RNA干扰技术抑制nNOS基因对根性撕脱伤脊髓运动神经元的影响

目的研究神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)基因在臂丛神经根撕脱伤中的作用地位。方法设计、筛选并构建针对nNOS基因的siRNA表达载体,建立C5～T1神经根撕脱伤SD雄性大鼠模型,于撕脱后14d脊髓鞘内给予nNOS的siRNA干预,3d后用NADPH-d酶组化反应结合中性红染色评估撕脱伤脊髓运动神经元的nNOS基因表达水平和创伤神经元的存活率。结果臂丛C5～T1根性撕脱伤17d后,C7节段损伤侧前角运动神经元的存活率在siRNA组、siRNA序列对照组和生理盐水组分别为(80.51±9.16)%、(88.26±2.95)%和(89.13±3.47)%;C7节段损伤侧前角运动神经元的nNOS阳性率为(18.10±6.63)%、(42.21±2.29)%和(39.46±2.41)%。nNOS的siRNA能显著减低撕脱伤诱导的nNOS蛋白在前角运动神经元内的表达水平。虽然与对照组相比,nNOS-siRNA组撕脱伤后运动神经元存活率有下降趋势,nNOS的siRNA但并未对撕脱伤导致的运功神经元的死亡造成显著影响。结论鞘内应用siRNA技术能下调撕脱伤后大鼠脊髓运动神经元内nNOS蛋白的表达,nNOS基因有可能发挥维持撕脱伤后运动神经元存活的作用。     

大鼠脊髓损伤后NGF及其受体TrkA在运动神经元及神经胶质细胞表达的变化

为探讨脊髓损伤后运动神经元及神经胶质细胞内神经生长因子(NGF)及其高亲和力受体(TrkA)表达的变化,用改良Allen重击法损伤SCI组动物T12脊髓,按伤后存活时间再将动物分为脊髓损1 d组、2 d组和5 d组。各组动物的脊髓切片经ABC法免疫组织化学染色,用光镜观察TrkA及NGF在脊髓前角运动神经元表达的变化和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及NGF免疫反应阳性胶质细胞的反应性增生程度,并进行图像分析。结果显示:脊髓损伤后前角运动神经元TrkA及NGF的表达随脊髓损伤后动物存活时间的延长逐渐上调;脊髓白质和灰质内尤其是皮质脊髓束内GFAP及NGF阳性胶质细胞明显增生;与此同时,室管膜细胞内亦可见明显的NGF免疫反应产物。上述结果表明,脊髓损伤可刺激脊髓前角运动神经元表达TrkA及NGF,通过自分泌维持受损神经元的存活;损伤部位反应性增生的胶质细胞亦可产生NGF,通过旁分泌作用于脊髓前角运动神经元或皮质脊髓束的轴突末梢,以维持运动神经元的存活及促进皮质脊髓束的再生;适时补充外源性神经营养素或改变损伤局部的微环境将有利于受损脊髓的修复和再生。     

臂丛根性撕脱伤激活脊髓表达磷酸化CaMKⅡ的时程及定位研究

目的研究大鼠臂丛根性撕脱伤后磷酸化CaMKⅡ的时间和空间定位。方法将SD大鼠（6-8周龄）在手术显微镜下做臂丛根性撕脱伤手术后,应用Western blot方法测定相应脊髓节段（C7、C8）磷酸化CaMKⅡ在1、2、3d时间点及正常大鼠的表达水平。同时应用免疫荧光染色方法检测目标蛋白在1d时间点大鼠脊髓节段的表达水平及空间定位。结果正常大鼠脊髓相应节段检测不到磷酸化CaMKⅡ,在臂丛根性撕脱伤后1～2d对应脊髓节段的磷酸化CaMKⅡ表达明显升高,撕脱伤后3d明显下降并接近正常水平;免疫荧光结果显示：臂丛根性撕脱伤后1d,损伤侧脊髓前角运动神经元和中间神经元明显表达磷酸化CaMKⅡ,对侧脊髓前角运动神经元和中间神经元也有表达。但强度较撕脱侧明显减弱。结论臂丛根性撕脱伤诱导磷酸化CaMKⅡ在损伤节段1d时高表达,然而在3d时逐步下降到正常水平。     

臂丛根性撕脱伤激活脊髓表达磷酸化CaMKⅡ的时程及定位研究

目的研究大鼠臂丛根性撕脱伤后磷酸化CaMKⅡ的时间和空间定位。方法将SD大鼠(6～8周龄)在手术显微镜下做臂丛根性撕脱伤手术后,应用Western blot方法测定相应脊髓节段(C7、C8)磷酸化CaMKⅡ在1、2、3 d时间点及正常大鼠的表达水平。同时应用免疫荧光染色方法检测目标蛋白在1 d时间点大鼠脊髓节段的表达水平及空间定位。结果正常大鼠脊髓相应节段检测不到磷酸化CaMKⅡ,在臂丛根性撕脱伤后1～2 d对应脊髓节段的磷酸化CaMKⅡ表达明显升高,撕脱伤后3d明显下降并接近正常水平;免疫荧光结果显示:臂丛根性撕脱伤后1 d,损伤侧脊髓前角运动神经元和中间神经元明显表达磷酸化CaMKⅡ,对侧脊髓前角运动神经元和中间神经元也有表达,但强度较撕脱侧明显减弱。结论臂丛根性撕脱伤诱导磷酸化CaMKⅡ在损伤节段1 d时高表达,然而在3 d时逐步下降到正常水平。     

神经根撕脱后脊髓运动神经元的病理表现

目的:观察神经根撕脱后脊髓前角运动神经元的病理表现,探讨在该条件下运动神经元死亡的神经生物学机制。方法:选择成年SD雌性大鼠20只,体重200-300g,撕脱右侧臂丛C₅-T₈神经根,术后动物存活3d、5d、1周后取C₅-C₈节段脊髓,对冰冻切片行NADPH-d组化、c-jun免疫组化、中性红和HE染色。观察神经元的形态,计数脊髓前角NOS阳性运动神经元及存活运动神经元数目,以非损伤侧的前角运动神经元数目为100%,计算百分比。结果:神经根撕脱3d、5d、1周后,损伤侧脊髓前角NOS运动神经元平均阳性率分别为:0.74%±0.59%、24.83%±6.73%、51.16%±8.67%。神经元平均存活率分别为93.00%±4.32%、93.67%±5.27%、89.83%±2.65%;c-Jun从撕脱术后3d就有表达,5d后表达开始减少。运动神经元形态变化不明显。1周时偶见前角运动神经元的胞核偏位,但核膜清晰,核仁尚存,染色体固缩。结论:脊神经根撕脱1周内,脊髓前角运动神经元NOS表达递增,c-Jun表达递减,运动神经元开始死亡。NO/NOS可能通过抑制神经元损伤后的再生反应,促进脊髓前角运动神经元的死亡。     

EGb761增强c-jun表达减少轴突撕脱后运动神经元的死亡

目的:观察EGb761对脊神经根撕脱后前角运动神经元c-jun表达和存活的影响。方法:成年Sprague-Dawley雌性大鼠180只,行脊髓C5-T1节段神经根撕脱术后,每日给予腹腔注射1mLEGb761(25mg·kg^-1),对照组注射同容积的生理盐水。治疗后4h、12h、1d、3d、5d、1周、2周、4周和6周9个时点分别处死动物,取C7脊髓节段行c-jun免疫细胞化学和中性红染色。定量比较两组c-jun阳性和存活的运动神经元数目。结果:对照组损伤侧运动神经元4h开始表达c-jun,1d达高峰,以后逐渐下降至术后2周。术后2周运动神经元开始死亡,4周-6周达高峰。EGb761组各时点c-jun阳性和存活的运动神经元数目都多于对照组。结论:EGb761能有效地减少神经根撕脱后运动神经元的死亡,机制可能与c-jun基因的上调有关。     

条件性损伤的时间与频次对神经根撕脱伤后脊髓前角运动神经元死亡及NOS表达的影响

目的　探索条件性损伤 (CL)的时间和频次对神经根撕脱 (TL)后脊髓前角运动神经元一氧化氮合酶 (NOS)表达及细胞死亡的影响。方法　成年SD雌性大鼠 116只 ,体重 2 0 0～ 30 0g ,以钳夹神经干为CL ,分为两个系列。时间系列 :在CL后 1d、3d、1w、2w后进行TL ,频次系列分别在 1w和 2w内行 1次、2次、6次钳夹 ,术后不同时间点处死动物 ,以单纯撕脱臂丛为对照 ,取C5～C8节段脊髓 ,行NADPH d组化染色 ,中性红复染。定量观察前角运动神经元NOS表达及神经元数目。结果　单纯撕脱组术后第 5d脊髓前角运动神经元开始表达NOS ,术后 3wNOS阳性神经元数达到高峰 ,随后逐渐下降并伴有神经元丢失。时间系列 :撕脱后 3d和 2w ,CL与TL间隔 1d组的NOS表达和神经元数目与对照组无显著性差异 ,但 3d、1w、2w组的NOS细胞数及神经元的丢失均较对照组明显 (P <0 0 5P <0 0 1) ,但在撕脱后 4w各CL时间的NOS表达和神经元存活均较对照组减少 (P <0 0 5 )。频次系列 :在 1w和 2w内增加CL次数可使NOS的表达水平和神经细胞的死亡数目有显著增加 ,在撕脱后 2w和 4w等较后的时间点更为明显 ;但在一定时间内 2次与 6次钳夹之间则无显著性差异。结论　条件性损伤与二次损伤之间的间隔影响撕脱后神经元NOS表达和神经元的死亡 ,以间隔时间     

TA9901配伍EGb761对神经根撕脱后脊髓运动神经元的影响

目的　观察植物抗氧化剂TA990 1配伍EGb76 1对臂丛神经根撕脱后C7前角运动神经元c jun、NOS表达和存活的影响。方法　成年SD雌性大鼠 12 0只 ,随机分为撕脱组和治疗组。行C5～T1神经根撕脱术后 ,两组动物每天分别给予腹腔注射 1ml生理盐水或 0 5 % (TA990 1配伍EGb76 1)溶液。治疗后 4h、12h、1d、3d、5d、1周、2周、4周和 6周处死动物 ,行c jun免疫细胞化学、NADPH d组织化学和中性红复染。比较两组动物c jun阳性、NOS阳性和存活的运动神经元的数目。结果　臂丛神经根撒脱 4h后c jun开始表达 ,1d达高峰 ,随后下降至 6周。nNOS表达从 5d开始 ,2周时达高峰 ,以后逐渐下降至 6周。运动神经元的死亡开始于 2周 ,以 4周和 6周最明显。TA990 1配伍EGb76 1提高c jun表达的效果随治疗时间延长而增强、其抑制NOS表达作用则以 2周点最强。结论　TA990 1配伍EGb76 1能增强神经根撕脱后运动神经元c jun的反应 ,抑制NOS的表达 ,提高受损运动神经元的再生能力     

脊髓慢性受压后神经性一氧化氮合酶表达的变化

目的　探讨慢性脊髓压迫性损伤时 ,脊髓组织神经性一氧化氮合酶 (nNOS)免疫组织化学的变化及其与脊髓病理变化之间的关系。　方法　健康家兔 18只 ,随机分为正常对照组、实验对照组及实验组。实验组采用泛影葡胺囊逐级压迫复制慢性脊髓压迫动物模型 ,并持续逐级压迫脊髓 12周。取 3组家免相应脊髓节段 ,用Nissl染色观察脊髓的病理变化 ;用免疫组织化学方法对脊髓组织nNOS阳性运动神经元分布特点和nNOS含量变化进行分析。　结果　Nissl染色可见实验组脊髓压迫节段前角运动神经元损伤 ;实验组家免脊髓压迫节段前角nNOS阳性运动神经元较正常及实验对照组各个脊髓节段异常增加。　结论　在慢性脊髓压迫时 ,神经性NO合成增加     

大鼠臂丛前根撕脱延期再植回对运动神经元存活的作用

目的：建立大鼠臂丛前根撕脱延期再植回模型，研究脊髓前角运动神经元的存活与再生。方法：采用FB逆行示踪法结合NADPH—d组化法与中性红复染，计数阳性神经元．结果：前根撕脱延期3、7、14d再植回组，动物存活3周及6周，脊髓前角运动神经元的存活率分别为79％和75％、58％和51％、57％和50％；NOS阳性神经元的表达率分别为18％和13％、30％和8％、20％和7％。仅做前根撕脱组动物，脊髓前角运动神经元存活率为41％和29％，NOS阳性神经元的表达率为55％和58％。结论：前根撕脱延期再植回能促进脊髓前角运动神经元的存活与再生。     

臂丛节前损伤晚期脊髓前角的病理变化

目的：探讨臂丛节前损伤晚期，脊髓前角运动神经元及其周围结构的病理变化。方法：行右侧C7神经根撕脱术，分别于损伤后6、8、10周取大鼠脊髓C7节段切片，行nNOS、GFAP免疫组化；NADPH—d酶组化加中性红复染和Nissl染色。结果：损伤侧前角运动神经元nNOS表达持续下降直至消失（6、8、10周分别为：24．35％、20．44％、1．83％）；存活率下降以10周最显著（6、8、10周分别为：43．63％、25．14％、20．43％）；损伤侧胶质反应比正常侧强，损伤侧白质胶质反应比灰质强；损伤后10周前角运动神经元周围GFAP阳性反应面积明显大于正常侧前角（126．17vs67.88）。存活率与nNOS阳性率呈正相关关系γ=0．704，P=0．000。与GFAP反应强度不相关γ=-0．006，P=0．987。结论：臂丛节前损伤所致快速大量的运动神经元死亡开始于损伤后8周，此时nNOS减少甚至消失；并有大量胶质细胞的增生。提示临床治疗臂丛节前损伤须早于损伤后6周。     

外源性NGF对大鼠坐骨神经切断缝合术后脊髓和背根节CGRP表达的影响

观察外源性神经生长因子(NGF)对坐骨神经切断立即缝合后大鼠脊髓和背根节(DRG)内不同时间点降钙素基因相关肽(CGRP)表达的影响。成年SD雄性大鼠随机分为NGF组、生理盐水(NS)组、假手术组与正常对照组。实验组动物右侧坐骨神经切断后立即缝合,每天给予NGF(400单位/kg腹腔注射),动物分别存活1、3、5、7、14、21、28d,免疫组织化学方法结合图像分析检测相应节段脊髓和背根节内CGRP的表达。结果表明,NGF处理组术侧背根节与脊髓后角内的CGRP表达明显高于同时间点的NS对照组,平均光密度值相比P<0.05。但各组中脊髓前角运动神经元内的CGRP表达没有明显变化(P>0.05)。结果提示外源性的NGF能明显增加损伤后背根节感觉神经元与损伤侧脊髓后角的CGRP表达,对CGRP在脊髓前角运动神经元内的表达没有明显影响。     

银杏叶提取物影响臂丛撕脱后运动神经元NOS表达及其存活

目的:观察EGb761对脊神经根撕脱后前角运动神经元的保护作用和对NOS表达的影响。方法:成年Sprague-Dawley雌性大鼠80只, 行脊髓C5-T1神经根撕脱术后, 治疗组每天腹腔注射1mLEGb761, 25mg·kg^-1·d^-1;对照组注射等量生理盐水。治疗后1周、2周、4周和6周分别处死动物, 取脊髓C7节段行NADPH-d组化和中性红染色, 计数各组动物损伤侧前角NOS阳性和中性红阳性的运动神经元数目, 比较组间差异显著性。结果:脊神经根撕脱后受损运动神经元NOS表达从1周开始, 2周达高峰, 4周-6周逐渐下降。运动神经元死亡以4周-6周最明显。EGb761能减少以上各时点NOS阳性运动神经元的数目, 提高各时点运动神经元的存活。结论:EGb761能下调运动神经元NOS基因表达, 提高受损运动神经元的存活。     

电针疗法对臂丛根性撕脱伤脊髓后角及中央管nNOS蛋白表达的影响

目的采用电针疗法干预大鼠臂丛神经撕脱伤模型,探索电针疗法对臂丛根性撕脱伤脊髓后角及中央管n NOS蛋白表达的影响。方法健康、雌性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠共40只,行臂丛神经根性撕脱手术,随机分为撕脱伤组(AV组)和撕脱伤加电针治疗组(AV+EA组),AV+EA组动物隔日接受大椎(DU4)和手三里(LI10)电针治疗直至处死,每次治疗的输出脉冲波形为非对称双向疏密波,以20 Hz频率不间断治疗15 min。动物存活1周、2周、3周、6周处死,选取C7节段脊髓,行NADPH-d酶组织化学染色和中性红复染。结果脊髓后角,在AV组n NOS的微量表达;在AV+EA组2~3周n NOS在健侧的表达比伤侧增多,至6周脊髓后角n NOS阳性神经元表达AV组损伤侧;AV+EA组n NOS阳性神经元的表达与同时期的AV组。结论电针疗法导致脊髓后角及中央管n NOS阳性神经元的时空表达特异性。     

天然抗氧化剂减少神经根撕脱诱导的一氧化氮合酶表达和运动神经元死亡

为了研究抗老年性痴呆 990 1号和 TA990 1+银杏叶标准提取物合剂对臂丛神经根撕脱后前角运动神经元的神经元型一氧化氮合酶 ( n NOS)表达和存活的影响 ,用成年 SD雌性大鼠进行右侧臂丛 C5～ T1 神经根撕脱术后 ,随机分为撕脱组、撕脱 +TA990 1组以及撕脱 +TA990 1和 EGb761合剂组。对此三组每天分别进行腹腔注射 1ml生理盐水、0 .5 % TA990 1、0 .5 %TA990 1和 EGb761合剂。治疗 5 d、1、2、4和 6周后处死动物并进行 NADPH-d染色及中性红复染。定量比较各组 n NOS阳性和存活的运动神经元数量。结果证明 ,神经根撕脱后 5 d受损运动神经元开始表达 n NOS,2周时达高峰 ,随后下降至 6周。受损运动神经元的死亡从 2周开始 ,4～ 6周最明显。抗氧化剂治疗组 n NOS表达规律与对照组相似 ,但是阳性程度和阳性细胞数量均少于对照组 ,存活的运动神经元数量则明显多于对照组。撕脱后 4～ 6周 ,TA990 1治疗组抑制 n NOS表达和提高运动神经元存活的效果均明显优于 TA990 1和 EGb761合剂组。结论 :天然抗氧化剂可有效地减少臂丛神经根撕脱后 n NOS表达 ,提高受损运动神经元的存活。 TA990 1抑制 n NOS表达的作用强于 EGb761。     

脊髓小胶质细胞反应性在大鼠周围神经再生中的作用(英文)

为探讨大鼠坐骨神经损伤后脊髓小胶质细胞反应性、脊髓腹角运动神经元脱失与坐骨神经再生之间的关系,制备了SD大鼠右侧坐骨神经钳夹损伤模型,术后3d和7d测定相应脊髓节段小胶质细胞免疫反应性、腹角运动神经元数量,4周时于光镜和电镜下评价坐骨神经变性和再生。结果显示:(1)坐骨神经损伤后3d,脊髓腹角小胶质细胞OX-42免疫反应性开始明显增强(P<0.05);(2)脊髓腹角损伤同侧与对侧运动神经元数量比明显降低(P<0.05),说明同侧运动神经元存活数量减少;(3)组织学评价显示损伤神经再生不良;(4)simvastatin(一种降胆固醇药物,具有潜在的免疫调节作用)干预组较非simvastatin干预组小胶质细胞进一步激活,运动神经元存活数量增加,坐骨神经再生良好。本研究结果提示,脊髓腹角小胶质细胞的激活可能在大鼠周围神经损伤后的再生中发挥重要的保护作用。     

热休克蛋白27对臂丛神经根撕脱后脊髓运动神经元NOS的影响

目的:观察热休克蛋白27(Hsp27)对大鼠臂丛神经根撕脱后脊髓运动神经元一氧化氮合酶(NOS)表达的影响.方法:Wistar大鼠60只,随机分为实验组和对照组.实验组动物分别以45℃预处理热处理15 min,再置于42℃维持20min,置室温恢复24 h后,手术显微镜下进行脊髓C5～C8节段神经根撕脱术;对照组仅施行臂丛神经根撕脱术,两组分别于术后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d处死动物.各组取C5～C8节段脊髓,行Hsp27免疫组化、NADPH-d组化染色,结合自动图象分析系统对结果进行半定量分析.结果:①实验组在12 h即有NOS大量表达,之后迅速同落;对照组伤后第5天开始大量出现NOS阳性.②两组Hsp27表达高峰均在热休克后1 d,且实验组强于对照组.结论:臂丛神经根撕脱伤后Hsp27可能通过抑制NOS神经元来发挥其细胞保护作用.     

Nogo(N-18)在正常大鼠脊髓和坐骨神经的分布及损伤后变化的免疫组织化学研究

目的　研究Nogo蛋白在大鼠脊髓的正常分布及损伤后的变化 ,探索其在脊髓运动神经元表达的意义和作用。　方法　大鼠分脊髓夹伤组、坐骨神经夹伤组及正常对照组。损伤动物存活 1d和 3d后 ,分别进行Nogo(N 18)抗体的免疫组织化学染色。　结果　正常大鼠脊髓灰质腹角的运动神经元出现强烈的Nogo(N 18)免疫反应 ;而在脊髓白质呈阴性反应 ;寡突胶质细胞呈明显的阳性反应 ;在脊髓全段未发现Nogo染色的星形胶质细胞。在脊髓夹伤区域以外的上下部分 ,灰质和白质对Nogo(N 18)的表达与对照组的脊髓相同 ,在损伤部位的白质 ,出现明显的Nogo(N 18)免疫反应物。在正常和损伤的大鼠坐骨神经均未发现阳性反应的施万细胞。　结论　Nogo蛋白在正常大鼠脊髓运动神经元的分布和在损伤部位的积聚 ,提示人们要重新认识Nogo的功能     

GDNF及dvHSV-GDNF对坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的影响

为了探讨胶质细胞源性神经营养因子及单纯疱疹病毒载体介导的胶质细胞源性神经营养因子 (dv HSV-GDNF)对坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的作用 ,本实验对成年大鼠造成双侧坐骨神经损伤后 ,于右侧损伤处分别施加胶质细胞源性神经营养因子和 dv HSV-GDNF;左侧损伤处施加生理盐水作为对照。分别取损伤后 4、7、14和 2 8d大鼠的脊髓 L4 ～ L6 节段 ,经石蜡包埋切片后行 Nissl染色 ,计数前角运动神经元数量并进行统计学分析。结果发现 :坐骨神经损伤后 4、7、14和 2 8d,右侧脊髓前角运动神经元的数量明显高于左侧。提示 :胶质细胞源性神经营养因子和 dv HSV-GDNF可减少坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的死亡     

臂丛损伤脊髓运动神经元与神经根GAP-43 mRNA表达

目的：探讨臂丛根性撕脱伤后脊髓腹角运动神经元胞体及其神经根GAP-43 mRNA的表达变化及其影响因素,为臂丛损伤的修复治疗提供理论依据.方法：本实验创立三种臂丛根性撕脱伤模型：C7前根撕脱（Ⅰ组）;C7前根撕脱＋切断同侧C5～T1后根（Ⅱ组）;C7前根撕脱＋C5和C6之间作同侧脊髓半横断（Ⅲ组）.术后2周按CBS评分标准检查动物神经缺失症状,用SYBR Green荧光定量RT-PCR方法检测脊髓腹角运动神经元胞体及其神经根GAP-43 mRNA的表达改变.结果：根据CBS评分标准,对照组计为0分,Ⅰ组计分较低、Ⅲ组计分最高.对照组C7神经元胞体和C7神经根中GAP-43 mRNA表达量相近,但三种损伤组术后2周神经元胞体内GAP-43 mRNA表达均上调,而神经根内表达却下调.结论：（1）臂丛根性撕脱伤后脊髓腹角运动神经元胞体GAP-43 mRNA表达受突触前机制的调控;（2）臂丛损伤2周时神经元胞体内GAP-43 mRNA表达呈现高峰期,此时进行神经移位术将显著提高神经修复的效果.