核酶基因抑制肝癌细胞低氧诱导因子-1α表达的实验研究

目的探讨靶向HIF-1α核酶基因对肝癌细胞HIF-1α表达的调控。方法采用脂质体介导的方法，将靶向HIF-1α核酶基因真核表达载体转染肝癌细胞Hep3B2，并予低氧条件诱导。于转染后48h采用Western Blotting检测Hep3B2细胞中HIF-1α蛋白的表达水平；荧光报告基因方法检测HIF-1转录活性。结果Hep3B2细胞低氧诱导后，HIF-1α蛋白表达水平、HIF-1转录活性增高（1．0±0．02），转染核酶基因400μmol／L后48h，Hep3B2细胞低氧诱导的HIF-1α蛋白表达水平明显下降，HIF-1转录活性下调（0．12±0．025，P〈0．05）。结论核酶基因可特异性抑制低氧诱导的肝癌细胞HIF-1α表达，降低其转录活性。     

人脑胶质瘤低氧诱导因子-1α的基因表达

目的 从人脑胶质瘤中克隆低氧诱导因子－1α（HIF－1α）cDNA,探讨其对人脑胶质瘤发生、发展的作用。方法 从人脑胶质瘤组织中提取总RNA,以逆转发－多聚酶链反应（RT－PCR）方法扩增出全长2481bp的HIF－1α cDNA,经Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,将其与表达载体pWAV1连接,转化入E.coli JM109,建立HIF－1α的cDNA克隆;测序后与大鼠HIF－1αcDNA序列进行同源性分析。结果 RT－PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,可见一清晰特异扩增带,长2．5kb,HIF－1α cDNA经筛选、双酶切鉴定后,可见5．3kb的载体片段及2．5kb的插入片段。进行序列分析,与鼠有905的同源性。结论 HIF－1α已成功从人脑胶质瘤中得到克隆和序列分析。     

核酶基因抑制肝癌细胞低氧诱导因子-1α表达的实验研究

目的 探讨靶向低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)核酶基因对肝癌细胞HIF-1α表达的调控.方法 采用脂质体介导的方法,将靶向HIF-1α核酶基因真核表达载体转染肝癌细胞Hep3B2,并予低氧条件诱导.于转染后48 h采用Western Blotting检测Hep3B2细胞中HIF-1α蛋白的表达水平;荧光报告基因方法检测HIF-1转录活性.结果 Hep3B2细胞低氧诱导后,HIF-1α蛋白表达水平、HIF-1转录活性增高(1.0±0.02),转染核酶基因400 μmol/L后48 h,Hep3B2细胞低氧诱导的HIF-1α蛋白表达水平明显下降,HIF-1转录活性下调(0.12±0.025,P＜0.05).结论 核酶基因可特异性抑制低氧诱导的肝癌细胞HIF-1α的表达,降低其转录活性.     

低氧诱导因子-1α对脊髓损伤后血管内皮生长因子表达的调控作用

目的　研究腺病毒 (Ad)介导的低氧诱导因子 1α(HIF 1α)基因对脊髓损伤后血管内皮细胞生长因子 (VEGF)蛋白表达的影响 ,为HIF 1α基因治疗脊髓损伤提供依据。方法　改良Allen’s法制作大鼠脊髓损伤模型。SD大鼠随机分为 4组 :假手术组 (Sham )、单纯脊髓损伤对照组(SCI)、空载体对照组 (Ad Blank)、基因治疗组 (Ad HIF 1α)。分别在第 1、3、7、14、2 8天 5个时间点取组织切片 ,HE染色观察大鼠脊髓细胞形态 ,免疫组织化学法检测HIF 1α和VEGF蛋白的表达。结果　 (1)HE染色显示 ,Ad HIF 1α组出血、坏死等损伤性改变比SCI及Ad Blank组轻 ,细胞残留数目相对增多 ,形态大致正常。 (2 )Ad HIF 1α组的HIF 1α、VEGF免疫阳性细胞吸光度值较SCI及Ad Blank组增加明显 (P <0 .0 5 ) ,表达时间延长。结论　腺病毒介导的HIF 1α基因转移可在体内有效表达。HIF 1α基因可促进脊髓损伤后VEGF蛋白的表达。转HIF 1α基因可减少大鼠脊髓损伤后细胞的死亡。     

低氧诱导因子-1在骨折愈合过程中的调控作用

低氧诱导因子-1是调节氧稳态的核心转录因子,具有“开关性”的调节作用。近年发现,其在骨折愈合过程中对血管生成和骨系细胞具有调控作用,该文拟就此作一综述。     

低氧诱导因子-1与肝细胞癌

低氧诱导因子-1(HIF-1)是由两个亚基组成的异源二聚体蛋白,它特异性地与靶基因的低氧反应元件结合,并诱导各种靶基因转录,提高肿瘤细胞的缺氧适应能力,利于其生长、增殖、转移。其机制包括调节肿瘤细胞的代谢、促进肿瘤新生血管形成、抗肿瘤细胞凋亡等。针对HIF-1的治疗可能成为新的辅助抗癌手段。     

低氧诱导因子-1α与椎间盘退变

低氧诱导因子（HIF）‐1α是一种介导哺乳动物细胞内低氧反应的核转录复合体,对细胞增殖、迁移及凋亡等有重要调节作用,且在椎间盘细胞中明显表达。椎间盘退变是引起临床上颈肩痛和腰背痛的主要原因,其早期主要特征为髓核细胞数量减少甚至消失、细胞外基质成分合成与降解平衡紊乱。髓核细胞处于低氧环境中,细胞内合成的 HIF‐1α对其存活有重要作用,因此 HIF‐1α可能与椎间盘退变密切相关。该文就HIF‐1α与椎间盘退变研究进展作一综述。     

缺氧诱导乳鼠脊髓神经元HIF-1α表达和凋亡的体外实验研究

目的 研究缺氧诱导脊髓神经元低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达和凋亡的变化，探讨HIF-1α在耐受缺氧和诱导凋亡机制中的作用。方法 以体外培养的乳鼠脊髓神经元细胞为研究对象。采用激光共聚焦显微镜（LCSM）、DNA琼脂糖凝胶电泳观察缺氧诱导脊髓神经元凋亡的变化；免疫组化检测HIF-1α在缺氧脊髓神经元中的表达；流式细胞术（FCM）检测缺氧对脊髓神经元P53、bcl-2蛋白水平表达的影响。结果 持续缺氧显著抑制脊髓神经元细胞的生长；荧光显微镜下可见脊髓神经元细胞呈典型凋亡的形态学改变。脊髓神经元缺氧2、4h时HIF-1α、P53、bcl-2表达上调（P〈0．01），8h时其表达下调（P〈0．05）。结论 缺氧诱导的HIF-1α的表达，在脊髓神经元的耐受缺氧和诱导凋亡机制中起着重要的作用。     

低氧诱导因子-1α和p53在肝脏低氧损伤中的作用

目的:探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、p53及细胞凋亡在大鼠肝脏低氧损伤中的作用。方法:雄性SD大鼠64只,随机分为对照组和肝动脉结扎组(n=32)。各组均行剖腹、肝脏骨骼化及肝素林格液肝脏灌注,肝动脉结扎组行肝动脉结扎术。术后1、3、7、14d留取肝脏组织及血标本。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肝脏组织HIF-1αmRNA表达水平;免疫组织化学方法检测肝脏组织HIF-1α及p53蛋白表达水平;TUNEL法检测肝细胞凋亡。自动生化分析仪检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)活性以评价肝损伤。结果:肝动脉结扎后肝组织HIF-1αmRNA及HIF-1α蛋白较对照组明显增高,分别于结扎后3d和7d达峰值[0.834±0.129比0.372±0.048,(7.8±3.1)%比(2.1±1.7)%,P均<0.01]。肝动脉结扎组肝细胞p53均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01),于术后7d达峰值[(41.2±9.1)%比(5.2±4.3)%,P<0.01]。肝动脉结扎组肝细胞凋亡指数均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01),于术后7d达峰值[(21.3±7.4)%比(3.7±3.5)%,P<0.01]。肝动脉结扎组ALT水平均明显高于对照组。HIF-1α、p53蛋白表达及凋亡细胞都主要位于肝小叶中央静脉周围。结论:HIF-1αmRNA表达增加、HIF-1α蛋白积聚以及p53促凋亡途径的激活在肝脏低氧损伤中可能发挥重要作用。     

低氧诱导因子-1α在长骨发育中的表达研究

目的：通过动态观察小鼠长骨发育的演变过程,检测各发育时段中低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF—1α）表达及分布状况,探讨HIF-1α在小鼠长骨发育过程中的时空表达特点与作用。方法：分别剖腹取得胎龄12．5、13．5、14．5、15．5、16．5、17．5d的C57BL6小鼠的胎鼠,解剖显微镜下观察肢芽长骨的软骨形成及其软骨内骨化的动态形态演变过程。通过免疫组织化学方法观察HIF—1α蛋白在初级骨化中心形成中的表达与分布,进一步应用RT—PCR检测HIF-1α mRNA在胎鼠长骨各发育时段的表达状况及与骨标记基因骨钙素（OC）表达的关系。结果：胚胎第13．5d（E13．5）时,软骨性肢体形成,关节轮廓出现;E14．5时,软骨性长骨内形成小的骨化核,初级骨化中心刚刚出现,显现不透光骨化影,其后逐渐增大并向头尾两端延伸。免疫组化检测到E14．5时初级骨化中心内的软骨细胞核内见大量HIF 1α阳性黄色颗粒,之后很快消失。HIF-1α mRNA自E13．5至E15．5均大量表达,其后很快下降,维持低水平表达。结论：长骨发育表现为软骨内成骨过程,存在低氧环境,伴随HIF—1α mRNA的规律性表达,这可能与长骨软骨内骨化过程的启动有关。     

结直肠癌中缺氧诱导因子1-α与FasL 表达相关性的研允

目的 探讨结直肠癌侵袭转移过程中缺氧诱导因子1-α(alpha,HIF-1α)与FasL表达的相关性.方法 采用分子克隆方法,将我室已构建的FasL-pcD-NA3.1(+)质粒与pcDNA3.1(一)质粒进行重组,得到新的FasL-pcDNA3.1(一)质粒并加以鉴定;通过脂质体转染法将空质粒、FasL-pcDNA3.1(+)与FasL-pcDNA3.1(一)质粒分别转染人直肠癌HR-8348细胞,构建侵袭力不同的结直肠癌细胞HR-8348L、HR一8348F和HR一8348As,未转染细胞HR一8348B为空白对照,应用Tran-swell,小室检测各组细胞的侵袭能力;采用化学缺氧法构建四组细胞的缺氧模型,Western blot方法定量检测缺氧0h、6h、12h及24h各组细胞内HIF-1α的表达.结果 FasL-pcDNA3.1(一)质粒符合要求,FasL片段大小约900bp,测序结果正确率99.2%;单层细胞体外侵袭实验见HR一8348F细胞穿透Transwell滤膜的细胞数目为(12.930±2.434),显著多于HR-8348B(8.133±1.959)、HR-8348L(7.670±2.093)和HR-8348As(7.870±1.685)细胞(P<0.05);Western blot检测示HIF-1α蛋白于120kD处显色,缺氧0h与6h,各组样品中HIF-α仅表达微量,HIF-1α水平无显著性差异(P>0.05);缺氧12h与24h,HR一8348F细胞内HIF-1α水平较0h和6h时明显增高(P<0.05),而HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As细胞内HIF-1α表达与6h时无明显变化(P>0.05),HR-8348F细胞HIF-1α水平显著高于HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As细胞(P<0.01).结论 缺氧环境中结直肠癌细胞FasL表达增强是除低氧分压外另一个诱导HIF-1α表达增高的因素,FasL与 HIF-1α水平呈正相关,高侵袭能力的结直肠癌细胞对缺氧的适应能力加强,促进肿瘤的远处转移.     

缺氧诱导因子1和缺氧诱导因子2在人类着床前胚胎的表达

目的研究缺氧诱导因子1(HIF-1)和缺氧诱导因子2(HIF-2)在人类着床前胚胎各个阶段的表达,探讨这两个氧调节基因在人类早期胚胎发育过程中的作用和意义。方法收集不育症患者捐赠的胚胎,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR分别定性和定量在5%和20%O2条件下体外培养的人胚胎的HIF-1α和HIF-2αmRNA。采用免疫荧光染色检测人胚胎的HIF-1α和HIF-2α蛋白。结果巢式RT-PCR分别检测了5%和20%O2体外培养的2、4、6、8细胞胚胎和囊胚发现,所有34个胚胎均表达HIF-1α和HIF-2αmRNA。实时荧光定量PCR5%O2培养的人囊胚HIF-1α与18SrRNA的Ct比值为(1.22±0.05);20%O2培养的人囊胚,这一比值是(1.02±0.07);两者比较差异显著(P<0.05)。人胚胎在体外常氧培养条件下的HIF-1αmRNA水平显著高于低氧培养。5%O2培养的人囊胚HIF-2α与18SrRNA的Ct的比值为(1.29±0.04);20%O2培养的人囊胚,这一比值是(1.19±0.11);两者比较无显著差异(P>0.05)。人胚胎在体外低氧培养条件下的HIF-2αmRNA水平与常氧培养无显著差异。5%和20%O2体外培养的2、4、6、8细胞,各个发育阶段人胚胎的HIF-1α和HIF-2α免疫荧光染色均阳性。结论研究结果显示人类着床前胚胎在体外常氧和低氧培养时均表达HIF-1α和HIF-2α。二者可能通过广泛的靶基因系统参与早期胚胎的生长发育和着床过程,在早期胚胎的调控可能不在转录水平,而在转录后水平。     

缺氧诱导因子-1α在去势前后大鼠腹叶前列腺中表达的变化

目的探讨与缺氧相关的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是否参与去势后前列腺萎缩过程.方法24只SD大鼠分为3组,其中A组(n=8)为假手术对照组,B组(n=8)为去势组,C组(n=8)为雄激素替代组(去势后肌注十一酸睾酮50mg/kg);术后3天处死,通过半定量RT-PCR检测与HIF-1α在去势前后前列腺表达变化.结果去势后大鼠前列腺的体积萎缩变小;雄激素替代组出现前列腺增生变大;对照组正常的大鼠前列腺有HIF-1 α mRNA低水平表达,去势组HIF-1α mRNA表达量增加,雄激素替代组HIF-1αmRNA表达量减少,与正常对照组比较,去势组的HIF-1α mRNA的表达量显著增加(P＜0.05),雄激素替代组的HIF-1αmRNA的表达量显著减少(P＜0.01).结论前列腺组织的缺氧参与去势后大鼠前列腺的早期萎缩过程.     

Expression of hypoxia inducible factor-1 alpha and correlation with preoperative embolization of meningiomas

OBJECT: Vascular endothelial growth factor (VEGF) has been implicated in meningioma tumorigenesis and growth. The production of VEGF is regulated by hypoxia inducible factor-1alpha (HIF-1alpha), especially under conditions of hypoxia. In this study, the authors examine the expression of HIF-1alpha and VEGF in meningiomas, with a special emphasis on conditions of hypoxia, such as preoperative embolization, and on in vitro studies in cultured cells. METHODS: Meningiomas obtained in 142 patients were studied using immunohistochemical methods to detect HIF-1alpha and the results were correlated with the extent or lack of preoperative embolization and expression of VEGF. Primary meningioma cell cultures were established and cell culture experiments were performed using a hypoxia chamber to stimulate HIF-1alpha and VEGF production. Expression of HIF-1alpha in primary meningioma cell cultures was measured using immunoblot assays. The VEGF secretion was measured using enzyme-linked immunosorbent assay. Half of the meningiomas studied were positive for HIF-1alpha, with a strong correlation between complete embolization and HIF-1alpha expression. Most of the meningiomas studied expressed VEGF protein, and VEGF expression did not correlate with the degree of embolization. A strong correlation was found between VEGF and HIF-1alpha expression in immunohistochemical studies. Secretion of VEGF is increased by hypoxia and growth factor stimulation. In meningiomas, growth factors stimulate HIF-1alpha expression. The role of hypoxia is less clear. CONCLUSIONS: The expression of HIF-1alpha is increased by complete preoperative embolization of meningiomas. The expression of HIF-1alpha also correlates with VEGF secretion in meningiomas. Growth factor and hypoxic stimulation both contribute to VEGF control, but which is most important (or whether both are equally important) will require further studies.     

腹主动脉瘤发病中低氧诱导因子-1α介导血管平滑肌细胞凋亡的研究

目的　研究腹主动脉瘤 (AAA)发病不同时期动脉壁中低氧诱导因子 (HIF) 1α的表达及与血管平滑肌细胞 (SMC)凋亡的关系。方法　将 60只Wistar大鼠制成AAA模型 ,分别于术后 1、3、7、14、2 1d切取腹主动脉 ,应用原位DNA片段末端标记 (TUNEL)检测SMC中的凋亡信号 ,用免疫组织化学方法检测HIF 1α及凋亡相关基因p5 3、bcl 2的蛋白表达。结果　HIF 1α的表达于术后 3d达表达高峰 ,为 (18.4± 3 .5 ) % ;术后 7d左右是TUNEL染色及p5 3蛋白表达的高峰时段 ,分别为(19.8± 3 .8) %、(17.6± 3 .3 ) % ;bcl 2蛋白在术后 1d时表达较强烈 ,为 (14 .1± 2 .9) %。结论　HIF 1α参与了腹主动脉缺血缺氧状态下的继发损害过程 ,并可通过调节动脉壁中p5 3、bcl 2的蛋白表达水平促进SMC的凋亡 ,是AAA发病过程中一个重要的中间因子。     

Erythropoietin protects the kidneys against ischemia reperfusion injury by activating hypoxia inducible factor-1alpha

BACKGROUND: Ischemia/reperfusion (I/R) injury is closely associated with tissue damage in various organs, as well as in kidney transplants. Erythropoietin (EPO) has been shown to have a cytoprotective effect against hypoxia. We examined the effect of EPO against renal I/R injury and the underlying mechanism. METHODS: Human umbilical vein endothelial cells and human renal proximal tubular epithelial cells were cultured under hypoxic conditions with various EPO concentrations at 37 degrees C and examined the mechanism of cell proliferation by EPO. Moreover, to demonstrate the renoprotective effect in vivo, we treated Sprague-Dawley rats with 100 IU/kg EPO every 2 days for 2 weeks (a total of 6 doses). One day after the last injection, the operations to produce renal I/R injury (bilateral renal occlusion for 60 min) were done, and rats were killed at the end of the reperfusion period (24 hr and 72 hr after reperfusion began). RESULTS: First, we demonstrated in vitro that EPO increased hypoxia inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) expression and stimulated proliferation of both cells under hypoxic conditions. Next, we demonstrated in vivo that EPO treatment increased the number of HIF-1alpha-positive cells, and markedly induced the expression of vascular endothelial growth factor messenger RNA. Using pimonidazole, a molecular probe that detects hypoxia, we found that EPO markedly attenuated tubular hypoxia, and reduced the number of terminal transferase dUTP nick end labeling-positive apoptotic cells and alpha-smooth muscle actin-positive interstitial cells. CONCLUSIONS: We suggested a novel HIF-1alpha induction pathway by EPO under hypoxic conditions. Thus, EPO may protect the kidneys against ischemia reperfusion injury by activating HIF-1alpha.