8-Br-cAMP对膀胱癌细胞中c-erbB-2 c-myc表达的影响

目的探讨环腺苷酸(cAMP)类似物8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)对人原代培养的膀胱癌细胞中c-erbB-2、c-myc蛋白及mRNA表达的影响.方法原代培养膀胱癌细胞,采用完整细胞免疫组化、原位杂交方法检测膀胱癌细胞中c-erbB-2、c-myc蛋白及mRNA的表达.结果8-Br-cAMP处理后的膀胱癌细胞中c-erbB-2、c-myc蛋白及mRNA表达水平明显低于未处理组,两组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论8-Br-cAMP可抑制膀胱癌细胞中c-erbB-2、c-myc蛋白及mRNA表达,进而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖.     

高磷通过SET8调控p53/Bcl-2/Caspase信号通路促进血管平滑肌细胞钙化

摘要：目的 探讨组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET8在高磷诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化中的作用及机制。 方法 选取80～100 g的清洁雄性SD大鼠6只,取其胸主动脉,分离VSMCs后进行原代培养。VSMCs传至第3～4 代,铺6孔板,并给予相应刺激。将VSMCs随机分为正常组和高磷组（10 mmol/L β-甘油磷酸）,培养4 d后茜素红染 色观察钙结节形成情况,甲基麝香草酚蓝比色法钙含量,流式细胞数检测细胞凋亡,RT-PCR 和 Western blot 检测 SET8、p53、Bcl-2、Bax、Caspase3的mRNA和蛋白的表达水平。之后用脂质体将SET8-shRNA质粒与NS-shRNA转染 VSMCs 作为 SET8-shRNA 组和空质粒组,未转染组作为正常对照组,RT-PCR 和 Western blot 检测 p53、Bcl-2、Bax、 Caspase3的mRNA和蛋白的表达水平。结果 （1）高磷组钙盐沉积较正常组明显增加（P＜0.05）。（2）流式细胞仪检 测结果显示,与正常组相比,高磷组VSMCs的细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）。（3）与正常组相比,高磷组Bcl-2、SET8 的mRNA和蛋白表达水平下降;p53、Bax、Caspase3的mRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）。（4）干扰SET8基因表达 后钙盐沉积增加（P＜0.05）,Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平下降;p53、Bax、Caspase3的mRNA和蛋白表达水平升高 （P＜0.05）。结论 高磷通过SET8调控p53/Bcl-2/Caspase信号通路,下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,上调促凋亡蛋白 Bax和Caspase3的表达,进而参与调控VSMCs的钙化。     

Cr(Ⅵ)诱导肝细胞凋亡与氧化损伤、p53和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的关系

目的探讨6价铬(Cr(Ⅵ))在不同暴露水平诱导细胞凋亡的途径有无差异。方法L-02肝细胞暴露于不同浓度Cr(Ⅵ)24h。用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测细胞凋亡;化学比色法检测SOD,CAT活性与GSH含量;RT-PCR检测p53,caspase3mRNA表达水平;免疫组化检测p53蛋白含量。结果Cr(Ⅵ)诱导L-02肝细胞凋亡率浓度依赖性增加(r=0.997),6~12μmol·L-1Cr(Ⅵ)处理组与对照组比差异有显著性(P<0.05);琼脂糖凝胶电泳表现DNA特征性梯形条带;SOD与CAT活性和GSH含量均下降,Cr(Ⅵ)处理组GSH含量与CAT活性水平明显低于对照组(P<0.05);3~9μmol·L-1Cr(Ⅵ)处理组细胞p53mRNA,caspase3mRNA,p53蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)。细胞凋亡率与SOD活性、CAT活性呈负相关(r分别为-0.952和-0.885);p53mRNA表达与caspase3mRNA表达正相关(r=0.890);p53蛋白表达与GSH含量呈负相关(r=-0.929)。结论氧化损伤即细胞内抗氧化系统平衡的破坏在Cr(Ⅵ)诱导肝细胞凋亡中具有重要作用;在低浓度水平Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡具有p53和caspase3依赖性,但在较高Cr(Ⅵ)处理水平,不排除非p53及caspase3途径的存在。     

DLK1及c-FLIP基因在AML中的表达

目的 探讨急性髓细胞白血病(AML)患者c-FLIPL、c-FLIPS及DLKl基因的表达水平及临床意义.方法 应用逆转录-PCR半定量检测8例AML(AML组)及3例非恶性血液病患者(对照组)骨髓单个核细胞中c-FLIPL、c-FLIPS及DLKl mRNA的表达水平.结果 AML组患者DLKl mRNA、c-FLIPL mRNA、c-FLIPS mRNA表达均明显高于对照组(P＜0.05),且AML各FAB亚型间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DLKl、c-FLIPL及c-FLIPS基因在AML患者中表达异常增高,可能在白血病细胞逃脱凋亡、无限增殖中发挥作用.     

塞来昔布对人骨肉瘤细胞株HOS-8603 P53表达的影响

目的:研究塞来昔布(Celecoxib)对人骨肉瘤细胞株HOS-8603 P53表达的影响,探讨其抗肿瘤作用机制。方法将培养HOS-8603细胞分为两组实验组(分别以20μmol/L和40μmol/L不同浓度塞来昔布处理)和对照组,采用RT-PCR检测各组的P53 mRNA表达。结果:20μmol/L塞来昔布组P53 mRNA的表达与对照组相比无差异(P>0.05);40μmol/L塞来昔布组P53mRNA表达与对照组相比有显著差异(P<0.05)。结论:塞来昔布可能通过促进人骨肉瘤细胞株HOS-8603 P53的表达发挥抗肿瘤作用。     

6-羟基多巴胺通过CaMKII调节Cav1.3对大鼠黑质多巴胺能神经元的损伤研究

目的探讨Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II(CaMKII)和Cav1.3在6-羟基多巴胺处理大鼠原代黑质多巴胺能神经元损伤中的作用。方法取出生24 h内大鼠黑质多巴胺能神经元进行原代培养,12d后分别进行加药处理。使用免疫印迹法、免疫共沉淀法检测6-羟基多巴胺对神经元CaMKII活性和Cav1.3表达情况、Cav1.3-CaMKII复合体形成情况。采用MTT法、siRNA敲减技术检测6-羟基多巴胺对大鼠原代多巴胺神经元细胞死亡情况的影响。结果 6-羟基多巴胺处理组Cav1.3表达水平和p-CaMKII水平明显高于对照组,两组比较差异具有统计学意义(P0.05)。6-羟基多巴胺处理组Cav1.3-CaMKII复合体水平明显高于对照组,两组比较差异具有统计学意义(P0.05)。6-羟基多巴胺处理组p-CaMKII和Cav1.3水平显著高于对照组(P0.05),而KN能明显抑制6-羟基多巴胺引起的p-CaMKII和Cav1.3增加,两组比较差异具有统计学意义(P0.05)。SiCav1.3能抑制50%以上Cav1.3表达,抑制Cav1.3和CaMKII,改善6-羟基多巴胺引起的细胞损伤,两组比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论 6-羟基多巴胺处理大鼠原代多巴胺神经元引起的细胞损伤与Cav1.3和CaMKII表达和活性增加相关,CaMKII通过与Cav1.3形成复合体来直接调节Cav1.3的功能,抑制Cav1.3和Ca MKII可改善6-羟基多巴胺导致的细胞损伤。     

人SET基因重组腺病毒载体在小鼠颗粒细胞的表达

目的 以原代培养的小鼠卵巢颗粒细胞为模型,观察人SET基因重组腺病毒载体在卵巢颗粒细胞的感染效率和基因表达效果.方法 分离并培养小鼠颗粒细胞.扩增人SET基因重组腺病毒载体AdCMV-SET和对照重组腺病毒载体AdCMV,感染原代培养的小鼠颗粒细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)检测感染效率;qRT-PCR方法检测SET mRNA表达;Western blot方法检测SET蛋白的表达水平.结果 获得的重组腺病毒载体体外感染小鼠颗粒细胞,24 h观察到GFP表达.与AdCMV感染组相比,AdCMV-SET感染组SET mRNA表达水平显著增高(P＜0.05).与空白对照组(Mock)及感染AdCMV组相比,AdCMV-SET感染组SET蛋白水平显著增高(P＜0.05).结论 构建的人SET基因重组腺病毒载体能高效感染小鼠颗粒细胞、并有效表达,对细胞活率无影响.     

P53在膀胱移行细胞癌的表达及临床意义

目的 探讨P53在膀胱移行细胞癌的表达与膀胱移行细胞癌生物学行为的关系及临床意义.方法 采用免疫组化(SABC)检测62例膀胱移行细胞癌中P53的表达情况.结果 P53表达阳性率均随着膀胱癌的病理分级、临床分期上升而升高,且有统计学意义(P＜0.05),P53阳性者的复发率明显高于阴性表达者,且有统计学意义(P＜0.05).结果 本研究显示,P53表达水平与膀胱移行细胞癌组织学分级、临床分期及复发密切相关,随着膀胱移行细胞癌分级的增高而显著增高,浸润性膀胱移行细胞癌(T2-T4期)表达水平高于表浅性膀胱移行细胞癌(Tis-T1期);复发性膀胱移行细胞癌的表达水平明显高于初发性膀胱移行细胞癌.结论 P53检测能为判断膀胱移行细胞癌的恶性程度和复发提供依据.     

8-Br-cAMP联合槲皮素对人食管癌Eca-109细胞的逆转化作用

目的探讨8-Br-cAMP与槲皮素联合用药对人食管癌Eca-109细胞逆转化的作用。方法将培养的Eca-109细胞随机分为4组:①8-Br-cAMP组(Br):加终浓度为2×10-5mol/L8-Br-cAMP;②槲皮素组(Q):加槲皮素终浓度为43μmol/L;③8-Br-cAMP和槲皮素共同作用组(Br+Q):加终浓度为2×10-5mol/L8-Br-cAMP和终浓度为43μmol/L的槲皮素;④对照组(C):仅加DMEM培养液(含10%胎牛血清)。同时培养48h后分别对以上4组细胞制备细胞滴片及硝酸纤维素膜滴膜两种标本,进行Caspase-3和PCNA的免疫组化和免疫斑点印迹实验;应用完整细胞原位斑点印迹杂交技术检测c-myc、野生型p53(wtp53)、p16和EGFR的基因表达;并进行分化细胞/增殖细胞计数。结果8-Br-cAMP与槲皮素联合或单独应用均可上调Caspase-3免疫反应信号的表达,下调PCNA免疫反应信号的表达;同时上调wtp53和p16基因的表达,下调c-myc和EGFR基因的表达;且分化细胞的比率显著提高。结论8-Br-cAMP与槲皮素联合用药或单独用药均可通过调控人食管癌Eca-109细胞癌基因和抑癌基因的表达对Eca-109细胞起到生长抑制和促分化的作用。     

高浓度游离脂肪酸对胰岛细胞凋亡及相关基因表达的影响

目的：观察高浓度游离脂肪酸体外对胰岛细胞凋亡和凋亡相关基因表达的影响。方法：应用TUNEL法检测高浓度游离脂肪酸培养后大鼠胰岛细胞和小鼠βTc3细胞凋亡百分率，应用定量RT～PCR(QRT—PCR)检测培养后bc1-2、bax、c—myc、p53和fas mRNA的表达。结果：高浓度游离脂肪酸使原代培养的大鼠胰岛细胞和βTc3的凋亡细胞比例明显增加。胰岛细胞凋亡过程中，诱导凋亡基因bax、c—myc、fas的tuRNA表达水平明显升高，抵抗凋亡基因bcl-2mRNA表达水平明显下降，p53 mRNA表达水平无明显改变。结论：游离脂肪酸可能通过诱导胰岛细胞凋亡导致或加重糖尿病，其中bc1-2／bax mRNA表达比率变化可能起重要作用。     

原发性肝癌中N—ras,c—myc癌基因的表达研究

以点杂交和原位杂交法检测了34例启东地区原发性肝癌手术切除标本N－ras、c－myc基因的表达水平和定位。点杂交结果显示：N－ras、c-myc的检出率分别为647％（22／34）和23．5％（8／34）。前期的实验表明此34例标本HBV－DNA的检出率为588％（20／34），Southernblot实验结果未见病毒DNA的整合。N－ras、c-myc阳性标本中HBV－DNA的检出率分别为54．5％（12／22）和75％（6／8），两者之间无差异，P＞0．05。原位杂交结果显示：肝癌癌组织中N－ras、c－myc基因的表达水平并没有明显增高，相反，肿瘤周围肝组织中的表达水平增高并主要位于慢性肝炎、肝硬变中的再生肝细胞中，阳性细胞呈灶性及成片分布，不伴有毛玻璃样改变（HE染色）。结论：虽然N－ras、c－myc与肝癌的发生密切相关，肝癌患者中常见其表达水平增高，但这很可能只是一种肝细胞损伤后再生时的细胞增殖性调控的表现，此种N－ras、c-myc的高表达是否直接导致肝癌发生，癌基因是否为突变型，有待进一步研究、此外，本实验中c－myc基因相对于N－ras基因的低检出率可能与c－mycMRNA极短的半衰期有关。     

吗啡依赖及戒断大鼠糖皮质激素及其受体mRNA表达水平的改变

目的:研究慢性吗啡处理和吗啡戒断对大鼠血清中ACTH及其受体mRNA表达水平的影响。方法:利用放射免疫法测定吗啡依赖及戒断大鼠血清中ACTH及皮质醇的浓度;利用核酸分子杂交技术研究下丘脑糖皮质激素受体(GR)基因表达的改变情况。结果:(1)吗啡依赖组大鼠血清中ACTH及皮质醇的浓度明显低于对照组;戒断d1大鼠血清ACTH浓度仍明显低于对照组(P<0.01),但血清皮质醇的浓度则明显高于对照组(P<0.01);戒断d7大鼠血清ACTH浓度与对照组比较,无显著性差异(P>0.05),而血清皮质醇的浓度仍略高于对照组(P<0.05);(2)吗啡依赖组大鼠下丘脑GR基因表达水平下降(P<0.05),戒断组大鼠GR的基因表达均高于对照组,但无显著性差异(P>0.05)。结论:吗啡类物质的长期使用可以对下丘脑-垂体-肾上腺轴的激素分泌功能及GR的基因表达产生明显的抑制作用。     

吗啡对大鼠催乳素基因表达的影响

目的 :研究吗啡依赖及戒断对大鼠垂体催乳素 (PRL)基因表达的影响。方法 :核酸分子杂交及放射免疫分析。结果 :吗啡依赖组及戒断组大鼠垂体的PRLmRNA含量降低 ,戒断 2组与对照组之间差异有显著性 (P <0 0 5 ) ;吗啡依赖组及戒断组血清PRL水平均高于对照组 ,后者与对照组之间差异有显著性 (P <0 0 5 )。结论 :吗啡依赖及戒断显著影响大鼠垂体PRL的基因表达 ,表现为转录功能的下降和可能直接刺激催乳素的合成及分泌     

吗啡急性给药、吗啡依赖和戒断的大鼠心脏内分泌基因的表达

目的·· :研究吗啡急性给药、吗啡依赖及戒断对大鼠心脏心钠素基因表达的影响。方法 :·· 利用斑点及Northern杂交技术检测大鼠心房的心房钠利尿因子信使RNA(ANF -mRNA)含量。结果··:吗啡急性给药、吗啡依赖及戒断时大鼠心房ANF -mRNA含量均升高。结论·· :吗啡急性给药、吗啡依赖及戒断时大鼠心脏心钠素基因表达均增强。     

TP53基因沉默介导PI3K/PTEN/AKT信号通路对肾透明细胞癌侵袭转移的调控机制

目的探讨肿瘤蛋白p53基因(TP53)沉默介导PI3K/PTEN/AKT信号通路对肾透明细胞癌侵袭转移的调控机制。方法取60例肾透明细胞癌组织标本,免疫组化分析TP53蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达;取人肾透明细胞癌细胞株RLC-310进行细胞培养;细胞转染表达载体分为空白组(A组)、阴性对照组(B组)、sh TP53组(C组)、PTEN抑制剂bpv组(D组)、phen+sh TP53组(E组)。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot检测各组细胞TP53、同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、AKT的m RNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测各组细胞增殖能力;划痕愈合试验检测各组细胞的迁移能力;Transwell侵袭试验检测各组细胞的侵袭能力。结果TP53蛋白在肾透明细胞癌组织中高表达(P<0.05);与A组和B组相比,C组的TP53,PI3K,AKT m RNA和蛋白表达水平显著下降,PTEN m RNA和蛋白表达水平均显著上升,且细胞增殖能力、迁移率、侵袭率均显著下降(P<0.05);D组TP53,PI3K,AKT m RNA和蛋白表达水平显著上升,PTEN m RNA和蛋白表达水平显著下降,且细胞增殖能力、迁移率、侵袭率均显著上升(P<0.05);同时,E组TP53下降(P<0.05),而其他指标与A组和B组相当(P>0.05)。结论沉默TP53基因抑制PI3K/PTEN/AKT信号通路,从而抑制肾透明细胞癌细胞浸润转移功能,并可逆转phen诱导的肾透明细胞癌细胞浸润转移。     

靶向性发夹状RNA对卵巢癌SKOV3细胞H-ras基因表达的影响

目的运用构建的小发夹状RNA重组质粒pshRNA/H-ras,研究其对卵巢癌SK-OV3细胞株内源H-ras基因的抑制作用。方法应用基因克隆技术,设计含21bp H-ras基因编码序列片段及中间以4~5个bp间隔的反向重复序列,克隆至转录载体pTZU6 1上并行序列分析。转染重组质粒pshRNA/H-ras至SKOV3细胞中,分别采用RT-PCR、Western blot检测细胞内H-rasmRNA和蛋白表达的变化。结果成功构建发夹状RNA载体,经DNA序列鉴定为正确的目的序列。RT-PCR和Western blot结果表明,重组质粒pshRNA/H-ras1和pshRNA/H-ras2均能在基因转录水平和蛋白表达水平上明显抑制SKOV3细胞内源H-ras蛋白的表达,抑制率达67%以上。结论重组质粒pshRNA/H-ras可显著抑制SKOV3细胞内源H-ras基因mRNA的转录和相应蛋白质的表达,为进一步研究H-ras基因在卵巢癌细胞异常增殖中的作用打下基础。     

辛二酰苯胺异羟肟酸对人卵巢癌细胞恶性表型的抑制作用

目的 探讨辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对人卵巢癌细胞恶性表型的作用及其可能的分子作用机制。方法 （1）选取 2 组人卵巢癌细胞(SKOV3 和 SKOV3/DDP; HO8910 和 HO8910-PM)后, 设置对照组和终浓度为 1、 3、 5 及 7 μmol/L SAHA 组(SAHA 1~4 组), 采用 CCK-8 法分别检测 SAHA 对细胞增殖的影响。（2） 设置对照组和 SAHA 1、 2 组(2 和 5 μmol/L), Annexin V-FITC/PI 双标记流式细胞术分别检测 SAHA 对细胞凋亡及周期的影响。（3） RT-PCR 和 Western blot 检测 SAHA 1~4 组表型相关蛋白的表达水平。结果 （1）随着 SAHA 浓度的增加, SKOV3 细胞株 SKOV3/DDP 及 HO8910 细胞株 48 h 光密度 （OD） 值均呈逐渐降低趋势(均 P＜0.05)。（2） 48 h SAHA 1、 SAHA 2 组凋亡率高于对照组(均 P＜0.05); SAHA 作用 48 h, 细胞周期发生阻滞, 与对照组比较, SAHA 1 组和 SAHA 2 组 SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞 S 期和 G2/M 期比例增高, HO8910 和 HO8910-PM 细胞 G0/G1期比例增高(P＜0.05)。（3） SAHA 1、 2 组 CyclinB1 和 Cdc2(p34)的 mRNA 表达水平均低于对照组, Caspase-3、 p21 和 p53 的 mRNA 表达水平明显高于对照组(P < 0.05); SAHA 1~4 组 Ac-Histone H3 和 Ac-Histone H4 和 p53 蛋白的表达较对照组明显增强, CyclinB1、 Cdc2 (p34)蛋白的表达减弱。结论 SAHA 通过调节恶性表型相关蛋白 Caspase-3、 p53、 CyclinB1 和 Cdc2(p34)的表达水平, 促进组蛋白乙酰化, 抑制卵巢癌细胞增殖, 阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。