鸭肝细胞的分离和原代培养

利用胶原酶原位灌流动物肝脏,是一种肝细胞分离的方法,人们已经在某些哺乳动物进行过这方面的实验,但在禽类动物,除国外曾在鸡、雏鸭等动物有过成功的实验外,成年的鸭肝细胞分离和原代培养尚无报道。而鸭作为一种肝癌肝炎     

一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法

目的:寻找一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法。方法:在Seglen两步胶原酶灌注法的基础上加以改进，按门静脉灌注法分离培养大鼠肝细胞，重复10次分离肝细胞实验，观察各项指标结果。采用胰酶、Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注，大鼠肝脏肝门部结构、肝上及肝下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离获取肝细胞，经80目和200目的筛网依次过滤细胞后，细胞悬液分别以1 000、500、300 r/min离心各5 min以纯化肝细胞，以台盼蓝排染法测定细胞活性，HE染色鉴定肝细胞纯度。结果:平均每只成年Wistar雄性大鼠可以获得（1.53±0.31）×108个肝细胞，平均获得肝细胞活率可达到94.63%，平均获得肝细胞纯度为96.7%。结论:本实验介绍的方法简便易行，且肝细胞产量较高，活力好，纯度高，适宜在一般条件的实验室推广和应用。     

原代小鼠肝细胞培养方法的比较

目的: 比较3种不同培养条件下原代小鼠肝细胞的形态以及肝细胞功能,寻找适合于原代小鼠肝细胞体外培养的培养基配方。方法: 采用改良Seglen两步胶原酶灌注法分离原代小鼠肝细胞,糖原染色观察细胞纯度,在贴壁4 h后用基础培养基、基础培养基加DMSO(DMSO组)、基础培养基加DMSO和EGF(DMSO+EGF组)等3种不同的条件培养肝细胞。镜下观察肝细胞形态,用MTT法检测细胞活力,生化分析仪检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平以及用ELISA法检测细胞培养上清液中白蛋白水平。结果: 成功分离小鼠原代肝细胞,肝细胞纯度达95%以上;原代肝细胞培养至96 h时,DMSO组仍能较好地维持细胞形态,基础培养基组的细胞活力比DMSO组和DMSO+EGF组分别降低了66.87%和67.16%(P<0.05),且基础培养基组的LDH水平均高于DMSO组和DMSO+EGF组(P<0.05)。此外DMSO组在96 h时仍能维持较高水平的白蛋白分泌,比基础培养基组和DMSO+EGF组分别增加了185%和24.2% (P<0.05)。结论: 小鼠原代肝细胞培养基中加入DMSO对于维持肝细胞的形态和功能有促进作用,本研究为体外原代肝细胞培养模型的建立和优化提供了实用的方法。     

大鼠表皮角质细胞的原代培养

对于动物及人体表皮细胞的体外培养方法,人们已进行了多方探索,并且已将其用于化学致癌机理和皮肤病发病机理等领域的研究。在化学致癌的研究中,人们经常采用的动物实验模型是给小鼠表皮相继涂抹致癌物和促癌物,诱发皮肤肿瘤。因此在深入研究其致癌机制的同时,对小鼠表皮角质细胞的体外生长特性和影响因素也进行了详细探讨。研究人类皮肤肿瘤和皮肤病的需要则促使人体表皮角质细胞体外培养的经验臻于成熟。人体和小鼠表皮细胞培养条件要求高,     

大鼠卵巢颗粒细胞的原代培养与鉴定

背景与目的： 探讨大鼠卵巢高纯度颗粒细胞培养及鉴定的方法,建立一种简便、稳定的细胞模型。 材料与方法： 选用SD雌性大鼠(21～25 d),皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG),48 h后用颈椎脱臼法处死,剖取双侧卵巢,采用机械分离方法释放卵巢颗粒细胞,0.25％胰蛋白酶消化结合低速离心分离细胞,用含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基,置于37 ℃,5％ CO2培养箱培养。以HE染色和卵泡刺激素受体(FSHR)免疫组化染色对所培养的卵巢颗粒细胞进行鉴定,用MTT法绘制细胞生长曲线,并检测细胞培养液雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌量。 结果： 分离培养的卵巢颗粒细胞存活率>90％,细胞纯度达到95％以上;体外培养的颗粒细胞对数生长期为48～96 h;颗粒细胞具有正常的分泌雌激素功能,在培养24 h细胞培养液中E2和P的分泌量分别为(10.36±15.89) pg/ml和(77.91± 17.24) pg/ml。 结论： 采用机械分离法结合胰蛋白酶消化及低速离心法分离培养的卵巢颗粒细胞纯度高、活性好,用FSHR表达染色鉴定颗粒细胞是一种简便快速的方法。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞及其分离鉴定与原代培养

肺泡是构成肺脏的主要结构 ,是气体交换的基本单位 ,其表面被覆的单层肺泡上皮主要由肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞构成 ,其中肺泡Ⅱ型上皮细胞 (typeⅡalveo larcells ,AT Ⅱ )具有重要的功能。当受到各种刺激时 ,AT Ⅱ可增生并修复已损伤的上皮细胞 ,起着肺泡上皮干细胞的作用。在其受到损伤后 ,若延迟修复 ,可影响上皮细胞对肺泡壁成纤维细胞的抑制作用 ,从而导致成纤维细胞增生 ,与肺纤维化病变关系密切。此外 ,在内外环境损伤因素如慢性炎症、肺内瘢痕、慢性间质性肺纤维化、吸烟及其它有害因素的作用下 ,AT Ⅱ和Clara细胞 (细支气管无纤…     

十三种化合物诱导的小鼠原代培养肝细胞基因表达谱的聚类分析

背景与目的： 利用基因芯片技术研究13种化合物所诱导的小鼠原代培养肝细胞基因表达谱,通过对基因表达谱的聚类分析,对化合物在基因组反应水平上进行分类的尝试,使化合物的分类与其诱导的基因表达谱联系起来。 材料与方法： 用30％的致死剂量染毒原代培养的小鼠肝细胞,24 h后提取RNA,用芯片进行检测。 结果： 聚类分析结果表明,13种化合物分成了三类。 结论： 用基因表达谱来对化合物进行分类,使其分类结果与毒性作用相联系,进而探讨其作用机制、预测未知毒性化合物的毒性是可行的,是很有价值与希望的研究方向。     

大鼠肝细胞线粒体三维重建和体视学分析

为深入研究大鼠肝细胞线粒体的形态特征，本文以连续超薄切片追踪观察不同形态线粒体的三维结构，重建其三维模型，把线粒体划分为简单型、复杂型、特殊型三个形态类型，并对不同类型的线粒体进行体视学分析。结果显示：简单型线粒线（球形、盘球及杆形等）占线粒体总数的５３９％，其体密度为８９６％；复杂型线粒体（分枝型及各种不规则形等）占４２０１％，其体密度为８６７％；而特殊型线粒体（芽生状等）占４６０％，其体密度仅为０９７％。这表明在正常的肝细胞中复杂型线粒体的含量并不为少，线粒体形态的多样性与其自身的发育相对应。分析还显示不同类型线粒体嵴膜密度和基质颗粒数密度有所差异，表明线粒体嵴的生长并不与线粒体体积的增长同步增加，因此，三种类型线粒体的功能状态亦可能有所不同。     

ALDH+乳腺癌干细胞的原代分离培养及生物学特性分析

目的 证实乳腺癌组织中存在ALDH+乳腺癌干细胞,并研究ALDH+乳腺癌干细胞体外增殖、侵袭能力等生物学特性.方法 应用流式细胞法从人乳腺癌组织细胞中分离并培养ALDH+乳腺癌干/祖细胞,通过克隆形成实验,生长曲线测定,以及transwell法等实验方法检测ALDH+乳腺癌干细胞的生物学特性.结果 在乳腺癌组织内,我们检测到ALDH+ CD24-/lowCD44+约占总细胞量的16％,无血清培养72 h后逐渐出现细胞球,2～3周时细胞球数量达到高峰.Transwell法检测ALDH+乳腺癌干细胞侵袭性较ALDH-乳腺癌干细胞侵袭性强.结论 乳腺癌组织中存在ALDH+ CD24-/low CD44+乳腺癌干细胞,ALDH可以作为鉴定乳腺癌干细胞的分子标志之一.     

肝细胞癌细胞诱导和体外培养的大鼠肝星状细胞基因差异表达

目的 从基因水平了解肝细胞癌(HCC)内的星状细胞(HSC)与正常肝HSC的异同.方法 密度梯度离心分离HSC,用大鼠HCC细胞株CSF的条件培养基诱导HSC活化.cDNA微阵列比较静止、体外培养活化和诱导活化HSC之间22 012个基因的表达,并通过实时逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)和Western blot检测进行验证.结果 与静止HSC相比,体外培养HSC共有1672个基因差异表达,包括促炎症因子、细胞表面受体、黏附分子、信号转导分子、免疫因子等,其中1012个基因上调,660个基因下调.肿瘤诱导活化HSC有711个基因差异表达,其中420个基因上调,291个基因下调,有一部分基因表达与体外培养相同,部分基因如Raf1、Rac2、Adam17、Wnt6、MMP-9和TNF等,呈特异性表达.real-time RT-PCR和Western blot检测结果与cDNA微阵列检测结果相符.结论 HCC细胞可特异性驱动HSC的活化,诱导活化的HSC在HCC细胞的浸润和转移中可能起重要作用.瘤内活化的HSC应作为研究HSC生物学功能的标准.     

肿瘤细胞原代培养与保存

肿瘤细胞原代培养技术可为日益深入的肿瘤研究及治疗提供充足有效的细胞来源,是癌症在体外研究的重要手段,与体内研究相辅相成。但目前肿瘤细胞原代培养成功率不高,许多问题还需继续探讨与研究。全文综述目前国内外肿瘤原代培养方法、条件及冻存注意事项,包括:肿瘤组织类型与处理、细胞培养及纯化方法、原代肿瘤细胞生物特性检测、肿瘤细胞冻存条件等,综合探讨各方法的优缺点。比较获得更有效的肿瘤细胞原代培养方法,将其运用于探索肿瘤发生机制、肿瘤细胞治疗及药敏试验,推进肿瘤治疗的进程。     

免疫磁珠法原代分离培养人子宫内膜癌微血管内皮细胞及鉴定

目的:建立人子宫内膜癌(EC)微血管内皮细胞的原代分离培养方法并研究其体外免疫组化特征.方法:采用免疫磁珠法结合胶原酶消化法及筛网过滤法分离纯化EC微血管内皮细胞,采用含有20％胎牛血清的M199培养.通过光镜、细胞免疫荧光技术对所获得的微血管内皮细胞进行鉴定,流式细胞仪检测微血管内皮细胞的纯度.微血管内皮细胞的生长曲线通过MTT法测定.结果:微血管内皮细胞台盼蓝拒染率为90％,纯度95％,并能连续传代.原代细胞7～9 d完全融合,传代培养后5～6 d可传代1次.细胞单层生长,融合后呈铺路石样具有接触抑制现象.免疫荧光证实,传代细胞表达内皮细胞特异性vWF因子及细胞间黏附蛋白CD31.经MTT法测定得到的微血管内皮细胞体外生长曲线呈“S”型.结论:成功建立了人EC微血管内皮细胞的分离培养方法,所获得的细胞可用于EC的相关研究,为探讨EC的临床治疗方法提供了新的平台.     

黄芪注射液对原代培养大鼠海马神经元放射性损伤的保护作用

目的:研究黄芪注射液对原代培养大鼠海马神经元放射性损伤的保护作用,为放射性脑损伤的预防和治疗提供新的方法.方法:30 Gy的X射线单次照射培养至12 d的海马神经元,用DAPI染核方法检测海马神经元凋亡情况.结果:30 Gy组在照射后24 h核固缩百分数为(27.3±3.78)%,较0 Gy组(1.88±1.03)%差异有统计学意义,P<0.01;30 Gy+黄芪注射液0.5 g/L预处理组在照射后24 h核固缩百分数为(6.86±2.27)%,较30 Gy组(P<0.01)及0 Gy组(P<0.01)差异均有统计学意义.结论:应用黄芪注射液可以显著减少海马神经元放射性损伤导致的凋亡,提高其对放射性损伤的耐受能力.     

硝基苯和苯胺对大鼠原代肝细胞氧化损伤的作用

目的:从氧化损伤途径研究硝基苯和苯胺对Wistar大鼠原代肝细胞的联合毒作用,为预防环境化合物对人体健康损害提供理论依据。方法:分别用不同浓度(1.25、2.5、5.0、10.0和20～mmol/L),的硝基苯、苯胺及其混合物处理大鼠原代肝细胞24 h后,采用MTT法测定各组细胞的存活率,并进一步测定各组细胞或上清液中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和超氧化物歧化酶(SOD)的变化。结果:与阴性对照组相比,大鼠原代肝细胞经硝基苯、苯胺及其混合物处理24 h后,其细胞存活率均随所给化合物浓度的增加而降低(P<0.05),且硝基苯-苯胺联合染毒组的细胞存活率明显低于单一化合物的细胞存活率(P<0.05)。随着硝基苯、苯胺和两者混合物浓度的增高,MDA、ALT含量呈现上升趋势(P<0.05);且硝基苯-苯胺联合染毒组细胞MDA、ALT含量均显著高于硝基苯和苯胺单独存在时(P<0.05)。与阴性对照组比较,硝基苯和苯胺及其混合物均可显著降低细胞SOD、GSH和GSH-px含量(P<0.05),并呈现剂量反应关系(P<0.05)。与硝基苯和苯胺单独作用组相比,硝基苯-苯胺联合染毒组细胞SOD、GSH和GSH-px活力均显著降低(P<0.05)。结论:硝基苯和苯胺及其混合物可造成大鼠原代肝细胞氧化损伤,硝基苯与苯胺对肝细胞毒性作用可能存在着协同作用,其作用机制有待进一步研究。     

人结肠上皮细胞的原代培养

目的:探讨人结肠上皮细胞的分离、体外培养方法,为研究结肠功能及相关疾病提供细胞模型。方法:人正常结肠黏膜取自结肠癌病人手术切除的癌旁正常组织,运用胶原酶和嗜热菌蛋白酶消化分离,接种于适当培养液内,根据成纤维细胞贴壁时间的差异并运用胶原酶来纯化。结果:联合运用Ⅰ、Ⅳ型胶原酶和嗜热菌蛋白酶消化可分离出健全绒毛隐窝单位,在适当的培养条件下可长出单层不规则形细胞,经鉴定为人结肠上皮细胞。结论:使用合适的方法及培养液,可以分离培养出正常人结肠上皮细胞。     

依达拉奉对原代培养大鼠海马神经元放射性损伤的保护作用

目的:研究依迭拉奉对原代培养大鼠海马神经元放射性损伤的保护作用.方法:30 Gy的X射线单次照射培养至12 d的海马神经元,用DAPI染核方法检测海马神经元凋亡情况,用MDA含量及SOD活性试剂盒测定细胞培养液MDA含量及SOD活性.结果:各组之间核固缩分数差异有统计学意义(P＜0.01),30 Gy组在照射后24 h核固缩百分数为(25.2±4.02)%,较0 Gy组差异有统计学意义,P＜0.01;30 Gy+依达拉奉100 mol/L组在照射后24 h核固缩百分数为(7.68±2.31)%,较30 Gy组及0 Gy组差异均有统计学意义(P＜0.01).各组之间MDA含量及SOD活性差异有统计学意义(P＜0.01).结论:依达拉奉通过降低自由基水平而对放射损伤的大鼠海马神经元起到保护作用.     

原代肺腺癌组织的三维培养

目的：探索肺腺癌组织的体外三维培养技术，进一步了解其应用前景。方法：在体外用三维胶原对原代肺腺癌组织进行三维培养来模拟肿瘤的体内生长情况，应用光学显微镜、电子显微镜、免疫组织化学和肿瘤移植等方法来判断组织的生长情况。结果：原代肺腺癌组织在三维胶原上呈现癌组织与成纤维细胞立体混杂生长的现象，随着培养时间的延长，癌组织变小，相邻的癌组织通过细胞爬行互相建立连接。有些细胞会穿透胶原，在培养皿的底部生长。免疫组织化学结果显示，癌组织生长良好。结论：三维胶原的原代肺腺癌组织在体外立体生长情况良好，并且保留了侵袭性。该项技术提供了一个非常接近于体内真实情况的组织研究平台。     

肿瘤细胞原代培养的应用与发展

作为组成生命活动基本单位的细胞,初次被人为控制而获得在体外存活、增殖、乃至长期保存,这是人类医学史上一个划时代的技术革命,很快受到广泛关注,现已在很多方面得到应用,如生物学、遗传学等。该技术称为细胞培养,包括原代培养与传代培养。原代培养又称为初代培养,是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。其又细分为肿瘤细胞原代培养与非肿瘤细胞原代培养。原代培养获取的肿瘤细胞仍