCN加缺糖造成拟缺血损伤模型培养介质的MTT比色值,其IC50为30.62μmol/L。结论:麝香酮对PC12细胞缺血损伤具有保护作用。     

丹皮酚对大鼠离体海马神经元NMDA受体的影响

目的:研究丹皮酚对大鼠海马神经元缺糖缺氧的保护作用。方法:以原代培养的新生大鼠海马神经元作为研究对象,建立缺糖缺氧损伤模型,倒置相差显微镜下进行一般形态学的动态观察,用MTT法测定神经元存活率。通过放射配基结合实验测定海马NMDA受体结合力变化。结果:丹皮酚可显著降低神经元缺糖缺氧时细胞死亡率,减弱NMDA受体结合力。结论:丹皮酚对离体培养的大鼠海马神经元缺糖缺氧具有保护作用,其作用机制与减弱NMDA受体结合力有关。