舟山眼镜蛇毒细胞毒素的分离纯化及其体外抗肿瘤活性

目的从眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素 F(CTX F)并鉴定其活性。方法应用凝胶过滤、离子交换柱色谱及疏水柱色谱等方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化CTX F ,以SRB法观察CTX F对体外培养癌细胞的杀伤作用。结果眼镜蛇毒粗毒经凝胶过滤获得 4个蛋白峰 ,将CTX所在第Ⅳ峰用阳离子交换柱色谱获A、B、C、D、E、F和G等7个组分 ,其中E、F和G具CTX活性 ,将F组分再经凝胶过滤和疏水色谱进一步纯化得不含磷酯酶A2 (PLA2 )的CTX纯品 ,暂定名为CTX F ,它对多种癌细胞株有杀伤作用。结论应用凝胶过滤、离子交换和疏水色谱等方法可从眼镜蛇毒中获得不含PLA2 的CTX ,其组分F有抗肿瘤活性     

舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆及原核表达

目的构建舟山眼镜蛇毒细胞毒素（Cytotoxin,CTX）原核表达载体（pET42α（＋）-CTX）,并在大肠杆菌中表达CTX重组蛋白。方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素（CTX）,测定N-末端氨基酸序列并据此设计引物,以提取的舟山眼镜蛇毒腺总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增细胞毒素基因序列（CTXcDNA）。将CTXcDNA定向克隆到原核表达载体pET42α（＋）中,双酶切图谱、PCR和DNA测序鉴定,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物,GSTrap FF亲和层析纯化融合蛋白CTX;Western-blotting鉴定。结果成功合成CTXcDNA,并构建原核表达质粒pET42α（＋）/GST-CTX,在大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白CTX,SDS-PAGE凝胶浓度扫描显示表达量占菌体总蛋白的28.9%,Western-blotting证实纯化蛋白为重组CTX融合蛋白（rCTX）。结论成功构建CTX基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得rCTX具有眼镜蛇毒CTX的抗原性。     

福建眼镜王蛇蛇毒柱层析分离及生化药理特性

应用CM—Sephadex C—50离子交换柱层析分离福建眼镜王蛇毒,获得17个蛋白峰。该蛇毒具有磷脂酶A_2、蛋白水解酶、精氨酸酯酶、L-氨基酸氧化酶、胆碱酯酶、磷酸单酯酶和磷酸二酯酶等酶活力。组分Ⅰ,Ⅳ对ADP诱导的兔血小板聚集功能有抑制作用,组分Ⅰ还有降压作用,组分Ⅳ则有心脏毒性作用。Ⅵ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅸ,Ⅹ,Ⅺ和Ⅻ等7个组分具突触后神经毒活性,组分ⅩⅫ呈现局部出血效应,粗毒及各组分对家兔血浆的复钙时间和凝血酶时间无影响。     

眼睛蛇毒心脏毒素对大鼠心肌细胞收缩及细胞内钙离子的作用

目的 研究眼睛蛇毒心脏毒素（Cardiotoxin,CTX）对心肌细胞的形态、收缩幅度和细胞内钙离子（[Ca^2＋]i）的作用。方法 应用荧光计量法（以Fura-2／AM为荧光染料）及光学成像系统来测定单个心肌细胞[Ca^2＋]i和收缩幅度。结果 0．001～1μmol／L的CTX使心肌细胞由杆状变成圆形,药物的作用从第1分钟时开始,到第20分钟时趋于稳定。在电刺激存在的情况下,1μmol／L的CTX最初导致电诱导的[Ca^2＋]i和收缩幅度瞬间增加,接下来[Ca^2＋]i时程延长,最终细胞对电刺激不敏感、突然收缩、[Ca^2＋]i持续增高。在缺乏电刺激的情况下,1μmol／L的CTX可诱导Ca^2＋震荡波、持续性[Ca^2＋]i增高,这种作用与40mmol／L的KCl和10mmol／L咖啡因所引起的[Ca^2＋]i瞬间增加不同。结论 CTX作用初期使[Ca^2＋]i增高,使细胞[Ca^2＋]。超载,同时伴随细胞形状的改变。     

眼睛蛇毒心脏毒素对大鼠心肌细胞收缩及细胞内钙离子的作用

目的研究眼睛蛇毒心脏毒素(Cardiotoxin,CTX)对心肌细胞的形态、收缩幅度和细胞内钙离子([Ca²⁺]_i)的作用。方法应用荧光计量法(以Fura-2/AM为荧光染料)及光学成像系统来测定单个心肌细胞[Ca²⁺]_i和收缩幅度。结果0.001～1μmol/L的CTX使心肌细胞由杆状变成圆形,药物的作用从第1分钟时开始,到第20分钟时趋于稳定。在电刺激存在的情况下,1μmol/L的CTX最初导致电诱导的[Ca²⁺]_i和收缩幅度瞬间增加,接下来[Ca²⁺]_i时程延长,最终细胞对电刺激不敏感、突然收缩、[Ca²⁺]_i持续增高。在缺乏电刺激的情况下,1μmol/L的CTX可诱导Ca²⁺震荡波、持续性[Ca²⁺]_i增高,这种作用与40mmol/L的KC l和10mmol/L咖啡因所引起的[Ca²⁺]_i瞬间增加不同。结论CTX作用初期使[Ca²⁺]_i增高,使细胞[Ca²⁺]_i超载,同时伴随细胞形状的改变。     

蛇毒抗肿瘤蛋白心脏毒素的分离纯化与鉴定

目的:对蛇毒抗瘤蛋白的活性组分进行分离与鉴定。方法:采用 RP-HPLC 分离蛇毒抗瘤蛋白各组分,收集纯化组分Ⅱ。RP-HPLC 及 SDS-PAGE 测定组分Ⅱ的纯度;MALDI—TOF 质谱仪测定组分Ⅱ的相对分子质量;对组分Ⅱ进行 N-末端氨基酸序列测定。结果:蛇毒抗瘤蛋白组分Ⅱ经 RP-HPLC 和 SDS-PAGE 分析为单一成分,MALDI-TOF 质谱仪测得其相对分子质量为6719.49,其 N-末端氨基酸序列为 L-K-C-N-K-L-V-P-L-F-Y-K-T-C-P。结论:经分离鉴定,蛇毒抗瘤蛋白组分Ⅱ为心脏毒素。     

~(131)I-眼镜蛇毒细胞毒素14在大鼠体内的分布

用~(131)I按氯胺T法标记眼镜蛇毒细胞毒素14,观察其在大鼠体内的分布,静脉给药后0.5h,分布最多的是肾,每mg组织放射性达5979dpm,为对照组的14倍,肝、脾、胰、肾上腺亦有较高分布,给药后2h,脑组织亦见分布,其每mg组织放射性为50dpm,是对照组的3倍。     

抗眼镜王蛇毒卵黄抗体的免疫活性及其对眼镜王蛇毒的中和作用

目的：探讨抗眼镜王蛇毒卵黄抗体的免疫活性及其在体内外对眼镜王蛇毒的中和作用。方法：采用嗜硫色谱法一步分离纯化抗眼镜王蛇毒卵黄抗体,通过间接ELISA法对制备的抗眼镜王蛇毒卵黄抗体进行免疫活性检测,采用小鼠体内外保护实验评估抗眼镜王蛇毒卵黄抗体对眼镜王蛇毒的中和作用。结果：嗜硫色谱法制备的卵黄抗体具有良好的免疫活性,并且对眼镜王蛇毒素显示较好的中和效应,在体外6mg/kg抗眼镜王蛇毒卵黄抗体可有效地中和约4LD50（约1.6mg/kg）的眼镜王蛇毒素,而在体内可有效地中和约3LD50（约1.2mg/kg）的眼镜王蛇毒素。结论：抗眼镜王蛇毒卵黄抗体对眼镜王蛇毒具有良好的中和作用,本项目为抗眼镜王蛇毒卵黄抗体的进一步研究开发提供实验依据。     

广西眼镜蛇毒细胞毒素-1对人肝星状细胞LX2的选择性抑制作用

<正>肝纤维化是肝硬化、肝癌和肝功能衰竭的共同病理基础和必经阶段,特征是肝内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是合成ECM的关键细胞,因此抑制其增殖并诱导其凋亡是抗肝纤维化的关键~[1]。细胞毒素(cytotoxin,CTX)是眼镜蛇毒的主要     

蛇毒心脏毒素诱导肺癌A549细胞的凋亡机制研究

目的:研究眼镜蛇心脏毒素(CTX)诱导肺癌A549细胞凋亡的机制。方法:MTT法测定CTX体外细胞毒性作用;吉姆萨染色法观察CTX对A549细胞形态学的影响;线粒体膜电位(JC-1)法检测CTX诱导A549细胞后细胞JC-1的变化;流式细胞仪检测CTX对A549细胞凋亡的影响;Western blot法测定细胞色素C、凋亡蛋白酶前体(Procaspase)-3、Procaspase-9的表达;通过S180小鼠肉瘤模型检测CTX体内抗肿瘤活性。结果:CTX作用于A549细胞的半数抑制浓度(IC50)为0.770μg/ml;0.5、1.0、2.0μg/ml CTX可引起A549细胞明显缩小,在高倍镜下可观察到胞核皱缩,形成染色质边集等形态学改变;流式细胞仪检测到CTX使A549细胞出现凋亡,并且具有量效关系;5μg/ml CTX作用于A549细胞0.5 h可使细胞JC-1降低;胞浆中检测到细胞色素C时,Procaspase-9的含量没有明显变化,随后逐渐减少,CTX诱导细胞凋亡具有时效关系;体内抑瘤实验显示在剂量为0.5、1.0、2.0 mg/kg时CTX对A549细胞有明显的抑制作用。结论:CTX对A549细胞有细胞毒性,可以使线粒体内细胞色素C释放,并激活Procaspase-9和Procaspase-3诱导A549细胞的凋亡。     

中华眼镜蛇毒组分F的体外抗血管生成活性研究

目的研究中华眼镜蛇毒组分F对血管内皮细胞黏附功能的抑制作用和体外的抗血管生成活性。方法MTT快速测定法测定组分F对原代培养的血管内皮细胞对纤维蛋白原(Fg)、纤连蛋白(Fn)、Matrigel的黏附作用的影响;采用平面拟毛细血管生成培养法,观察组分F对血管生成的抑制效应。结果组分F可抑制血管内皮细胞的黏附功能,对细胞黏附Fn、Fg和Matrigel 3种物质的作用从1.2μg/ml浓度起即有抑制效应(P<0.05),且均呈浓度依赖性,组分F对细胞黏附Fg和Matrigel的抑制作用较其对Fn的作用强(P<0.05);组分F可抑制内皮细胞在培养基质中生成血管样网状结构的反应,并且随浓度的不同抑制程度有明显不同。结论中华眼镜蛇毒组分F具有体外抗血管生成活性。     

眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶分离纯化及对血管内皮细胞的抑制作用

目的从眼镜蛇毒中分离纯化L-氨基酸氧化酶(L-a-mino acid oxidase of Naja atra venom,NAV-LAAO),观察其对血管内皮细胞是否有抑制作用。方法应用阳离子交换层析和亲和层析方法分离纯化NAV-LAAO;采用MTT法、Western blot测定caspase及细胞小管形成实验观察NAV-LAAO对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长和血管生成的影响。结果眼镜蛇毒粗毒经两步层析法得到的LAAO,分子量约为58 ku。NAV-LAAO抑制HUVEC细胞的生长和细胞小管形成,其抑制细胞生长的IC50为21.42 mg.L-1。与对照组相比,LAAO组caspase-3、caspase-8升高。结论应用两步层析法从眼镜蛇毒中分离出的NAV-LAAO具有剂量依赖性的抑制HUVEC细胞的生长和影响细胞小管形成的作用。     

舟山眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化及镇痛作用研究

目的从舟山眼镜蛇毒中分离纯化神经毒素,并测定其部分理化性质及镇痛活性。方法应用SP-Sephadex C-50离子交换色谱法分离眼镜蛇毒粗毒,用Sephadex G-50凝胶过滤色谱、CM-Sephadex C-25离子交换色谱纯化神经毒素;SDS-PAGE(Tris-Tricine系统)鉴定纯度;用Meier方法测定毒性;用热板法观察神经毒素的镇痛作用。结果应用SP-Sephadex C-50离子交换柱层析,从舟山眼镜蛇毒中分离得到14个蛋白峰,其中6个组分(NNAV-Ⅶ ~Ⅻ)经鉴定为含有神经毒素组分,将神经毒活性最强的组分XI经Sephadex G-50、CM-Sephadex C-25纯化得神经毒素纯品NTⅪ。该纯品分子量12.3kD,小白鼠静脉注射和腹腔注射的LD50分别为1.9875、2.2217 mg·kg-1。NTXI能显著提高小鼠对热板刺激的痛阈。腹腔注射0.2mg·kg-1NTXI可使小鼠的热板痛阈提高84.35%。NTXI的镇痛作用具有时效性,给药后2h起效,4h作用达峰值。结论舟山眼镜蛇毒中分离得到一个神经毒素纯品NTⅪ,具有镇痛作用。     

分离纯化眼镜蛇蛇毒因子的一种经济方法

将较大批量的眼镜蛇粗毒依次通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５，ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅＤＥ５２和Ｂｉｏ－ＧｅｌＰ２００柱层析可高效地分离纯化眼镜蛇蛇毒因子（ＣＶＦ），５０ｇ粗毒可制备电泳纯ＣＶＦ９６０ｍｇ，产率大大高于既往文献报道，整个制备过程仅需时数日。通过ＳＤＳ聚内烯酰胺凝胶电泳测得其分子量为２２６０００，其溶血活性从抗补体活性均与文献报道相近。所以，本实为一种经济，高效的实验室大量制备ＣＶＦ的方法。     

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子在大肠杆菌中的表达

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌(E.coli)中表达广西眼镜蛇(黑眼镜蛇)蛇毒神经生长因子(NGF)成熟蛋白并检测其生物活性。方法将天然广西眼镜蛇蛇毒的NGF蛋白基因克隆至融合表达载体pET-40b(+)中,以C端融合了6个组氨酸的形式在E.coli BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表达NGF蛋白。超声破菌后,将上清液经Ni~(2+)-NTA柱纯化,收集并冻干NGF融合蛋白,用蛋白印迹法分析其NGF抗原活性,并通过促PC12细胞生长法观察其生物活性。结果经蛋白印迹分析可知在38 ku处的条带具有NGF抗原活性。加入天然蛇毒NGF,生长轴突的PC12细胞为(83±3)%,重组品为(21±3)%,表明经纯化的融合蛋白具有NGF生物活力,但活性弱于天然蛇毒NGF。结论在大肠杆菌中可以表达出有活性的蛇毒NGF蛋白。     

中华眼镜蛇毒F组分对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :研究中华眼镜蛇毒F组分对血管平滑肌细胞增殖的影响。方法 :用体外培养的血管平滑肌细胞 ,观察F组分对 2 0 %小牛血清引起的细胞对氚标胸腺嘧啶核苷酸 (H3 TdR)掺入的影响 ,用蛋白质免疫印迹法 (Westernblotting)测定F组分对 2 0 %小牛血清引起的细胞内原癌基因、核增殖抗原 (Pro liferationcellnuclearantigen ,PCNA)表达的影响。结果 :F组分呈浓度依赖性抑制 2 0 %小牛血清引起的细胞对H3 TdR掺入率和细胞内C myc、PCNA的表达 ,其中 30、10 0mg·L-1给药组与对照组比较有显著差异 (P <0 .0 5 )。结论 :中华眼镜蛇毒F组分通过影响细胞内原癌基因C myc、PCNA的表达 ,抑制血管平滑肌细胞的增殖     

眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶活性检测方法的优化

目的 优化眼镜蛇毒L-氯基酸氧化酶（L—amino acid oxidase of Naja atra venom,NAV-LAo）酶活性测定方法。方法采用邻联茴香胺（ODA）、邻苯二胺（0PD）和3．3’,5．5＇-四甲基联苯胺（TMB）三种供氩体测定NAV-LAO的活性并比较其灵敏度和重复性。结果OPD方法测定L-氮基酸氧化酶酶活性的检测限为O．0025mg·mL^-1．相对标准偏差（RSD）为2．1％。结论OPD方法测定NAV-LAO活性具有较好的灵敏度和稳定性。     

中华眼镜蛇毒组分F/H对大鼠心肌细胞缺氧-再给氧损伤的作用探讨

以Laarse方法建立大鼠心肌细胞缺氧-再给氧模型．缺氧缺糖60min．再给氧1h．探讨组份F和H对实验性心肌细胞缺血再灌注的保护作用。实验结果显示,缺氧后心肌细胞成活率显著减少,心肌释放LDH含量显著增加．细胞膜流动性下降,缺氧再给氧后上述各指标改变加剧。组份F和H能明显提高心肌细胞成活率,减少LDH的释放．增加细胞膜流动性．减少心肌细胞膜的损伤,实验结论,组份F和H有明显抗心肌细胞缺氧-再给氧损伤的作用,尤以组份F作用更显著。     

中华眼镜蛇毒组分CⅡ对多药耐药肿瘤细胞的抑制作用

目的:研究中华眼镜蛇毒组分CⅡ(FCⅡNNAV)对多药耐药KBv200和K562/A02细胞的抑制作用。方法:应用MTT法观察FCⅡNNAV对KB、KBv200、K562和K562/A02细胞的毒性作用,DNALadder和流式细胞仪观察FCⅡNNAV体外诱导K562/A02凋亡的作用。结果:FCⅡNNAV对KB和耐药KBv200细胞以及K562和耐药K562/A02细胞均有抑制作用,IC50分别为0.87±0.15和1.07±0.08、0.67±0.11和0.75±0.01μg·ml-1。DNALadder和流式细胞仪检测FCⅡNNAV能明显诱导细胞K562/A02凋亡。结论:FCⅡNNAV对敏感细胞KB、K562及耐药细胞KBv200、K562/A02均有较强的抑制作用,FCⅡNNAV能明显诱导耐药K562/A02细胞凋亡,这可能是其抗肿瘤多药耐药机制之一。