MS-275阻断STAT3和NF-κB信号通路并诱导U266细胞凋亡机制的探讨

于G0/G1期;瑞氏-姬姆萨染色显示,细胞发生明显变化;蛋白质印迹法检测表明,MS-275作用U266细胞后, PARP发生剪切,导致细胞凋亡;对细胞凋亡相关信号通路STAT3及NF-κB检测结果表明,STAT3,IκB-α发生磷酸化水平受到明显抑制.结论:MS-275对U266细胞的杀伤作用主要是通过诱导细胞凋亡实现,与细胞增殖相关的STAT3及NF-κB信号通路被阻断是凋亡发生的机制之一.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对人骨髓瘤U266细胞生长的影响及其可能机制

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)MS-275对人骨髓瘤细胞U266的凋亡抑制基因生存素(survivin)和核因子-κB(NF-κB)表达的影响.方法 台盼蓝拒染法观察MS-275对细胞活力的影响;瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析细胞周期;Western blot检测survivin、p21、细胞周期依赖激酶4(CDK4)和NF-κB的抑制蛋白(IKB-α)等的表达,以及凋亡信号通路中caspase-3活化及蛋白聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解情况.结果 MS-275抑制U266细胞增殖,阻断细胞周期于G0/G1期,呈时间-剂量依赖性.MS-275作用U266细胞48 h的IC50为1.39μmol/L.2 μmol/L MS-275作用U266细胞24 h后,G0/G1期细胞所占比例为(64.57±4.09)%;作用36 h后,G0/G1期细胞所占比例为(87.20±2.83)%;瑞氏-姬姆萨染色显示,U266细胞形态发生明显变化.Western blot检测表明,MS-275作用U266细胞后,survivin和CDK4表达下降,p21表达增加,IκB-α磷酸化水平受到明显抑制,caspase-3被裂解活化,其底物蛋白PARP发生剪切,细胞发生凋亡.结论 MS-275可诱导人骨髓瘤细胞系U266凋亡,NF-κB信号通路阻断是凋亡发生的机制之一.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275诱导骨髓瘤细胞株U266凋亡过程中Survivin的表达

背景与目的：组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors,HDACi）是-类具有抗肿瘤活性的新型药物,主要通过诱导细胞凋亡发挥作用。本实验研究HDACi（MS-275）对人骨髓瘤细胞系U266细胞增殖和凋亡的影响及其与Survivin表达的关系。方法：将不同浓度的MS-275作用于U266细胞不同时间后,用台盼蓝拒染法观察药物对细胞活力的影响：通过瑞氏-姬姆萨染色观察药物作用后细胞形态学的变化;用流式细胞仪分析细胞周期;用Westernblot检测Survivin、P21和Cdk4等的蛋白表达,以及凋亡信号通路中Caspase-3活化及蛋白聚ADP核糖聚合酶[poly（ADP—ribose）polymerase,PARP]的裂解情况。结果：MS-275呈时间和剂量依赖性抑制U266细胞增殖,阻断细胞周期于G0／G1期。MS-275作用U266细胞48h时的Ic50为1．39μmol／L：2μmol／L的MS-275作用U266细胞24h后,G／G,期细胞占66．39％．36h后G0／G1期细胞占89．80％。瑞氏-姬姆萨染色显示细胞形态发生明显变化。Western blot检测结果显示。MS-275作用U266细胞后,Survivin和Cdk4表达下降,P21表达增加,Caspase3被裂解活化,其底物蛋白PARP发生剪切。结论：MS-275抑制人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖并诱导细胞凋亡,可能与下调Survivin蛋白的表达有关。     

HOTAIRM1靶向miR-129-5p对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的:研究长链非编码RNA HOTAIRM1（lncRNA HOTAIRM1）与微小RNA-129-5p（miR-129-5p）的靶向关系及其对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响。 方法:荧光定量PCR（qPCR）检测HOTAIRM1和miR-129-5p在人正常脑组织和胶质瘤组织中的表达。建立抑制HOTAIRM1表达细胞株,研究其对U251细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭;蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）、上皮钙黏素（E-cadherin）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）水平。生物学信息预测和双荧光素酶报告基因法分析HOTAIRM1和miR-129-5p之间的靶向关系。共转染si-HOTAIRM1和anti-miR-129-5p,观察抑制miR-129-5p表达对抑制HOTAIRM1表达诱导的U251细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。 结果:HOTAIRM1在胶质瘤组织中的表达明显上调（P<0.05）,miR-129-5p表达下调（P<0.05）。抑制HOTAIRM1表达显著降低U251细胞24 h、48 h、72 h的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白表达量（P<0.05）,明显增加U251细胞凋亡率和p21、Bax、E-cadherin蛋白表达量（P<0.05）。miR-129-5p是HOTAIRM1的靶基因。上调或下调HOTAIRM1表达明显调控miR-129-5p表达（P<0.05）。抑制miR-129-5p表达逆转了抑制HOTAIRM1表达对U251细胞24 h、48 h、72 h的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及Cyclin D1、MMP-2、Bcl-2蛋白表达的抑制作用,并逆转了抑制HOTAIRM1表达对U251细胞p21、E-cadherin、Bax蛋白表达和细胞凋亡率的促进作用。 结论:lncRNA HOTAIRM1通过靶向miR-129-5p影响胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。     

STIP1在脑胶质瘤组织中的表达及对胶质瘤细胞株增殖、凋亡、侵袭的影响

目的:检测磷酸化应激诱导蛋白1（stress-induced phosphoprotein 1,STIP1）在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异,探讨STIP1对胶质瘤细胞株U87、U251细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法:运用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、免疫组化及蛋白印迹检测胶质瘤组织和正常脑组织中STIP1的表达;小干扰RNA（STIP1-siRNA）转染U87、U251细胞株后,使用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Transwell小室观察细胞的增殖、凋亡和侵袭能力。结果:STIP1在胶质瘤Ⅳ级组织中的表达明显高于正常脑组织,但在胶质瘤Ⅱ、Ⅲ级中的表达与正常脑组织无明显差异。U87、U251细胞株转染STIP1-siRNA后,细胞增殖和侵袭能力明显受到抑制,而细胞凋亡率明显上升。结论:STIP1在胶质母细胞瘤组织中高表达,下调STIP1可以抑制胶质瘤细胞株U87和U251的增殖,阻滞细胞周期,促进其细胞凋亡,并可抑制其侵袭力。     

Prucalopride通过促进自噬抑制胶质瘤细胞U251增殖

目的:研究Prucalopride对胶质瘤U251细胞增殖、自噬、凋亡的影响,并探讨其相关信号通路。方法:通过CCK8检测细胞增殖的变化;Transwell检测迁移和侵袭的变化;细胞流式实验、Western blot检测细胞凋亡的变化;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1、p62的表达;AKT/mTOR通路相关蛋白的变化。结果:CCK8显示Prucalopride显著抑制U251细胞的增殖（P＜0.05）;Transwell侵袭实验显示Prucalopride可以抑制脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭（P＜0.05）;细胞流式实验显示Prucalopride促进U251细胞的凋亡（P＜0.05）,Prucalopride处理后细胞凋亡相关蛋白Bax、Active Caspase3水平升高,Bcl-2表达降低;自噬相关蛋LC3、Beclin1表达上调,p62表达下调;p-AKT蛋白和p-mTOR蛋白水平显著降低。结论:Prucalopride通过抑制AKT/mTOR信号通路激活自噬抑制U251细胞增殖和迁移,促进其凋亡。     

EZH2基因沉默对人脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡影响的研究

目的:研究RNA干扰技术抑制zeste基因增强子人类同源物2(EZH2)的表达对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响.方法:构建靶向EZH2基因的shRNA质粒并转染至U251细胞中,采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测EZH2 mRNA和蛋白的表达情况,利用四甲基偶氮哇盐(MTT)实验和Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验观察转染后U251细胞增殖和凋亡情况.结果:靶向EZH2基因的shRNA质粒成功抑制了U251细胞EZH2基因的表达,mRNA和蛋白表达抑制率分别为56.00％和88.73％;转染shRNA EZH2后,U251细胞的生长受到明显抑制(P＜0.01),在转染96 h后,生长抑制率达35.79％;转染48 h后,U251细胞早、晚期凋亡率分别为(26.59±0.83)％和(38.63±0.80)％,较阴性质粒组和空白对照组均增加,以晚期明显,差异有统计学意义,P＜0.01.结论:EZH2基因的沉默能有效抑制胶质瘤U251细胞的增殖、促进其凋亡,提示EZH2可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点.     

EGCG对因子Ⅶa促进SW620细胞增殖与迁移的干预作用及机制

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对因子Ⅶa促进SW620细胞增殖与迁移的干预作用及机制。方法用EGCG、因子Ⅶa等处理SW620细胞,应用流式细胞术、Transwell法分别检测细胞增殖周期及迁移能力;Western blotting检测细胞NF-κB抑制蛋白(IκB-α)、核NF-κB(p65/RelA)的蛋白水平变化。结果 EGCG(100 mg/L)能干预因子Ⅶa对SW620细胞增殖与迁移的促进作用;EGCG能抑制因子Ⅶa对IκB-α表达的下调作用及对核NF-κB(p65/RelA)表达的促进作用。结论 EGCG可能通过干预信号分子IκB-α和NF-κB(p65/RelA)的表达和调节作用,抑制因子Ⅶa对SW620细胞增殖与迁移的促进作用。     

NF-κB抑制剂QNZ对人胶质瘤细胞生物学功能的影响

目的:探究NF-κB抑制剂QNZ对人胶质瘤细胞系U251生物学功能的影响。方法:胶质瘤U251细胞中加入QNZ处理,用CCK8法、Transwell实验、流式细胞术和Western blot检测细胞增殖、侵袭、凋亡以及Caspase-3的表达。结果:QNZ处理后绘制出生长曲线,发现胶质瘤细胞增殖受到抑制。QNZ降低U251细胞的侵袭性。不同浓度QNZ处理后,U251细胞凋亡增加,与QNZ浓度有相关性。QNZ处理后细胞周期被阻滞于G2期。结论:QNZ抑制胶质瘤细胞U251的增殖和细胞侵袭力,促进凋亡并阻滞细胞周期进展,为胶质瘤治疗提供新的思路。     

shRNA结合131I-免疫脂质体抑制胶质瘤细胞U251增殖的初步研究

目的 探索RNA干扰与131I-免疫脂质体联用在胶质瘤疾病治疗中的潜在价值.方法 在合成pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢ-shRNA表达载体的基础上,结合核素内放射性131I免疫脂质体,进行细胞实验探索其对胶质瘤细胞U251增殖凋亡的影响.结果 成功构建pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢ-shRNA载体;同时细胞实验结果显示,shRNA和131I免疫脂质体联用有效抑制胶质瘤细胞U251增殖和促进其凋亡,抑制率达70％.结论 shRNA结合131I免疫脂质体能高效地促凋亡和抑制细胞增殖,为其在胶质瘤治疗中的应用奠定了初步基础.     

Enhanced radiation-induced cell killing and prolongation of gammaH2AX foci expression by the histone deacetylase inhibitor MS-275

Histone deacetylase (HDAC) inhibitors are undergoing clinical evaluation for cancer therapy. Because HDAC modulates chromatin structure and gene expression, parameters considered to influence radioresponse, we have investigated the effects of the HDAC inhibitor MS-275 on the radiosensitivity of two human tumor cell lines (DU145 prostate carcinoma and U251 glioma). Acetylation status of histones H3 and H4 was determined as a function of time after MS-275 addition to and removal from culture medium. Histone acetylation increased by 6 h after MS-275 addition, reaching a maximum between 24 and 48 h of exposure; providing fresh drug-free medium then resulted in a decrease in histone acetylation that began by 6 h and approached untreated levels by 16 h. Treatment of cells with MS-275 for 48 h followed by irradiation had little or no effect on radiation-induced cell death. However, exposure to MS-275 before and after irradiation resulted in an increase in radiosensitivity with dose enhancement factors of 1.9 and 1.3 for DU145 and U251 cells, respectively. This MS-275 treatment protocol did not result in a redistribution of the cells into a more radiosensitive phase of the cell cycle or in an increase in apoptosis. However, MS-275 did modify the time course of gammaH2AX expression in irradiated cells. Whereas there was no significant difference in radiation-induced gammaH2AX foci at 6 h, the number of cells expressing gammaH2AX foci was significantly greater in the MS-275-treated cells at 24 h after irradiation. These results indicate that MS-275 can enhance radiosensitivity and suggest that this effect may involve an inhibition of DNA repair.     

HIF-1α对胶质瘤U251细胞增殖及侵袭的影响

目的：探讨氯化钴（CoCl2）模拟化学缺氧复氧中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白的表达及其对人胶质瘤U251细胞增殖及侵袭的影响。方法：在培养基中加入和去除CoCl2模拟化学缺氧和缺氧复氧,采用免疫印迹法（Western blot）检测CoCl2与HIF-1α蛋白表达关系;通过MTT、过河实验、黏附试验分别检测细胞侵袭、迁移运动能力和黏附能力。结果：人胶质瘤U251细胞中存在HIF-1α蛋白表达;在CoCl2模拟缺氧的时-效关系实验中,100μmol/L CoCl2刺激细胞6h、12h、24h时HIF-1α蛋白呈递增（分别为1.024±0.03、2.35±0.04、2.82±0.12）（P〈0.05）,24h达高峰,48h明显下降（1.82±0.05）。同时,在量-效关系实验中,CoCl250μmol/L、100μmol/L和150μmol/L刺激细胞24h时HIF-1α蛋白呈递增（分别为1.78±0.03、1.81±0.03、2.12±0.12）（P〈0.05）;MTT发现CoCl2诱导的缺氧对细胞增殖起抑制作用;过河实验发现缺氧24h复氧24h后细胞的迁移运动能力增加;细胞黏附实验发现缺氧24h复氧24h后细胞的黏附力增加。结论：CoCl2能诱导人胶质瘤U251细胞HIF-1α蛋白过度表达,而且存在一定的时-效关系;经CoCl2诱导的缺氧后复氧,肿瘤细胞增殖能力下降,细胞的迁移运动能力和黏附能力增加。     

SGPL1在神经胶质瘤组织中的表达及其对细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨SGPL1在神经胶质瘤组织中的表达及其对神经胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:在TCGA及PROGgene在线数据库中分析SGPL1在神经胶质瘤临床肿瘤组织及正常神经组织中的表达差异,并分析其表达与神经胶质瘤预后生存的关系;在神经胶质瘤细胞系U251和U87中分别敲降和过表达SGPL1,通过RT-qPCR和Western blot实验分别检测SGPL1的mRNA和蛋白表达水平;用CCK-8法、细胞克隆形成实验检测SGPL1敲降和过表达后细胞增殖变化;通过流式细胞术和caspase3/7酶活性试剂检测分析细胞凋亡变化,Western blot实验检测caspase3、PARP及CyclinD1等凋亡相关蛋白的表达;ELISA检测细胞内S1P含量;RT-qPCR检测S1PR5的表达水平;RNA-seq分析SGPL1在神经胶质瘤细胞中调控的信号通路;Western blot实验检测SGPL1敲降和过表达后Phospho-p38-MAPK、Phospho-ERK、Phospho-STAT3及Phospho-NF-κB(p65)的表达变化。结果:TCGA及PROGgene在线数据库分析表明SGPL1在神经胶质瘤组织中高表达并与神经胶质瘤患者的预后生存成负相关。在U251中敲降SGPL1后细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加;在U87细胞中过表达SGPL1后能显著促进细胞的增殖能力。SGPL1表达对S1P信号通路无明显影响;RNA-seq结果表明SGPL1在神经胶质瘤细胞内调控细胞增殖死亡信号通路,SGPL1敲降和过表达可影响p38-MAPK、ERK、STAT3及NF-κB(p65)等细胞增殖生长信号的变化。结论:SGPL1在神经胶质瘤组织中高表达并与生存预后负相关。在神经胶质瘤细胞内SGPL1可调控p38-MAPK、ERK、STAT3及NF-κB(p65)等细胞增殖生长信号通路,其表达可影响神经胶质瘤细胞的增殖和凋亡,可能是一个潜在的肿瘤标志物和治疗的分子靶点。     

DNA甲基化对miR-133a表达及胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨miR-133a在胶质瘤细胞中的表达及DNA甲基化对其的调控机制并初步探究miR-133a对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法:通过RT-PCR检测胶质瘤组织与正常对照脑组织中miR-133a的表达差异;MSP实验检测胶质瘤组织与正常对照脑组织中miR-133a基因甲基化程度;BSP实验检测正常胶质细胞株HEB与胶质瘤细胞株A172、U87、U251中miR-133a基因的甲基化水平;去甲基化试剂AZA与胶质瘤细胞株A172、U87、U251共培养72 h后,RT-PCR检测上述3株胶质瘤细胞中的miR-133a表达变化;MTT及Annexin V-FITC凋亡实验分别检测AZA处理后的3株胶质瘤细胞的增殖与凋亡能力变化。结果:RT-PCR实验表明与正常对照脑组织相比,胶质瘤组织中miR-133a表达显著下降;MSP实验结果显示,与正常对照脑组织相比,胶质瘤组织中miR-133a基因的甲基化水平明显增高;BSP实验结果显示与正常对照胶质细胞株HEB相比,胶质瘤细胞A172、U87、U251中miR-133a基因的甲基化水平显著增加;RT-PCR实验显示与去甲基化试剂AZA共培养72 h后,胶质瘤细胞株A172、U87、U251细胞中miR-133a的表达显著增加。MTT与Annexin V-FITC凋亡实验结果表明,去甲基化试剂AZA处理后,胶质瘤细胞A172、U87、U251的增殖能力明显下降,细胞的凋亡发生率显著增加。结论:胶质瘤细胞中DNA甲基化通过调控miR-133a的表达而沉默后者发挥抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡的功能。     

替莫唑胺联合干扰素α/β治疗胶质瘤移植瘤的实验研究

背景与目的:6-氧甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(06-methylguanine-DNA-methyl transferase,MGMT)是肿瘤对甲基化类药物耐药的重要原因之一.替莫唑胺(temozolomide,TMZ)常规方案对MGMT阳性胶质瘤的化疗效果不理想.本实验在动物体内观察干扰素α/β(interfero...     

Notch1 promotes glioma cell migration and invasion by stimulating β-catenin and NF-κB signaling via AKT activation

The Notch signaling pathway has been implicated in both developmental processes and tumorigenesis. Aberrant Notch signaling has been repeatedly demonstrated to facilitate the proliferation and survival of glioma cells by regulating downstream effectors or other signaling pathways. In glioblastoma multiforme specimens from 59 patients, Notch1 was highly expressed in tumor tissues compared with normal brain tissues, and this expression was correlated with elevated AKT phosphorylation and Snail expression. Increased nuclear localization of β-catenin and p50 as well as enhanced IKKα/AKT interaction were also observed in glioma tissues. In U87MG cells, the activation of Notch1 by DLL4 stimulation or by the overexpression of Notch intracellular domain (NICD) resulted in AKT activation and thereby promoted β-catenin activity and NF-κB signaling. Inhibition of EGFR partially blocked the β-catenin and NF-κB signaling stimulated by Notch1 activation. Furthermore, NICD overexpression in U87MG cells led to the upregulated expression of several metastasis-associated molecules, which could be abrogated by the knockdown of either β-catenin or p50. In U87MG and U251 cells, DLL4-induced cellular migration and invasion could be inhibited by either β-catenin or a p50 inhibitor. Collectively, these results indicate that Notch activation could stimulate β-catenin and NF-κB signaling through AKT activation in glioma cells. Thus, Notch activation-stimulated β-catenin and NF-κB signaling synergistically promote the migratory and invasive properties of glioma cells.     

碱性成纤维细胞生长因子小分子干扰RNA对胶质瘤细胞株U251增殖与凋亡的影响

背景与目的:碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)家族中的重要一员,bFGF是多功能细胞因子,参与创伤愈合、组织修复、未成熟神经细胞的增殖和分化过程.本课题组前期对bFGF在胶质瘤中的表达做过研究,证实bFGF在胶质瘤细胞中过表达,并刺激胶质瘤细胞的增殖和新生血管生成.本研究检测bFGF小分子干扰RNA对胶质瘤细胞的增殖和凋亡的影响.方法:用化学法合成四条针对bFGF的siRNA和一条阴性对照siRNA,并用脂质体法转染胶质瘤细胞系U251;以Opti-MEM I无血清培养基培养的U251细胞作为正常对照.通过RT-PCR和免疫组化的方法检测bFGF的表达,并用流式细胞术、MTT法检测转染后U251细胞的凋亡和增殖活性的变化.结果:转染48 h后,正常对照、阴性对照、siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3和siRNA-4组U251细胞中的bFGF mRNA水平分别为0.95 0.02、0.95±0.02、0.85 0.02、0.76±0.04、0.65±0.04和0.56±0.03;转染72 h后,分别为0.95±0.04、0.89±0.05、0.81±0.05、0.80±0.05、0.77±0.04和0.53±0.05.四条bFGF siRNA中,siRNA-4作用最显著.转染48 h后,siRNA-4和阴性对照组细胞增殖抑制率分别为(66.4±1.2)%和(56.3±1.4)%;转染72 h后,分别为(40.0±2.6)%和(14.7±0.6)%,siRNA-4与阴性对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05).结论:理想的bFGF小分子干扰RNA 能够抑制该基因的表达并抑制胶质瘤细胞的增殖活性.