铜绿假单胞菌检出特殊1型整合子结构

1型整合子是造成铜绿假单胞菌广泛耐药的重要原因,其基本结构为：5＇端保守序列（1型整合酶）-特异识别位点（attI或attC）-3＇端保守序列（qacE△1耐药基因盒-sul1耐药基因盒）,在5＇端与3＇端之间可插入其他耐药基因盒,并将其整合在其中,形成各种组合的多重耐药整合子.我院对感染监测中分离的1株铜绿假单胞菌NB03012进行了检测。     

耐药性播散机制进展——整合子-基因匣子系统

整合子 -基因匣子系统是近年在细菌中发现的天然克隆与表达系统 ,能捕获外来耐药基因 ,在整合子中形成多种耐药基因的组合、排列 ,是细菌耐药性播散的机制之一 ,对细菌及质粒基因组的进化具有重要意义。本文对整合子 -基因匣子系统的结构特征、基因匣子的移动性与表达、整合子的流行病学及超整合子等方面进行综述。     

细菌耐药机制的研究热点--整合子系统

在探讨细菌耐药机制的研究中 ,用基因突变和耐药性质粒介导细菌耐药性来解释似乎不够完全。近年来 ,细菌耐药机制———整合子 (integron)系统得到研究者们的广泛注意〔1〕,并取得了很大的进展。细菌通过整合子系统 ,通过整合酶的作用 ,捕获外来的耐药基因 ,并在位于整合子上游的启动子的作用下得到表达 ,使细菌具有耐药及多重耐药性。本文就近年国外相关文献及我们在对印度霍乱弧菌整合子分析的基础上 ,对整合子介导细菌耐药特性的研究进展进行简述。1 整合子的结构和分类整合子的基本结构由 1个编码整合酶 (integrase)的intⅠ基因、2个基…     

一株铜绿假单胞菌中检出两种新的整合子

目的研究铜绿假单胞菌多重耐药的临床分离株RJ217中发现的两个新整合子的结构，并分析其在多重耐药性中的作用。方法用改良三相试验分析RJ217产β-内酰胺酶的情况，用常规和长片段PCR法扩增耐药基因和整合子，并对PCR产物进行序列分析。结果发现铜绿假单胞菌RJ217携带两个新的整合子，其中一个携带veb-I型超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因，这两个整合子的结构分别为IS10-like-veb-I-aadB-oxa10／aadA1和aadB-oxa10／aadA1。结论整合子介导的耐药基因在RJ217的多重耐药性中发挥了重要的作用。     

泛耐药鲍曼不动杆菌整合子Ⅰ和ISCR1结构及基因分型研究

目的研究从临床分离的鲍曼不动杆菌的整合子Ⅰ和ISCR1的分布及结构情况,并对其进行基因分型。方法分离自临床的57株鲍曼不动杆菌,PCR检测整合酶Ⅰ、整合子Ⅰ、ISCR1以及ISCR1可变区,PCR产物进行限制性片段长度多态性（RFLP）分型并进行测序分析可变区携带的耐药基因盒,ERIC-PCR进行基因分型。结果 49株整合酶I阳性,其中47株整合子I扩增阳性,RFLP分为2型,测序结果为aacA4-catB8-aadA1和drf17-aadA5。3株ISCR1以及ISCR1可变区扩增均阳性,可变区经RFLP分为1型,测序结果为orf513-qnrA1-ampR-qacEdeltal,ISCR1阳性菌整合子I均阳性,经ERIC-PCR检测将57株鲍曼不动杆菌分为27个基因型。结论Ⅰ类整合子广泛存在于鲍曼不动杆菌中,ISCRI携带率较低,氨基糖苷类、甲氧苄啶类和β-内酰胺类耐药基因盒较常见,ERIC-PCR可用于临床鲍曼不动杆菌的分子流行病学研究。     

三类整合酶基因(intⅠ)的简并引物PCR方法建立及应用

目的建立一种筛选第一、二和三类整合酶基因(intⅠ)的简并引物PCR方法，并对临床菌株进行整合子筛选和分类。方法用梯度PCR方法确定PCR反应的最适退火温度，并对16株临床标本进行PCR扩增，通过对阳性PCR扩增产物的限制性内切酶分析进行整合子分类。结果根据梯度PCR结果确定最适退火温度为46℃。应用简并引物PCR法检测16株临床分离株，其中8株阳性，经酶切分类后确定其中4株只含有第一类整合酶基因，有3株含有第二类整合酶基因，1株同时含有第一类和第二类整合酶基因。结论建立了一种同时筛选第一、二和三类整合子的方法，实际检测显示其可行性，为全面细致研究整合子介导的细菌耐药提供了一种快速、简便的方法。     

临床分离产IMP-1型金属酶非发酵菌的耐药机制研究

从临床收集耐亚胺培南的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌共50株,进行头孢他啶和2-巯基乙醇的表型协同试验(CAZ ME),然后进行金属酶IMP-1基因的PCR检测。选取IMP-1阳性株测序,用PCR方法检测有无一类整合子基因(IntI1)。表型的检测发现有28株为协同阳性,其中铜绿假单胞菌27株,鲍曼不动杆菌1株。PCR和测序检测出其中一株铜绿假单胞菌含有IMP-1基因,同时也含有IntI1基因。首次在中国西部地区发现产IMP-1型金属酶、同时也含有一类整合子的铜绿假单胞菌,对于临床上研究细菌的耐药性传播具有重要意义。     

先天性甲状腺功能减低症一家系DUOX2基因突变检测

目的对一个先天性甲状腺功能减低症家系进行二元氧化酶2(DUOX2)基因突变研究。方法对该家系中4名成员采样并提取DNA,用wafergen验证检测先证者甲状腺过氧化物酶(TPO)基因、二元氧化酶2(DUOX2)基因和二元氧化酶成熟因子2(DUOXA2)基因。PCR扩增先证者DUOX2基因各外显子、外显子-内含子交界区以及3'端和5'端非翻译区,以DNA测序技术检测DUOX2基因突变,并与该家系中其他成员进行对照分析。结果先证者为DUOX2基因c.3200CT突变和新的c.1708CT突变的复合杂合子,其父亲为c.1708CT突变杂合子,其母亲及胞姐均为c.3200CT突变杂合子。结论 DUOX2基因突变是中国人群先天性甲状腺功能减低症发生的原因之一。     

一个近亲婚配家系中的一种P基因新突变

目的在DNA水平上对1个有2例患者的姨表兄妹近亲婚配家系中的眼皮肤白化病患者进行分型诊断。方法用PCR扩增先证者P基因及TYR基因各外显子、外显子-内含子交界区及3＇端和5＇端非翻译区，以DNA序列测定技术检测基因突变，以DNA测序技术和限制性内切酶酶切法检测该家系其他成员及群体中正常人的相应基因位点。结果先证者和其白化病妹妹为P基因A787T突变纯合子，其父母和表型正常的弟弟均为A787T突变杂合子。先证者TYR基因未见突变。群体中102名表型正常者中无A787T突变等位基因。结论在基因水平确定我国存在眼皮肤白化病Ⅱ型，同时发现了一种P基因病理性新突变。     

先天性甲状腺功能减低症一家系DUOXA2基因突变分析

目的对一个先天性甲状腺功能减低症家系进行二元氧化酶成熟因子2(DUOXA2)基因突变研究。方法对该家系中4名成员采样并提取DNA,用wafergen验证检测先证者甲状腺过氧化物酶(TPO)基因、二元氧化酶2(DUOX2)基因和二元氧化酶成熟因子2(DUOXA2)基因。PCR扩增先证者DUOXA2基因各外显子、外显子-内含子交界区以及3′端和5′端非翻译区,以DNA测序技术检测DUOXA2基因突变,并与该家系中其他成员进行对照分析。结果先证者为DUOXA2基因c.413_414ins A突变和c.537CA突变的复合杂合子,其父亲及胞姐均为c.537CA突变杂合子,其母亲为c.413_414ins A突变的杂合子。结论 DUOXA2基因突变是中国人群先天性甲状腺功能减低症发生的原因之一。     

沙门菌中第一类整合子的鉴定及特性分析

目的　基于整合子在细菌耐药机制中的重要作用 ,对来自正常人体内耐药沙门菌的整合子分布及其结构特征进行分析。方法　应用PCR方法 ,设计第一类整合酶基因intI1和耐药基因盒的特异性引物 ,用PCR方法检测整合子阳性菌株并对其整合的耐药基因进行测序和序列分析。结果　发现 1株S .hadar和 3株S .tshiongwe为第一类整合酶阳性菌株。耐药基因盒进行扩增的结果 ,从 2株中分别得到 10 0 9bp的扩增产物。 1株得到 16 6 4bp的扩增产物。 1株菌得到 10 0 9bp和 16 6 4bp的扩增产物。序列分析结果表明 ,10 0 9bp的扩增产物为携带aadA2 ,对氨基糖苷类抗生素药物壮观霉素、链霉素产生耐药的基因盒 ;16 6 4bp为携带aadA5和dfr17,对氨基糖苷类抗生素药物壮观霉素、链霉素和磺胺类药物甲氧氨苄嘧啶产生耐药的基因盒。结论　首次揭示了健康人携带由整合子介导的耐药菌这一现象 ,提示我们要从基因水平上监测细菌的耐药情况     

肺炎克雷伯菌多重耐药机制的研究

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoni-ae,Kpn)是引起医院内感染的常见病原菌之一.用PCR法检测9种氨基糖苷类修饰酶基因、9种β-内酰胺酶编码基因及Ⅰ类整合酶基因并对整合子进行分析,采用纸片扩散法选出58株多重耐药的Kpn,测定对亚胺培南等17种抗菌药物的敏感性.     

人类溶菌酶基因突变可导致遗传性系统的淀粉样变性

本文对两个遗传性非神经系统淀粉样变性症(Ostertag型)家系患者进行了研究,首次报告引起人类溶菌酶及溶菌酶相关的变异疾病的分子基础。对此两家系所有个体的溶菌酶基因作序列分析发现,患者均为溶菌酶基因突变的杂合子,此突变可引起高度保守的氨基酸残基发生替换:家系1先证者的该基因第二外显子中存在T→C转换,此突变可     

嗜麦芽窄食单胞菌整合子I和ISCR1研究及ERIC-PCR基因分型

目的了解临床分离嗜麦芽窄食单胞菌的整合子I和ISCR1的分布情况及其基因型。方法分离临床85株嗜麦芽窄食单胞菌,用WHONET5.4分析菌株药敏情况,采用ERIC-PCR方法进行基因分型。采用PCR检测整合酶I、整合子I、ISCR1以及ISCR1携带的耐药基因。结果嗜麦芽窄食单胞菌对亚胺培南、氨曲南、庆大霉素、阿米卡星高度耐药,整合子I阳性菌株和整合子I阴性菌株对复方新诺明耐药性差异有统计学意义。85株嗜麦芽窄食单胞菌12株整合酶阳性,11株整合子I阳性,2株ISCR1和ISCRI携带的耐药基因阳性,ERIC-PCR分为75个基因型。结论整合子I在嗜麦芽窄食假单胞菌中介导复方新诺明耐药性方面有重要作用,ERIC-PCR是研究临床分离嗜麦芽窄食假单胞基因分型的有效方法之一。     

基于“乳头状试验”检测整合酶介导基因盒剪切频率方法的建立

整合子可通过位点特异性重组捕获外源基因盒并使之表达,同时整合子可位于质粒上,或自身作为转座子的一个组成部分而参与转移,使耐药基因发生播散[1-2].整合子因其在细菌耐药性基因水平传播中的重要作用而受到研究者的关注,然而到目前为止,整合酶催化的基因盒剪切与整合的具体机制仍有待阐明.     

产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中整合子与多重耐药的研究

目的探讨整合子介导的耐药机制在产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌多重耐药中的作用.方法5株产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离自2002年1月-2004年5月间我院呼吸科住院的患者,采用E-test试验条进行药敏试验、电转化试验,筛选、分离耐药质粒.PCR扩增Ⅰ型整合子基因盒插入序列,分子克隆和序列分析.结果所有产酶菌株通过电转化试验可将头孢西丁耐药性传递给受体菌,5个产AmpC酶耐药质粒中,有4个检出整合酶序列,其中3个携带2种抗药性基因盒,包括氨基糖苷乙酰转移酶基因aacA4;氨基糖苷腺苷转移酶基因aadA5;二氢叶酸还原酶基因dfrA17;氯霉素外排蛋白编码基因cmL44.结论整合子介导的抗药性基因盒参与了产质粒AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌多重耐药的形成,应引起高度重视.     

β地贫CD41-42突变杂合子复合缺失型α地贫双重杂合子的基因检测与血液学分析

目的了解β地中海贫血(地贫)CD41-42(-TCTT)杂合子(β41-42杂合子)复合缺失型α地贫双重杂合子在本地区β41-42杂合子个体中的检出情况及其临床血液学表现.方法分别采用单管多重PCR与反向点杂交法检测缺失型α地贫与β地贫基因,常规进行血细胞分析及其它地贫筛查试验.结果 144例β41-42杂合子有8例同时复合缺失型α地贫杂合子,其中7例(4.9%)携带有α地贫1基因(αα/--SEA),1例(0.69%)携带有缺失型HbH基因(-α3.7/--SEA).7例复合α地贫1患者的MCV均都高于另外136例单纯的β41-42杂合子的MCV平均值(63.53fl); 而对携带有HbH基因的样本进行pH8.6与6.5的血红蛋白电泳时都无法找到HbH区带.结论诊断β41-42杂合子复合α地贫双重杂合子的患者时,如只依赖其临床表现和常规的实验室检查结果作为筛查诊断的指标,容易会出现有病患的α或β地贫基因漏诊的情况.     

KIR3DL1基因启动子亚克隆及表达调控载体的构建

为研究KIR3DL1基因的表达调控机制,亚克隆KIR3DL1基因的核心启动子序列,并构建KIR3DL1基因启动子-荧光素酶报告载体,采用PCR法从含有KIR3DL1基因转录起始位点5'侧翼区的质粒中扩增KIR3DL1基因核心启动子序列,产物纯化回收后与pGEM-T easy载体连接,测序鉴定正确的重组子经限制性内切酶BglⅡ和NcoⅠ双酶切后,插入同样经BglⅡ和NcoⅠ双酶切的用于基因表达调控研究的pGL3-Basic报告载体,最终获得了长度为254bp的KIR3DL1基因启动子克隆,构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体.通过酶切及基因测序的方法证实所构建的重组子是正确的,说明KIR3DL1基因启动子表达调控载体的构建是成功的.     

临床分离产气克雷伯菌整合子和质粒介导的喹诺酮耐药基因分布特征分析

目的确定临床分离菌株产气克雷伯菌整合子、质粒介导的喹诺酮耐药(PMQR)基因的分布, 并分析整合子与临床常用抗菌药物耐药性的关系。方法收集2015年11月至2021年3月上海市奉贤区中心医院分离自临床样本中的产气克雷伯菌91株, PCR筛查第1、2类整合酶基因(intI1、intI2), 分析启动子类型和可变区基因盒组成结构。同时对分离株PMQR基因进行检测, 并分析整合子与临床常用抗感染治疗药物间的关系。结果 91株产气克雷伯菌对氨曲南耐药率>40.00%, 对其余常用抗菌药物耐药率均<35.00%。91株产气克雷伯菌中30株检出intI1, 未检出intI2。第1类整合子检出7种可变区基因盒组合, 在产气克雷伯菌中检出基因盒组合aac(6′)-11C-ΔereA2-IS1247-aac3-arr-ΔereA2。第1类整合子可变区启动子以活性较弱的PcH1启动子为主。intI1阳性菌株与intI1阴性菌株在ICU、神经外科和临床其他科室的检出率差异有统计学意义(P<0.05)。intI1阳性菌株对部分临床常用抗菌药物耐药率明显高于intI1阴性菌株(P<0.0...     

用PCR插入突变法扩增和克隆HIV—env282肽基因

本文报道借助于微机分析设计并合成了2个引物,通过聚合酶链反应插入突变法扩增出含有4个功能区(T肽区,与NLK部分同源区,显性中和位点及与CD4结合区)的HIV-env282肽基因,其5′端连有EcoR Ⅰ酶切位点和翻译起始码,3′端与终止码和BamH Ⅰ酶切位点相连。通过基因重组将其插入到大肠杆菌表达载体pBV220内并转化至宿主菌DH5α中,经电泳初筛、酶切分析和PCR鉴定,确定了一株含目的基因的重组菌,称之为pXW1。