3种不同地理株柔嫩艾美耳球虫交叉免疫保护性研究

目的研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)保定株、长春株、黑龙江株交叉免疫保护性。方法12d龄AA肉鸡分别用E.tenella保定株、长春株、黑龙江株免疫,24d龄相互攻虫。结果保定株和长春株、黑龙江株的交叉保护率分别为60.4%、61.0%,长春株和黑龙江株为71.0%。结论长春株和黑龙江株的交叉保护率与保定株和长春株、黑龙江株的交叉保护率比较差异极显著(P0.01)。     

柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究

目的构建鸡柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗并研究其免疫保护性。方法应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫ADF基因完整开放阅读框,克隆至pMD18-T载体中;分别用限制性内切酶PstⅠ/ClaⅠ和PvuⅡ/ClaⅠ进行双酶切,ADF目的基因克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pMV261-ADF和pMV361-ADF,重组质粒电穿孔转化卡介苗。将构建的重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF疫苗通过滴鼻、口服、颈部皮下注射3种途径接种雏鸡,BCG免疫组作为对照。免疫后经口接种柔嫩艾美耳球虫卵囊,通过抗球虫指数(ACI)评价重组卡介苗疫苗的保护效果。结果重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF采用滴鼻方式免疫保护效果较好,ACI值分别为161.47和169.21。结论构建的重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF对柔嫩艾美耳球虫卵囊的攻击具有一定的免疫保护作用。     

柔嫩艾美球虫重组质粒pVAX1-Mzp57的免疫保护性试验

目的　用柔嫩艾美球虫 (Eimeriatenella ,E .t)子孢子表面蛋白基因构建的DNA重组质粒免疫海兰小公雏 ,观察其诱导鸡产生的免疫应答反应和对球虫攻击的保护作用。　方法　重组质粒经肌肉和鼻黏膜分别于 7、14、2 8日龄3次接种小公雏 ,用间接ELISA、流式细胞仪检测免疫反应。最后一次免疫后 2周经口接种新鲜的E .t孢子化卵囊 ,确定其保护力的大小。　结果　构建的柔嫩艾美球虫重组质粒免疫雏鸡后能诱导有效的细胞免疫和体液免疫 ,表现为CD4+ /CD8+ T细胞比率、特异性抗体滴度明显高于对照组 (P <0 .0 5 )。可对抗中等剂量球虫的攻击 ,试验组和对照组相比 ,攻虫后卵囊排出量显著减少 ,体重增长快 ,盲肠病变较小 ,保护率达 80 %以上。肌注 10 0 μg重组质粒组综合免疫保护效果最好。　结论　构建的重组质粒对鸡柔嫩艾美球虫的攻击有较好的免疫保护作用。     

柔嫩艾美耳球虫srRNA部分序列测定与分析

目的克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)北京分离株srRNA片段,为我国E.tenella类群分析及分子流行病学研究提供依据。方法用蔗糖密度梯度离心法纯化E.tenella北京分离株卵囊并孢子化,用RT-PCR扩增孢子化卵囊大小为588bp的片段,纯化后PCR产物克隆入pMD18-T,测序。将测得的序列与国外已发表的相应序列进行了同源性比较。结果克隆了预计大小为588bp的E.tenella北京分离株srRNA片段,序列分析显示其与国外株E.tenella相应序列同源性最高为99%。结论成功测定了我国E.tenella北京分离株大小588bp的srRNA片段,其与E.tenella国外分离株相应序列高度同源。     

鸡柔嫩艾美耳球虫疫苗候选基因在大肠杆菌中的表达

目的　构建柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原原核表达载体 ,并且在大肠杆菌中表达。　方法　将本室构建的pMD Mz5 7克隆质粒酶切回收目的片段定向亚克隆到pET 2 8b( )载体上 ,构建成原核表达载体pET 2 8b Mz5 7,酶切鉴定正确后 ,在EscherichiacoliBL2 1(DE3 )中用IPTG诱导表达 ,并经SDS PAGE及Westernblotting鉴定。　结果　成功构建了目的抗原基因的原核重组表达质粒pET 2 8b Mz5 7,IPTG诱导表达该融合蛋白 ,SDS PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 3 7ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符 ,最佳反应条件为 1mol LIPTG诱导 4h后表达量最高。薄层扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的 18% ,Westernblotting结果显示 ,表达产物可被抗柔嫩艾美尔球虫的多克隆抗体识别 ,说明该融合蛋白具有很好的反应原性。　结论　在原核细胞融合表达Mz5 7成功 ,为鸡球虫病重组苗的研究奠定了基础。     

柔嫩艾美球虫杂交株F2 SO7基因重组鸡痘病毒的构建和筛选

目的 构建柔嫩艾美球虫（E.tenella）杂交株F2 SO₇基因重组鸡痘病毒。 方法 将柔嫩艾美球虫杂交株F2 SO₇基因，插入到以胸苷激酶（TK）基因为侧翼的鸡痘病毒表达载体pUTA2中的复合启动子下游，获得重组表达质粒pUTA-SO₇。用脂质体将重组表达质粒转染鸡痘病毒（FPV）感染的鸡胚成纤维细胞（CEF），培养、收获病毒后，用含40 mg/L 5-溴-2-脱氧尿嘧啶（BrdU）的培养液，在TK基因阳性CEF细胞中筛选培养2代，然后用不含BrdU的培养液进行病毒噬斑纯化以筛选rFPV。 结果 PCR扩增可见650 bp左右蛋白条带，间接荧光抗体试验（IFAT）可见重组病毒感染细胞表面有绿色荧光物质，蛋白质印迹分析（Western Blotting），在相对分子质量（Mr）36 000处有1条特异条带，证实了重组病毒在CEF中表达了SO7基因。 结论 成功筛选出表达E.tenella杂交株F2 SO₇基因的重组鸡痘病毒。     

不同地域阴道毛滴虫分离株的随机扩增多态DNA技术分析

目的　分析比较阴道毛滴虫 7个分离株基因组DNA的遗传多态性。　方法　应用随机扩增多态DNA技术对阴道毛滴虫北京 1株、北京 2株、承德株、唐山株、九江 1株、九江 2株与九江 3株基因组扩增 ,并对扩增产物进行聚类分析。　结果　 7虫株两两间的遗传相似指数为 77.4%～ 94.7% ,遗传关系密切。其中 :北京 1株和唐山株为 89.2 % ,九江 1株和九江 2株为 92 .1% ,北京 2株和九江 3株为 94.7% ,亲缘关系较近。而九江 1株和承德株间遗传相似指数为77.4% ,同源性相对较低。　结论　 7株阴道毛滴虫遗传关系密切 ,但在基因水平上存在种内差异性 ;地理位置对阴道毛滴虫遗传学特性影响不大。     

不同株Eimeria maxima交叉免疫保护性研究

目的 比较不同株Eimeriamaccima交叉免疫保护性的差异。方法 采用单卵囊分离技术从三个不同的地区分离到3株E．maxina;寒亭株（HT）、东阿株（DA）和沂南珠（YN），用其中1株作免疫，然后分别用3株进行攻击，计算各组的相对保护率和相对增重率。结果 HT株对DA株、YN株的相对保护率与HT株对HT株的相对保护率差异有显著性（P〈0．05），DA株对YN株、HT株的相对保护率与DA株对DA株的相对保护率差异有显著性（P〈0．05），YN株对DA株、HT株的相对保护率与YN株对YN株的相对保护率的差异有显著性（P〈0．05）。不同组之间和不同株之间对增重影响的差异无显著性（P〉0．05）。结论 HT株、YN株、DA株之间的交叉免疫保护性存在差异。     

柔嫩艾美耳球虫MIC1与MIC2相互作用的鉴定

目的 观察柔嫩艾美耳球虫基因微线蛋白1(EtMIC1)和微线蛋白2(EtMIC2)之间的相互作用,为研究微线蛋白之间相互影响的分子机制以及该互作在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的作用提供参考依据。方法 采用PCR方法克隆柔嫩艾美耳球虫EtMIC1和EtMIC2基因,构建不同的重组表达载体。将构建的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-EtMIC1及捕获质粒pGADT7-EtMIC2转化至Y2HGold酵母感受态,涂布于对应的营养缺陷培养基进行毒性和自激活活性检测。表达GST-EtMIC1和His-EtMIC2两种融合蛋白,纯化后通过GST-Pull down验证二者在体外的相互作用。将构建的pcDNA3.1-His-EtMIC1和pcDNA3.1-HA-EtMIC2重组质粒转染HEK-293T细胞,RIPA裂解后取上清进行免疫共沉淀试验,鉴定二者在体内的相互作用。将真核表达载体pEtMIC1-Myc-LC151和pEtMIC2-HA-KN151共转染HEK-293T细胞,激光共聚焦显微镜观察转染后的细胞内发出的红色荧光。结果 pGBKT7-EtMIC1和pGADT7-EtMIC2单转化对酵母细胞无...     

枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的脂肽抗球虫作用研究

目的探讨枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的脂肽抗鸡柔嫩艾美耳球虫的效果,并对其溶血活性进行测定。方法选取7 d龄雏鸡75只随机分为5组,分别为感染不用药组、抗球虫药(氨丙啉)饮水组、灌胃脂肽组、肌肉注射脂肽组及不感染不用药组。除不感染不用药组外各组均人工感染1×105个孢子化卵囊。于感染后第7 d收集粪便、第9 d剖杀观察各组抗球虫效果。脂肽的溶血活性利用比色法测定。结果感染不用药组、抗球虫药饮水组、灌胃和肌肉注射脂肽组对柔嫩艾美耳球虫的抗球虫指数(ACI)分别为18.71、185.45、161.40和109.83。溶血活性测定表明,其溶血程度随着脂肽浓度的增加而升高。结论口服枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的脂肽具有中效抗柔嫩艾美耳球虫效果,但低于已知的抗球虫药氨丙啉,并且多次口服给药效果要高于一次肌肉注射给药。溶血实验表明其具有溶血活性。     

柔嫩艾美尔球虫EGF-like结构域基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达柔嫩艾美尔球虫（Eimeriatenella）微线蛋白4（EtMIc4）的EGF-like结构域。方法收集并纯化柔嫩艾美尔球虫子孢子,用Trizol法提取总RNA,并反转录成cDNA,利用RT-PCR技术扩增EtMIC4EGF-like基因;回收PCR产物,与pMDl8-T载体连接,构建重组克隆质粒pMDl8-T-EGF-like,然后亚克隆至原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-EGF-like并转化至Transetta感受态,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果成功克隆了EtMIC4EGF-like（390bp）基因,双酶切鉴定重组表达质粒pET-30a-EGF-like构建正确。SDS-PAGE分析重组EGF-like蛋白的分子质量单位约为30ku,Westernblot显示该蛋白能被鸡抗柔嫩艾美尔球虫血清识别。结论成功构建了pET-30a-EGFlike原核表达质粒,并证明其原核表达产物EGF-like蛋白具有反应原性,为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

我国4省9株牛带绦虫RAPD分子鉴别分析

目的 分别对4省9株牛带绦虫标本进行分子鉴别。方法 分别取台湾桃园株（TW1），贵州都匀株（DY1、DY2）、贵州从江株（CJ1、CJ2、CJ3、CJ4）、云南大理株（DL1）和新疆乌什株（XJ1）成虫节片，提取DNA，以13条随机引物进行PCR扩增，用随机扩增多态性DNA（RAPD）分析，并构建不同地理株系统发育树。 结果 13条引物共扩增RAPD片段331个（以相同bp数为依据）。单条引物扩增的RAPD片段数在3～28个之间，13条引物平均扩增RAPD片段在6.11～24.56个，平均14.15个；9个不同地理株牛带绦虫平均RAPD片段在9.85～16.62，平均14.08个。系统发育树显示：9个不同地理株牛带绦虫分为两支，DY1、DY2、DL1和TW1聚为一支，属于牛带绦虫亚洲亚种；CJ1、CJ2、CJ3、CJ4和XJ1聚为另一支，属牛带绦虫指名亚种。 结论 我国4省9株牛带绦虫分别属于牛带绦虫亚洲亚种和牛带绦虫指名亚种。RAPD分析可用于区分牛带绦虫亚洲亚种与牛带绦虫指名亚种的分类学参考。     

用SSR-PCR和RAPD技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异

目的　对中国不同地域的旋毛虫株基因组DNA进行多态性分析 ,并为其种及种下分类提供依据。方法　采用微卫星锚定PCR(SSR PCR)及随机扩增多态性DNA技术 (RAPD)对我国 6旋毛虫株基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物电泳条带情况进行SAS分析 ,计算遗传距离并构建进化树。结果　T3、T7与国内各地域株间遗传距离均大于 0 85 ;湖北株与天津株、黑龙江株与云南株之间的遗传距离均小于 0 2。河南株与前 4株的遗传距离在SSR PCR小于 0 3,在RAPD小于0 6。结论　中国 6株旋毛虫在基因水平可分为不同层次的 3类 :a 湖北株、天津株为一类 ;b 黑龙江株、云南株为一类 ;c 不明株与河南株归为一类或者不明株归为a类中。国内 6株归属于T1。此外 ,国际标准株T3、T7分为另两大类     

用RAPD技术对湖北钉螺遗传变异的研究

目的　对中国不同自然隔离群的湖北钉螺进行遗传变异研究 ,并为种下分类提供依据。　方法　采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术 ,对中国 9省 17地的湖北钉螺进行PCR扩增 ,并根据扩增产物琼脂糖凝胶电泳的带型 ,计算各地域株间的遗传距离 ,根据遗传距离绘制系统进化树。　结果　各地域株标本PCR产物均呈多态性 ,其中台、闽与中国大陆其余地域株钉螺遗传距离为 0 .14 83～ 0 .3 10 2 ;滇、川两个地域株间为 0 .13 95 ,此两株与长江中下游各地域株遗传距离达 0 .12 66～ 0 .3 10 2 ,与闽、台株为 0 .1898～ 0 .2 2 3 5 ;湖区型与平原水网型湖北钉螺的遗传距离为 0 .0 5 89～0 .1872 ;山丘型与湖区型及平原水网型之间的遗传距离为 0 .13 2 6～ 0 .3 10 2 ;湖北省内各地域株遗传距离为 0 .0 42 1～0 .2 44 1。　结论　应用RAPD技术为可将湖北钉螺分为 6类 :①闽、台地域株 ;②滇、川地域株 ;③湖北荆门、阳新、武汉、钟祥、沙市、石首、松滋 (包括松滋河及庙河上下游的钉螺 ) ,赤壁 (车埠 )、赣、沪、皖地域株 ;④湖南地域株 ;⑤湖北应城地域株 ;⑥湖北赤壁 (大田畈 )地域株。     

柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP部分序列的克隆及原核表达

目的构建柔嫩艾美尔球虫病毒RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）蛋白部分区段的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中表达目的蛋白。方法根据柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP基因序列设计引物,以病毒基因组dsRNA为模板,RT-PCR扩增目的片段;扩增产物与pMD-18T克隆载体相连接,经测序鉴定序列正确后,将该质粒酶切,酶切目的片段与原核表达载体pET-28a连接构建原核表达质粒,转化入Transetta（DE3）中,经IPTG诱导表达重组蛋白,用SDSPAGE和Western blot分析目的蛋白表达。结果成功克隆柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP基因部分序列,其长度为1 330bp,DNA测序表明重组原核表达质粒构建成功,推导的编码氨基酸序列与GenBank中布氏艾美尔球虫病毒RDRP氨基酸序列同源区段同源性为36%。经SDS-PAGE和Western blot分析,柔嫩艾美尔球虫病毒部分RDRP蛋白得到表达,表达蛋白的分子质量单位为52ku,与理论值相符,且该重组蛋白可被His标签单克隆抗体识别。结论构建的重组原核表达载体pET-28a-RDRP在大肠埃希菌中高效表达柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP蛋白部分区段,为进一步研究该病毒奠定了基础。     

白色念珠菌磷脂酶活性与RAPD电泳条带多元回归模型的建立

目的探讨白色念珠菌磷脂酶活性与随机扩增多态性DNA(RAPD)电泳条带之间的关系,构建多元回归模型。方法通过蛋黄琼脂平板法对144株白色念珠菌磷脂酶活力进行检测,通过RAPD方法进行扩增并电泳,统计学行多元回归分析。结果144株白色念珠菌磷脂酶阳性率为81.94%,Pz值为0.73±0.015。白色念珠菌磷脂酶活性与450、1 200和1 300 bp 3条带显著相关(P<0.01)。结论RAPD部分电泳条带可间接反映白色磷脂酶活性的强弱,其所含基因信息可能与白色念珠菌的分泌与调节有关。     

用随机扩增多态DNA技术区分7种硬蜱

目的　分析 7种硬蜱基因组DNA的随机扩增多态性 ,探讨随机扩增多态性DNA(RAPD)技术在硬蜱分类中的应用。　方法　提取草原革蜱、森林革蜱、青海血蜱、台湾血蜱、刻点血蜱、龟形花蜱、卵形硬蜱DNA。选取 3条不同的随机排列碱基顺序的多聚核苷酸单链为引物 (P5、P6、P7)进行RAPD PCR扩增反应。将扩增产物制备成DNA图谱 ,对这 7种硬蜱的DNA多态性进行分析。　结果　 7种硬蜱分别扩增出不同数量与不同分子质量的DNA片段。有些硬蜱基因组DNA扩增产物中具有相同的DNA条带 ,这反映出它们的基因组DNA具有同源性 ;同时又具有各自独特的DNA条带 ,且DNA条带的亮度也有差异。　结论　RAPD技术可以准确地区分这 7种蜱。