HSV携带BDNF基因重组体促进大鼠脊髓损伤修复的实验研究

目的探讨人单纯疱疹病毒(HSV)携带脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组体对脊髓损伤(SCI)的治疗效果。方法构建绿色荧光蛋白(GFP)标记的HSV-BDNF转基因重组体,通过坐骨神经注射使其转运入损伤脊髓运动神经元。用BBB评分观察大鼠后肢运动功能变化,探讨BDNF对损伤脊髓运动神经元的保护作用。结果 GFP标记的HSV-BDNF注入坐骨神经后5d能运输到脊髓腹角运动神经元。BDNF转基因治疗可减轻SCI带来的神经元损害,增加神经元存活数量并阻止胞体萎缩,同时改善大鼠后肢运动行为(P<0.05)。结论 HSV携带BDNF基因是一种有效治疗脊髓损伤的备选方法。     

脑损伤大鼠运动皮质BDNF的表达变化

目的观察创伤性脑损伤(TBI)大鼠脑组织运动皮质脑源性神经营养因子(BDNF)表达变化并探讨其与神经行为学的关系。方法成年SD大鼠分假手术对照组和自由落体脑外伤组(TBI组),每组13只。TBI后1、3、8、13d分别进行大鼠神经功能缺损评分(NSS)。术后7d处死大鼠,取损伤处脑组织行RT-PCR检测BDNFmRNA表达;术后13d处死大鼠,取损伤处脑组织行免疫组化和原位杂交检测BDNF表达。结果 TBI后大鼠神经行为明显受损,NSS评分较假手术组增加(P<0.05),但随时间延长NSS评分有所下降(P<0.05)。RT-PCR结果显示,BDNF mRNA表达水平TBI组和假手术组差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化和原位杂交染色结果显示,BDNF蛋白和mRNA主要分布在皮质神经元,阳性细胞数量明显减少(P<0.05),而细胞内BDNF的光密度值则明显增加(P<0.05)。结论 TBI后大鼠神经功能有一定恢复,其机制可能与备用神经元内BDNF的表达水平上调有关。     

大鼠促红细胞生成素重组腺病毒载体的构建及其在大鼠SGNs中的表达

目的构建大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)重组腺病毒载体,并转染于体外培养的大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)。方法全基因合成大鼠EPO基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-EPO。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PacⅠ酶切线性化后电转化感受态细胞,获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO,经PacⅠ酶切后转染至293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。并转染至体外培养的螺旋神经元,免疫荧光检测及蛋白水平检测螺旋神经元中EPO表达。结果经KpnⅠ、HindⅢ酶切与测序鉴定显示,腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO构建成功,重组腺病毒AdEPO在293细胞中成功包装,扩增后病毒滴度为1.17×1011U/ml;经RT-PCR和Western blot检测EPO在293细胞中成功表达。重组腺病毒载体AdEPO经鉴定均构建正确;免疫荧光及Western blot检测转染腺病毒后螺旋神经元中EPO表达显著增强。结论成功构建了EPO重组腺病毒载体,并成功转染螺旋神经元,可显著增强螺旋神经元中EPO表达水平。     

BDNF基因逆转录表达载体的构建和在淋巴细胞中的表达

【目的】构建含脑源性神经营养因子基因(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNFgene)逆转录表达载体并了解其在淋巴细胞中的表达,探讨治疗基因的非损伤性脑内转移的新途径。【方法】用RT-PCR方法从大鼠海马组织总RNA中扩增(cDNA)BDNF片段,应用基因重组技术将大鼠(cDNA)BDNF克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒进行鉴定,采用LipofectAMINE将重组大鼠(cDNA)BDNF导入PA317细胞,获取高滴度的病毒上清转染大鼠淋巴细胞,应用流式细胞仪(FCM)检测大鼠淋巴细胞BDNF的表达,噻唑蓝(MTT)法检测淋巴细胞培养上清对PC12细胞增殖的影响。【结果】扩增出大鼠(cDNA)BDNF片段,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pLXSN-BDNF,BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达BDNF蛋白,其培养上清能促进PC12细胞增殖。【结论】成功构建了BDNF基因逆转录表达载体,BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达和分泌具有生物活性的BDNF蛋白,为治疗基因的非损伤性脑内转移奠定了一定基础。     

BDNF基因转染促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的: 将脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)基因转入骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC),使其作为种子细胞和基因治疗的载体将BDNF基因导入脊髓损伤组织,为探索一种更为有效的脊髓损伤治疗方法提供实验基础。方法: 分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞;实验组应用已构建的pEGFP-N1-BDNF进行基因转染,空质粒组用pEGFP-N1空质粒进行转染,阴性对照组只加入培养基,并进行Western 印迹分析;将转染BDNF的实验组、转染空质粒组和未转染的阴性对照组细胞在体外向神经元样细胞诱导分化,比较3组细胞诱导后神经元样细胞分化率,并进行统计学分析。结果: 流式细胞检测培养细胞CD90(+),CD44(+), CD34(-)、CD45(-);经Western印迹检测证实实验组MSC表达BDNF-EGFP;实验组细胞向神经元样细胞分化率高于空质粒组和未转染的阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论: BDNF基因转染MSC后,可以促进其向神经元样细胞分化,BDNF在MSC向神经元样细胞分化过程中具有重要作用。     

BDNF基因逆转录表达载体的构建和在淋巴细胞中的表达

【目的】构建含脑源性神经营养因子基因(brain-derived neurotrophic factor，，BDNF gene)逆转录表达载体并了解其在淋巴细胞中的表达，探讨治疗基因的非损伤性脑内转移的新途径。【方法】用RT-PCR方法从大鼠海马组织总RNA中扩增(cDNA)BDNF片段，应用基因重组技术将大鼠(cDNA)BDNF克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒进行鉴定，采用Lipofect AMINE将重组大鼠(cDNA)BDNF导入PA317细胞，获取高滴度的病毒上清转染大鼠淋巴细胞，应用流式细胞仪(FCM)检测大鼠淋巴细胞：BDNF的表达，噻唑蓝(MTT)法检测淋巴细胞培养上清对PCI2细胞增殖的影响。【结果】扩增出大鼠(cDNA)BDNF片段，限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pLXSN．BDNF，BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达：BDNF蛋白，其培养上清能促进PCI2细胞增殖。【结论】成功构建了BDNF’基因逆转录表达载体，BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达和分泌具有生物活性的BDNF蛋白，为治疗基因的非损伤性脑内转移奠定了一定基础。     

大鼠睫状神经节神经营养因子真核表达载体转染成肌细胞并促其分化

目的应用DNA重组技术构建大鼠睫状神经节神经营养因子(CNTF)真核表达载体,再稳定转染肌源性干细胞,分析转染的肌源性干细胞能否稳定表达CNTF、并向神经元样细胞分化,为深入研究CNTF的功能及动物体内试验打下理论基础。方法用RT-PCR扩增大鼠带有Xho I和BamH I双酶切位点的CNTF cDNA片段,经双酶切获得的目的片段,再与双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组质粒转化E.coli DH5α感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。采用脂质体转染法,参照Lipofectamine2000试剂盒(LF2000I,nvitrogen公司)说明书,采用阳离子脂质体介导两组质粒(pEGFP-C3-CNTF和pEGFP-C3)转染成肌细胞。通过RT-PCR分析CNTF mRNA在成肌细胞中的表达,用神经元特异性蛋白(NES)免疫组化染色法鉴定是否有神经元样细胞分化,并于显微镜下计数阳性细胞占细胞总数的比例。结果通过PCR扩增成功获得了CNTF cDNA目的片段,大鼠CNTF真核表达载体构建成功,并成功转染成肌细胞,被转染的成肌细胞稳定表达CNTF并显著分化为神经元样细胞、实验组显著高于对照组(P<0.05),差异有统计学意义。结论大鼠CNTF真核表达载体pEGFP-C3-CNTF可以成功构建,并可转染大鼠成肌细胞,经转染的成肌细胞能有效表达大鼠的CNTF,且转染的成肌细胞显著分化为神经元样细胞,为研究大鼠CNTF在神经损伤修复方面的实验奠定了重要基础。     

HGF基因重组腺病毒载体构建及其转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响

目的构建携带大鼠肝细胞生长因子(HGF)基因的重组腺病毒载体,并转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测其在BMSCs的表达、以及对BMSCs增殖和迁移的影响。方法利用全基因合成方法得到目的基因HGF序列,将HGF基因片段与穿梭质粒pDC316-mCMV-增强绿色荧光蛋白(EGFP)连接,构建含有目的基因的pDC316-mCMV-EGFP-HGF重组质粒,经过病毒包装及扩增,获得带有荧光报告基团EGFP与HGF基因的重组腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP-HGF。将pDC316mCMV-EGFP-HGF重组腺病毒载体转染BMSCs细胞,通过ELISA检测HGF表达水平,CCK-8法检测BMSCs增殖能力,Transwell法检测BMSCs迁移。结果构建了表达HGF基因和荧光报告基因EGFP的重组腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP-HGF,转染BMSCs后,BMSCs细胞HGF表达水平、增殖及迁移均明显高于非转染组(P<0.05)。结论成功构建pDC316-mCMV-EGFP-HGF重组腺病毒载体,可以介导HGF在BMSCs中稳定表达,并提高BMSCs增殖及迁移能力。     

七叶皂苷对体外培养大鼠神经元生长的作用及其与BDNF的关系

目的探讨七叶皂苷对体外培养大鼠大脑皮质神经元生长的作用及其与脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体(TrkB)的关系.方法取新生SD大鼠大脑皮质进行神经元原代培养,随机分为正常组、对照组和七叶皂苷组.七叶皂苷组加入20 mg/mL七叶皂苷(生理盐水稀释),对照组加入等量生理盐水,正常组不作任何处理.显微镜下观察各时间点(24 h、48 h)神经元数目、胞体面积、突起长度.采用MTT检测细胞活力.RT-PCR检测BDNF和TrkB mRNA的表达.结果正常组、对照组各时间点神经细胞数、胞体面积、突起长度及细胞活力无明显差异(P>0.05),但随时间点延长,各指标明显增加(P<0.05).七叶皂苷组各指标均明显高于正常组、对照组(P<0.05).BDNF和TrkBmRNA在正常组、对照组各时间点上无明显差异(P>0.05),而七叶皂苷组明显高于正常组、对照组(P<0.05).结论七叶皂苷可促进SD大鼠脑源性神经元的生长,其作用可能与上调BDNF及TrkB的表达有关.     

针刺对卒中后抑郁大鼠行为学及海马、皮质、杏仁核中 BDNF、GFAP表达水平的影响

目的观察针刺对卒中后抑郁(PSD)大鼠行为学改变及脑组织中脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达水平的影响,探讨针刺治疗PSD的机制。方法从60只雄性SD大鼠中随机选取10只入正常组,其余造模。采用大脑中动脉线拴阻塞法复合慢性不可预知的温和应激法建立大鼠PSD模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、针刺组、氟西汀组。针刺组针刺百会(GV20)、风府(GV16)、神门(HT7)、太冲(LR3),每日1次,氟西汀组每日1次灌胃(2 mg/kg),均连续治疗3周。实验过程中观察各组大鼠的行为学改变,蛋白免疫印迹法检测海马、皮质、杏仁核BDNF、GFAP蛋白的表达情况;RT-PCR法检测海马、皮质、杏仁核BDNF、GFAP mRNA的表达情况;通过透射电镜观察脑组织内星形胶质细胞超微结构的改变。结果与正常组比较,模型组大鼠海马、皮质、杏仁核的BDNF、GFAP蛋白及BDNF、GFAP mRNA表达水平增加(P0.01或P0.05);与模型组相比,针刺组与氟西汀组大鼠海马、皮质、杏仁核中BDNF、GFAP蛋白及BDNF、GFAP mRNA表达水平增高(P0.01)。结论针刺可以改善PSD大鼠的症状,其作用机制可能与针刺提高大鼠海马、皮质和杏仁核BDNF、GFAP的表达,增强星形胶质细胞ATP的释放,进而改善神经元损伤,促进神经元再生有关。     

大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

 【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA，使用RT—PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-T Simple载体测序，将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中，然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno—X^TM腺病毒骨架中。Lipofectamine^TM 2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒，少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增。蛋白电泳及Western blot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒。并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。     

腺病毒介导的BDNF基因脊髓内转移对神经根损伤后神经元内酶的影响

目的 观察神经根损伤后进行BDNF基因治疗对神经元的保护作用。方法 在神经根缝合基础上，通过无创注射将复制缺陷重组腺病毒载体直接转移至大鼠神经根损伤部相应的脊髓腹角。分别于术后l、3、7、L4、28d比色法测定AChE和ACP酶活性的变化。结果 AXCA—BDNF组伤后AChE比活性高于损伤组，而ACP活性均低于损伤组。AXCA—BDNF能够降低酶的变化幅度。结论 神经根重建结合BDNF基因治疗可明显减轻神经元的损伤程度，是一种新的有效的治疗方法。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的:利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的原核表达载体pBV220/mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法:制备重组质粒pGEM-T/hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果:重组原核表达质粒pBV220/mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论:成功构建了原核表达载体pBV220/mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

HSV1-TK基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的:构建含单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV1-TK)基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,制备重组腺相关病毒rAAV2/HSV1-TK,并检测HSV1-TK基因在转染晶状体上皮细胞中的整合和表达,为后囊膜混浊的基因治疗奠定基础.方法:用基因重组技术构建含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,并通过PCR和酶切鉴定;将该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选出携带该质粒的载体细胞株BHK-21/TK,在辅助病毒的参与下包装成重组病毒rAAV2/HSV1-TK;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和高效液相色谱(HPLC)法检测重组病毒rAAV2/HSV1-TK的纯度,用斑点杂交法检测重组病毒的滴度;重组病毒rAAV2/HSV1-TK转染兔晶状体上皮细胞N/N1003A,用PCR和RT-PCR检测HSV1-TK基因的整合和表达.结果:经PCR和酶切鉴定重组质粒pSNAV2.0-TK构建成功;成功制备了重组病毒rAAV2/HSV1-TK,病毒滴度达1×1012v.g./mL;重组病毒转染N/N1003A细胞后,PCR和RT-PCR检测显示HSV1-TK基因在细胞中整合并且有效表达.结论:成功构建了含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒,制备了高滴度重组病毒rAAV2/HSV1-TK,HSV1-TK基因在转染该病毒的晶状体上皮细胞中可有效表达.     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的：利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子（human brain-derived neurotrophic factor, hBDNF）的原核表达载体pBV220／mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法：制备重组质粒pGEM-T／hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果：重组原核表达质粒pBV220／mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论：成功构建了原核表达载体pBV220／mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

重组共表达载体pSNAV2.0 HSV1tkIREShIL1Ra的构建及其在滑膜细胞中的表达

   目的引入内部核糖体进入位点（IRES）,构建HSV1 tk与hIL 1Ra双基因共表达AAV重组载体并检测其在滑膜细胞中的表达。方法PCR扩增HSV1 tk、IRES及hIL 1Ra基因片段,分别与pMD18 T simple载体连接,测序后,hIL 1Ra与HSV1 tk先后插入pMD IRES,构建重组质粒pMD HSV1 tk IRES hIL 1Ra,酶切出HSV1 tk IRES hIL 1Ra片段,克隆至AAV载体质粒pSNAV2.0上,构建成重组共表达质粒pSNAV2.0 HSV1 tk IRES hIL 1Ra,酶切鉴定后,用脂质体转染上述质粒至原代骨关节炎（OA）滑膜细胞,RT PCR法鉴定共表达质粒在滑膜细胞中的表达。结果酶切鉴定证实重组共表达质粒构建正确;RT PCR检测到转染后的OA滑膜细胞中表达HSV1 tk与hIL 1Ra。结论成功构建了重组共表达质粒pSNAV2.0 HSV1 tk IRES hIL 1Ra;重组质粒转染OA滑膜细胞后,能表达HSV1 tk与hIL 1Ra。这为OA的基因治疗研究提供了理论依据。     

腺病毒介导的脑源性神经营养因子表达对大鼠损伤脊髓轴突的保护作用

目的：研究腺病毒介导的脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）基因在大鼠损伤疹髓内的表达规律,观察外源性ＢＤＮＦ对损伤脊髓的作用。方法：利用激光束描记位移的重力打击装置,制备可靠 的定量损伤模型;以直接法将带有ＢＤＮＦ基因表达框的复制制陷重组腺病载体直接转移至大鼠损伤脊髓,用Ｘ－Ｇａｌ染色检测基因转移有效性,并观察损伤轴突计量形态学改变,抽伤脊髓ＢＤＮＦｍＲＮＡ表达,ＢＤＮＦ和神经中丝（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｎ     

Protective effect of adenovirus-mediated BDNF gene expression on spinal axon following in rats after spinal cord injury

The routine treatments of spinal cord injury are palliative in Practice at Present. Their goal is only to preventthe secondal injeq and the complications, and then thepatients to adapt new life style under palalysis condition.The sprouting and the Plasticity of the neims in foe centlal nervous system (CNS) Of malnlnals has been ProVedll]. It is wen known that the neurntrOPhins facilitatethe renovation and regenerahon of the ne~ns in CNS after injuries. HoweVer the c~ive effect Of the ne…