植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC组织因子基因表达的转录调控作用

目的 探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇(ZAL)影响血管内皮细胞组织因子(TF)基因表达的转录调控机制,并与内源性动物类雌激素17β联雌二醇(17β联estradiol,E2)进行比较分析。方法 进行人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代培养,利用基因重组技术构建4个含人TF基因5′上游不同长度序列的荧光素酶报告基因质粒,用脂质体转染法分别转入以下6组细胞：①正常对照组;②10^-7mol／L,E2刺激组;③10^-7mol／L ZAL刺激组;④10^-6mol／L AngⅡ刺激组;⑤10～mol／L E2 10^-6mol／L AngⅡ刺激组;⑥10^-7mol／L ZAL 10^-6mol／L AngⅡ刺激组;测定细胞裂解液中荧光素酶比活性(relative luciferase activity,BLA)的变化。结果 转染pGL3-TF-171/ 71的各组细胞BLA均较低,不同刺激组之间无显著差异;AngⅡ可使质粒pGL3-TF-593／ 71,pGL3-TF-316／ 71,pGL3-TF-236／ 71荧光素酶表达大量增加,E2、ZAL均可不同程度地抑制AngⅡ的上述效应,2者间无显著差异。结论 含有1个NF-κB位点和2个AP-1位点的-236bp-171bp区域在E2或ZAL影响TF基因转录中有重要作用。     

17β-雌二醇及α-玉米赤霉醇对人脐静脉内皮细胞组织因子表达的影响

为探讨17β-雌二醇(17β-estrodiol，17β-E2)及植物雌激素α-玉米赤霉醇(α-zearalanol，α-ZAL)对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)组织因子(tissue factor，TF)蛋白含量及mRNA表达的影响，进行人脐静脉内皮细胞原代培养，传至2—3代后用于实验。在细胞培养液中分别加入不同浓度17β-E2及α-ZAL作用48h，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞裂解液中TF蛋白浓度，双辛丁酸法(bicinchoninic acid，BCA)检测细胞总蛋白含量。提取细胞总RNA，用RT-PCR观察17β-E2及α-ZAL对TF mRNA表达的影响。结果发现：10^-7mol／L 17β-E2及α-ZAL均可明显降低HUVECs组织因子蛋白含量及mRNA的表达，二者的作用类似。表明17β-E2及α-ZAL可明显抑制HUVECs组织因子的表达，这可能是它们抗血栓形成、发挥心血管保护作用的机制之一。     

植物雌激素α-玉米赤霉醇对内皮祖细胞的促增殖效应

目的:观察植物雌激素α-玉米赤霉醇(α-ZAL)对内皮祖细胞(EPCs)增殖能力的影响并探讨其机制。方法:密度梯度离心法获取大鼠外周血单个核细胞,加用内皮细胞培养基EGM-2培养,免疫荧光染色和流式细胞术等进行EPCs鉴定,培养2～3代后用于实验。分别用10-5mol/LH2O2和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)及下游靶蛋白Akt(PI3K/Akt)抑制剂LY294002处理细胞,并加用10-6和10-7mol/Lα-ZAL进行干预。检测EPCs上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性以反映细胞损伤情况,用MTT法、EPCs克隆数及细胞总数计数反映EPCs增殖情况,Westernbloting法检测Akt及磷酸化Akt(phosphor-Akt)蛋白表达。结果:经鉴定培养细胞为EPCs;10-5mol/LH2O2及PI3K/Akt抑制剂LY294002可明显降低EPCs存活率(P<0.05),减少细胞克隆,增加LDH活性(P<0.01);而加入10-6和10-7mol/Lα-ZAL干预后能减轻以上作用(P<0.05),同时10-6mol/Lα-ZAL能减少LY294002抑制EPCsAkt的表达和磷酸化。结论:α-ZAL能促进EPCs的体外增殖能力,其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。     

α-玉米赤霉醇改善去卵巢高同型半胱氨酸血症大鼠的血管功能

目的 探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇（α-ZAL）对去卵巢高同型半胱氨酸血症(HHcy)大鼠血管功能的保护作用。方法 用高蛋氨酸(Met)饮食复制HHcy大鼠模型。40只雌性Wistar大鼠随机分为5组：(1)对照组（Con）；(2)2.5%蛋氨酸组（Met）；(3)卵巢切除+2.5%蛋氨酸组（OVX+Met）；(4)卵巢切除+2.5%蛋氨酸+α-ZAL组（OVX+Met+α-ZAL）；(5)卵巢切除+2.5%蛋氨酸+17β-E2组（OVX+Met+17β-E2）。12周后，测定血浆雌二醇（E2）及同型半胱氨酸（Hcy）的含量；离体胸主动脉环灌流，观察胸主动脉环对不同浓度苯肾上腺素（PE）、乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）的反应。结果 高蛋氨酸饮食可明显增高血浆Hcy水平，其中OVX+Met组大鼠Hcy水平升高最显著。与其他组相比， OVX+Met组大鼠胸主动脉环对PE的收缩反应明显减弱，对ACh的舒张反应明显增强。各组大鼠胸主动脉环对SNP的舒张反应无明显差异。结论 α-ZAL可抑制去卵巢HHcy大鼠血浆Hcy水平的升高，减轻血管内皮细胞的损伤，明显改善大鼠的血管功能，其作用与17β-E2相似。     

植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC低氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇（ZAL）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）低氧/复氧损伤的保护作用及其机制。 方法:低氧(93%N₂-5%CO₂-2%O₂)环境中培养HUVECs 3 h后再恢复正常氧供应1 h。用MTT法检测细胞存活率, 分光光度法测定细胞培养上清液中LDH、SOD活性及MDA含量。 结果:HUVECs经低氧/复氧处理后,细胞存活率及SOD活性显著低于对照(P<0.01), LDH活性及MDA含量显著高于对照(P<0.01)；经不同浓度(10-9-10-6 mol/L)的ZAL或雌二醇（E₂）预处理后, 均可显著缓解上述改变，此作用为剂量依赖性，同浓度ZAL与E2的作用无显著差异。 结论:ZAL对低氧/复氧损伤的HUVECs可产生与E2类似的保护作用, 机制可能与促进自由基清除而减轻细胞氧化应激损伤有关。     

植物雌激素α-玉米赤霉醇降低组织因子及核转录因子AP-1和NF-κB水平的作用

目的 :探讨天然植物雌激素α 玉米赤霉醇对组织因子含量的影响及对内皮细胞表达核转录因子AP 1和NF κB的作用。方法 :建立大鼠去卵巢模型 ,进行人脐静脉内皮细胞体外培养。用放射免疫法测定大鼠血浆雌二醇水平 ;酶联免疫吸附法测定血浆及内皮细胞组织因子水平。用WesternBlot法测定核转录因子AP 1和NF κB的含量。结果 :去卵巢后 ,大鼠血浆组织因子水平升高 ,补充α 玉米赤霉醇后可使升高的血浆组织因子接近正常 ;α 玉米赤霉醇亦可降低内皮细胞组织因子含量 ,且可下调内皮细胞核转录因子AP 1和NF κB的水平 ,以上作用均与 17β 雌二醇类似。结论 :α 玉米赤霉醇可能具有抗血栓形成 ,保护心血管系统的作用     

关于补充“植物雌激素α-玉米赤霉醇对内皮祖细胞的促增殖效应”一文有关信息的告示

<正>本刊2011年第21卷第4期"基础与实验"栏目所发表的"植物雌激素α-玉米赤霉醇对内皮祖细胞的促增殖效应"一文补充以下信息:基金项目:北京市自然科学基金项目(7112012),北京市教委科技发展计划(KM200910025003)     

植物雌激素α-ZAL和17βE_2对大鼠单个心室肌细胞缩舒功能和胞内钙瞬时变化的影响

目的:比较植物雌激素α-ZAL和17βE2对大鼠心肌细胞缩舒和胞内钙瞬变的影响。方法:从成年雌性大鼠心脏分离单个心肌细胞,应用美国Ionoptix视频跟踪计算机图像分析系统在0.5Hz的电刺激下测定离体单个心肌细胞的收缩参数,其中包括最大收缩幅度(PS)、最大收缩幅度时间(TPS)、90%舒张幅度时间(TR90)和最大收缩速率(+dL/dttmax)及最大舒张速率(-dL/dttmax);同时用Fura2/AM钙荧光指示剂测定胞内钙浓度的变化。结果:10-9~10-5mol/L17βE2能使PS产生浓度依赖性的增加,最大增加35%,高浓度的17βE2对TPS有显著影响(P<0.05),能够使ΔFFI最大增加25%;而10-9~10-5mol/Lα-ZAL无论是心肌细胞缩舒功能还是胞内钙含量均无明显变化。且α-ZAL和17βE2对心室肌细胞静息状态下胞内钙浓度和胞内钙的荧光衰减率均无显著影响。结论:α-ZAL对心室肌细胞的作用与17βE2有很大不同,17βE2对心肌细胞缩舒有直接刺激作用,增强心肌收缩可能是通过胞内钙释放与胞外钙内流所介导;而α-ZAL无这种作用,它可能是通过抑制胞外钙内流和其抗氧化反应达到保护心室肌细胞的作用。     

植物雌激素a-ZAL和17βE2对大鼠单个心室肌细胞缩舒功能和胞内钙瞬时变化的影响

雌激素（17βE2）对心血管系统的保护效应日益受到人们的重视，特别是绝经后妇女应用激素替代疗法（Hormone Replacement Therapy，HRT）能显著降低心血管疾病的发病率。然而，HRT所带来的不良后果如乳腺癌、子宫内膜癌、静脉血栓等，在相当程度上限制了其推广应用。因此，寻找一种能保留雌激素对心血管系统的保护作用，同时避免上述不良影响的更加安全的雌激素类药物有很重要的意义。植物雌激素α-玉米赤霉醇（α-Zearalanol，α-ZAL）是一种天然植物激素，具有类雌激素样效应。本课题组首次将其引进医学研究领域。我们以往的研究从多个层面多次证实α-ZAL的抗动脉粥样硬化作用与雌激素相似，并明显抑制主动脉由oxLDL所致平滑肌增殖与细胞内[Ca^2＋]。增高，但对子宫和乳腺的雌激素样作用比同剂量的雌激素小得多。提示α-ZAL很可能是比17βE2副作用小而更有应用前景的药物，但是它对心肌细胞缩舒功能影响是否与其相似，又是通过何种途径来保护心肌功能尚不清楚。本实验旨在比较α-ZAL和17βE2对大鼠心室肌细胞缩舒和胞内钙瞬时变化的影响，从而进一步了解α-ZAL保护心肌功能的可能机制。     

抗α-玉米赤霉醇单克隆抗体的研制及初步应用

目的:制备抗α-玉米赤霉醇(α-ZER)的单克隆抗体(mAb),建立对动物源性食品中残留α-ZER及其同系物的检测方法。方法:结合O-羧甲基羟胺法和EDC法制备α-ZER-BSA偶联物,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb。用夹心ELISA测定mAbIg亚类;按Beatty法计算亲和常数;间接ELISA法测定效价;用直接竞争ELISA检测mAb与α-ZER的同系物、己烯雌酚、19-去甲睾酮、链霉素及氯霉素等的交叉反应;绘制α-ZER标准品竞争抑制曲线,检定抗体的灵敏度。用该抗体建立的直接竞争ELISA对37份动物肝组织样品进行检测,并与HPLC检测结果比较。结果:紫外线扫描证明,α-ZER-BSA偶联成功。实验获得8株可稳定分泌抗α-ZERmAb杂交瘤细胞株,其中1株(4E5)分泌的mAb效价较高,为5.142×107,其Ig亚型为IgG1。该mAb能特异识别α-ZER及其同系物,而与其它常用兽药无交叉反应。建立了α-ZER直接竞争ELISA,从HPLC确认为阴性的37份样品中,筛出8份阳性样品。结论:利用mAb建立的直接竞争ELISA检测方法,适合动物源性食品中残留α-ZER及其同系物的快速筛选。     

17β-雌二醇对人甲状腺乳头状癌BCPAP细胞Hsp27表达的影响及作用机制

目的探讨17β-雌二醇对人甲状腺乳头状癌BCPAP细胞Hsp27表达的影响及作用机制。方法用10-8 mol/L的17β-雌二醇(E2)处理不同时间BCPAP细胞,Western blot检测细胞中Hsp27蛋白的表达;分别用E2、PPT和DPN处理BCPAP细胞,Western blot检测细胞中Hsp27蛋白的表达;设计合成ERαsiRNA、ERβsiRNA并转染BCPAP细胞,Western blot检测细胞中ERα、ERβ和Hsp27蛋白的表达;CHIP检测ERα、ERβ对Hsp27基因启动子的影响。结果用10-8mol/L的E2处理不同时间BCPAP细胞,随着E2处理时间增加,E2对BCPAP细胞中Hsp27蛋白的表达水平逐渐增高,在24 h达到峰值(P0.05);E2作用转染ERαsiRNA的BCPAP细胞24 h,与E2处理组相比,Hsp27蛋白的表达水平降低(P0.05);E2作用转染ERβsiRNA的BCPAP细胞24 h,与E2处理组相比,Hsp27蛋白的表达水平升高(P0.05);Ch IP结果显示ERα能够与Hsp27基因启动子区域结合。结论 E2可以通过ERα促进BCPAP细胞中Hsp27蛋白水平的增高。     

17-β雌二醇提高巯醇抗氧化物(酶)治疗脊髓损伤的作用

目的探讨17-β雌二醇治疗脊髓损伤的分子机制,为临床应用雌激素治疗脊髓损伤提供理论依据。方法成年雄性SD大鼠180只,采用改良的Allen法构建大鼠急性脊髓挫伤模型后经17-β雌二醇治疗,采用化学比色法测定脊髓组织中丙二醛(MDA)和内源性巯醇抗氧化物(酶):还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量;免疫组织化学分析凋亡相关因子Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达变化。结果17-β雌二醇治疗组与脊髓损伤组比较,BBB评分明显增加;在多个时间点MDA含量明显降低;巯醇抗氧化物(酶)GSH、SOD和GSH-Px含量显著增加;Caspase-3和Bax表达的阳性细胞数明显减少;Bcl-2表达的阳性细胞数明显增加(P0.05)。结论大剂量的17-β雌二醇治疗可能通过调控内源性巯醇抗氧化物(酶),提高肢体运动功能,抑制细胞凋亡,从而减轻脊髓损伤程度。     

17β-雌二醇对子宫内膜间质细胞体外分泌趋化因子IL-8、MIP-1α、RANTES和I-309的影响

目的：探讨17β-雌二醇对子宫内膜间质细胞分泌IL-8、MIP-1α、RANTES和I-309的调控，以解析雌激素在子宫内膜异位症发生发展中的作用机制。方法：用不同浓度17β-雌二醇处理子宫内膜间质细胞48小时；此后选用10^-9mol／L 17β-雌二醇处理子宫内膜间质细胞12、24、36和48小时，ELISA法分析刺激前后培养上清中IL-8、MIP-1α、RANTES和I-309分泌水平。结果：子宫内膜间质细胞体外高水平自然分泌IL-8，17β-雌二醇能抑制IL-8的分泌，呈剂量依赖性。RNATES和MIP-1α分泌水平较IL-8低，经雌激素刺激子宫内膜间质细胞后MIP-1α表现出与IL-8相同的分泌方式，但对RANTES分泌无明显影响。子宫内膜间质细胞经雌激素刺激前后均未检测到I-309。结论：雌二醇可能参与子宫内膜白细胞和单核巨噬细胞的募集，但不是异位灶中上述趋化因子高表达的原因。     

17-β雌二醇提高巯醇抗氧化物（酶）治疗脊髓损伤的作用 

目的 探讨17-β雌二醇治疗脊髓损伤的分子机制,为临床应用雌激素治疗脊髓损伤提供理论依据。 方法 成年雄性SD大鼠180只,采用改良的Allen法构建大鼠急性脊髓挫伤模型后经17-β雌二醇治疗,采用化学比色法测定脊髓组织中丙二醛（MDA）和内源性巯醇抗氧化物（酶）：还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量;免疫组织化学分析凋亡相关因子Caspase-3、Bcl2和Bax蛋白的表达变化。 结果 17-β雌二醇治疗组与脊髓损伤组比较,BBB评分明显增加;在多个时间点MDA含量明显降低;巯醇抗氧化物（酶）GSH、SOD和GSH-Px含量显著增加;Caspase-3和Bax表达的阳性细胞数明显减少;Bcl2表达的阳性细胞数明显增加（P<0.05）。 结论 大剂量的17-β雌二醇治疗可能通过调控内源性巯醇抗氧化物（酶）,提高肢体运动功能,抑制细胞凋亡,从而减轻脊髓损伤程度。     

α-玉米赤霉醇干预骨质疏松性骨折模型大鼠白细胞介素1、6的表达

背景：α-玉米赤霉醇是一种新的植物雌激素,可能具有动物雌激素的某些生理功能。 目的：观察植物雌激素α-玉米赤霉醇对骨质疏松性骨折大鼠白细胞介素1和白细胞介素6表达的影响。 方法：切除40只6月龄雌性SD大鼠双侧卵巢建立去卵巢骨质疏松模型,造模成功后锯断右侧胫骨建立骨折模型,骨折1周,分别灌胃0.066 mg/kg雌二醇、10,5,1 mg/kg α-玉米赤霉醇及二甲基亚砜;另取10只大鼠,不切除卵巢,制备骨折模型后灌胃二甲基亚砜。给药35 d,ELISA法测定大鼠血清白细胞介素1和白细胞介素6的表达。 结果与结论：去卵巢后,骨折大鼠血清白细胞介素1和白细胞介素6的表达明显升高,5,1 mg/kg α-玉米赤霉醇及0.066 mg/kg雌二醇均可明显降低骨质疏松性骨折大鼠血清白细胞介素1和白细胞介素6的表达,但10 mg/kg α-玉米赤霉醇作用效果不显著。说明α-玉米赤霉醇可以剂量依赖性地降低骨质疏松性骨折大鼠血清白细胞介素1和白细胞介素6的表达。     

17α雌二醇对转基因细胞株(APP/PS1N2a)β-淀粉样蛋白生成的影响

目的 探讨17α雌二醇（ESUB>2/SUB>α）对稳定表达人β-淀粉样前体蛋白（APP）/早老因子-1（PS1）即APP /PS1基因的神经母细胞瘤细胞株（Neuro-2a）（APP/PS1 NSUB>2/SUB>a）β-淀粉样蛋白（Aβ）产生的影响及可能机制。方法 将APP/PS1 NSUB>2/SUB>a细胞用10×10SUP>-9/SUP> mol/L E2α预处理2d,更换培养液后,分别进行如下处理：1.加入不同浓度ESUB>2/SUB> a（25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L）和溶媒（对照组）,用免疫印迹法(Western blotting)检测APP/PS1 NSUB>2/SUB> a细胞内和细胞外的Aβ蛋白水平及细胞BACE1蛋白水平;2.加入 100nmol/L ESUB>2/SUB>α、20nmol/L葡萄糖和5mIU葡萄糖氧化酶（GOX）。24h后,进行二氢乙啶(DHE)染色观察APP/PS1 N2a细胞中活性氧（ROS）含量的变化。结果 不同浓度E2α（25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L）处理后,细胞外Aβ蛋白水     

骨髓间充质干细胞来源成骨细胞培养体系中加入α-玉米赤霉醇干预后的骨保护素表达***

背景：研究显示α-玉米赤霉醇对绝经后骨质疏松症具有明显的防治作用。 目的：观察α-玉米赤霉醇对体外大鼠成骨细胞骨保护素分泌及其mRNA表达的影响。 方法：将体外培养的成骨细胞中分别加入雌激素和α-玉米赤霉醇(10-5~10-10 mol/L)进行干预。 结果与结论：ELISA法和RT-PCR检测发现,不同浓度的α-玉米赤霉醇(10-5~10-10 mol/L)作用于成骨细胞后,骨保护素的分泌量及细胞骨保护素mRNA表达较对照组均增加(P < 0.05)。结果证实,在骨髓基质细胞来源的成骨细胞中加入α-玉米赤霉醇可促进成骨细胞骨保护素的分泌及其mRNA的表达。     

雌激素通过调节MSC分泌细胞因子影响其对DC成熟与功能的抑制

目的:本研究试图检测不同浓度17β雌二醇(F2)存在的情况下人胎肺间充质干细胞(MSC)增殖和表型的变化,并分析这种状态的MSC对树突状细胞(DC)成熟和功能影响及其可能的机制.方法:分离培养人胎肺MSC,加入不同浓度E2,在24小时后对MSC进行细胞计数、测定其增殖和贴壁能力,并用流式细胞仪分析MSC表面标志,RT-PCR测定MSC中细胞因子(IL-6、TGF-β和VEGF)mRNA的表达情况.进一步探讨了E2处理24小时后的MSC对DC成熟和功能的影响.结果:分离得到的MSC纯度达到95%以上;E2影响MSC的增殖和贴壁能力,但不影响MSC表面标记的表达;MSC与DC共培养后DC表面CD86、MHCⅡ和CD80的表达均有所降低,而当DC与经E2预处理过的MSC共培后,DC表面MHCⅡ、CD80和CD86的表达回升;高浓度E2作用MSC 24小时后,MSC表达的TGF-β与对照组相比减少,而IL-6和VEGF与对照组相比增加.结论:E2可能通过调节MSC分泌细胞因子的水平,改变MSC对DC的免疫抑制作用.     

17β-雌二醇对高同型半胱氨酸诱导人成骨肉瘤MG63细胞损伤的保护作用及机制

目的 探讨17β-雌二醇(17β-E2)对高同型半胱氨酸(HHcy)诱导人成骨肉瘤MG63细胞损伤的保护作用及其分子机制.方法 体外培养的人成骨肉瘤MG63细胞经17β-E2干预后,再以不同浓度和(或)不同时间的HHcy处理后,采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸盐(H2DCFDA)探针检测细胞内活性氧(ROS)水平变...