幽门螺杆菌VacA蛋白的纯化

目的对幽门螺杆菌(Hp)相对分子质量(Mv)95×10~2的VacA蛋白进行分离纯化。为进一步研究VaGA的作用机制奠定基础.方法采用经硫酸铵沉淀及透析后得到的Hp ccUG17874菌株浓缩上清,应用吸附层析、疏水层析、阴离子交换层析及凝胶过滤等液相层析方法进行VacA蛋白的纯化.每步层析后得到的样品均检测蛋白浓度及空泡毒素活性并行SDS-PAGE电泳检测蛋白成分.结果纯化蛋白的Mr为95×10~3,电泳纯,具有明显的空泡毒性,比活力达20480,与上清原液相比纯化倍数提高了4550倍,产率约为5μg/L.结论采用吸附层析、疏水层析、离子交换层析及凝胶过滤的纯化流程,可以成功分离纯化Hp液体培养上清液中的VacA,纯化的VacA蛋白可用于Hp致病机理的研究.     

应用羟基磷灰石层析分离纯化鼠疫菌Pla蛋白的研究

目的应用CHT陶瓷羟基磷灰石层析柱分离纯化鼠疫耶尔森氏菌纤溶酶原激活因子（Pla）。方法优化层析条件,对采用超声破碎结合硫酸铵盐析得到的Pla粗提样品进行纯化,收集纯化中各洗脱峰样品,进行SDS-PAGE。结果上样缓冲液中添加钙离子,可促进Pla与层析柱的结合,经纯化后的Pla,去除了大部分杂蛋白,得到主要由相对分子质量约为31×103、35×103、37×103 Da和3条蛋白带为主的Pla,经软件分析计算,占蛋白总量约80%。结论 CHT陶瓷羟基磷灰石层析能实现对Pla的基本纯化。     

人促血液血管细胞生成素的高效表达和快速纯化

目的 构建人促血液血管细胞生成素（HAPO）的表达载体，获得纯化的HAPO蛋白并研究其生物学功能。方法 通过PCR方法扩增人HAPO基因，克隆于不同的原核表达载体，ITPG诱导融合蛋白表达。NTA层析柱纯化融合蛋白，再经肠激酶裂解融合蛋白，阳离子交换层析纯化，得到纯化的重组蛋白。用培养的MO7e和ECV-304细胞检测蛋白活性。结果 HAPO可在pET32C中，获得稳定高效的可溶性表达。在Ecoli BL21（DE3）中，HAPO表达量可占菌体总蛋白的10％左右。重组蛋白80％是以可溶性蛋白形式存在。NTA层析柱纯化得到的HAPO融合蛋白，再经肠激酶裂解，阳离子交换层析纯化，得到90％以上纯度的重组HAPO蛋白，并且具有良好的生物学活性。结论 得到具有90％以上纯度的重组HAPO蛋白，而且，对MO7e和ECV-304细胞具有促增殖的作用。我们获得了纯化的人重组HAPO蛋白，为进一步研究其功能及临床应用打下基础。     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答。结论成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫重组复合抗原的分离纯化及免疫活性鉴定

高效表达恶性疟原虫保护性抗原重组复合蛋白的工程菌ｐＷＲ－Ｃ／ＪＭ１０９和ｐＷＲ－ＣＡＣ／ＪＭ１０９，在发酵罐中发酵后收集菌体，经超声波破菌，硫酸铵分级沉淀，分子筛和离子交换层析等步骤纯化后，纯度可达８０％以上。纯化后的融会蛋白具有β－半乳糖苷酶的活力，用等电聚焦技术测定纯化蛋白的等电点分别为８．４和８．２５。用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法测定纯化蛋白的免疫原性，证实纯化的重组蛋白可与小鼠抗恶性疟原虫抗体以及疟区病人血清发生特异性免疫反应；重组蛋白免疫家兔后制备的抗血清可特异性地识别恶性疟原虫海南株和云南株的红内期抗原，说明我们纯化的融合蛋白为具有恶性疟原虫抗原活性的重组复合抗原。     

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

血吸虫脂肪酸结合蛋白研究现状

脂肪酸结合蛋白在血吸虫脂代谢中具有重要作用。本文着重介绍了两种血吸虫脂肪酸结合蛋白的理化性质，免疫定位，分子生学及其作为双重疫苗的保护性免疫作用。     

三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分的分离、纯化及鉴定

目的分离、纯化及鉴定三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分。方法提取三裂叶豚草花粉粗提液,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白组分并测定其分子量。收集存在变态反应患者血清,通过免疫印迹法(Western-blotting)对花粉致敏蛋白组分进行鉴定,用离子交换层析初步纯化其致敏蛋白组分,并通过Western-blotting鉴定。结果三裂叶豚草花粉有30余条蛋白条带,其中有14条主要条带,其特异性致敏蛋白组分的相对分子质量为63 000、56 000、40 000和36 500,主要为63 000、40 000和36 500。三裂叶豚草花粉通过离子交换层析纯化出相对分子质量分别为63 000、40 000和36 500的致敏蛋白组分主要集中在Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ峰。结论初步分离、纯化及鉴定了三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分。     

高效液相色谱分离纯化鼠疫菌Pla蛋白

目的用高效液相色谱分离纯化鼠疫菌纤溶酶原激活因子。方法优化离子交换、凝胶过滤,并将2种层析组合实现纯化。结果用高效液相色谱纯化的Pla主要由相对分子质量约31×10^3、35×10^3、37×10^3的3条蛋白带组成,占蛋白总量80％以上。结论Pla经高效液相色谱分离可以达到基本纯化。     

鼠伤寒沙门菌AvrA蛋白的原核表达及纯化

目的克隆,表达和纯化沙门菌AvrA蛋白,为AvrA蛋白的结构和功能研究奠定基础。方法采用生物信息学方法对AvrA蛋白的性质进行预测。使用PCR的方法从沙门菌基因组上获得AvrA36-277基因,并克隆到原核表达载体pGl01上;使用大肠埃希菌BL21(DE3)菌株进行目的蛋白的表达,表达产物分别经镍离子亲和柱、阴离子交换柱以及凝胶层析柱层析纯化。结果成功获得重组质粒AvrA36-277/pGl01,转化BL21后经IPTG诱导获得分子质量单位约为27ku的重组AvrA36-277蛋白。该蛋白以可溶形式表达,层析纯化后蛋白浓度达5mg/ml,蛋白纯度95%。结论使用大肠原核表达系统可稳定表达沙门菌的AvrA36-277蛋白,该蛋白可溶性良好,获得蛋白纯度较高,可用于蛋白底物的筛选、晶体生长及三维结构解析。