靶向DAL-1基因的shRNA表达载体的构建与鉴定

目的：建立DAL-1稳定抑制的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞实验模型．方法：构建靶向DAL-1的shRNA表达载体转染NSCLC细胞株，筛选出阳性克隆，在mRNA和蛋白质水平鉴定其抑制效率，最终得到DAL-1稳定抑制的细胞株．结果：通过双酶切鉴定和测序鉴定构建的shRNA表达载体序列正确，T4表达载体在mRNA和蛋白质水平能有效抑制DAL-1的表达，抑制率分别为（87．4±2．0）％和（82．7±2．1）％．结论：成功设计并构建了靶向DAL-1的shRNA表达载体，建立了DAL-1稳定抑制的NSCLC细胞株，为进一步研究DAL-1在NSCLC细胞中的作用提供了实验模型．     

靶向survivin基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向survivin基因的siRNA的表达载体,研究survivin在喉癌中的作用机制。方法根据基因库上sur-vivin cDNA序列,设计合成靶基因序列,将其寡核苷酸退火后插入到Pgenesil-1表达载体中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。结果酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。结论成功构建了靶向survivin基因表达的siR-NA干扰质粒载体Pgenesil/survivin,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

靶向CCR7基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计并构建靶向CCR7基因shRNA真核表达质粒,并检测其干扰效果。方法以CCR7为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pGC-silencer-CRM30载体,构建的3条重组短发夹shRNA表达载体分别命名为pGC-silencer-CRM30-CCR7A、-CCR7B和-CCR7C。采用测序法鉴定寡核苷酸序列。将构建好的真核表达载体转染人结肠癌SW480细胞,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR法检测CCR7干扰效率。结果重组质粒测序结果与Genebank中的CCR7 cDNA序列相符,转染SW480细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白,RT-PCR结果表明,pGC-silencer-CRM30-CCR7C干扰效果最强。结论靶向CCR7基因shRNA表达载体构建无误,为进一步探讨趋化因子受体CCR7在胃肠道恶性肿瘤生物学行为中的作用奠定了基础。     

靶向小鼠整合素β_1的shRNA表达载体构建及鉴定

目的构建小鼠整合素β1的shRNA表达载体,用RNA干扰下调整合素β1基因在小鼠支气管平滑肌细胞中的表达。方法设计并合成靶向小鼠整合素β1基因的shRNA表达载体,转染入哮喘小鼠的支气管平滑肌细胞,检测shRNA表达载体对靶基因的抑制效果。结果 shRNA表达载体能稳定转染小鼠支气管平滑肌细胞,转染后的整合素β1mRNA及蛋白质水平均显著下调。结论成功构建了靶向小鼠整合素β1高效、持久的shRNA表达载体,转染细胞后可下调整合素β1表达,为进一步研究整合素β1在哮喘气道重塑中的作用及其基因治疗奠定了基础。     

靶向人Bax inhibitor-1的siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建靶向人Bax inhibitor-1的siRNA表达质粒.方法:借助siRNA设计工具,确定Bax inhibitor-1编码序列中4个可能的干扰位点,人工合成4对正反义脱氧寡核苷酸链(B1、B2、B3、B4),定向克隆至真核表达质粒pmU6,得质粒pmU6-B1、pmU6-B2、pmU6-B3、pmU6-B4.将重组质粒转染DH5α,PCR法筛选阳性克隆,DNA测序法检测插入序列的正确性.结果与结论:PCR和DNA测序结果证实各重组质粒的插入序列完全正确.靶向人Bax inhibitor-1的siRNA表达质粒构建成功.     

靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒.方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM 3.1-H1 neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体.采用酶切法和测序法鉴定.结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66 bp模板寡核苷酸片段和4.3 kbp的线性化的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体片段.重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符.结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础.     

针对HBs基因的shRNA表达载体的构建及鉴定

目的以PGenesil-1(Pg)为载体构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(Pgs)。方法设计、合成针对HBs区的三对DNA序列,分别插入PGenesil-1中,并对重组质粒进行限制性内切酶谱和DNA序列测定分析。结果3个不同的重组shRNA表达载体经限制性酶识别和DNA序列测定完全正确。结论成功构建了3个针对HBs基因的shRNA表达载体。     

靶向MSTN基因shRNA表达载体的构建与鉴定

目的 旨在构建靶向MSTN基因的短发夹RNA (shRNA) 真核表达载体,并鉴定其在小鼠体内的抑制效果。方法根据MSTN基因的mRNA序列(NM_010834.3)设计siRNA,并挑选出3条可能具有良好干扰效果的siRNA,设计合成shRNA,构建pSIREN-MSTN-shRNA表达载体。通过肌内注射法将载体递送至小鼠体内,利用实时荧光定量PCR和Western blot法检测干扰后小鼠肌肉组织中MSTN的mRNA表达量和蛋白质表达水平。结果 测序鉴定表明pSIREN-MSTN-shRNA表达载体构建成功,3个重组质粒均能够明显降低肌肉组织中MSTN的mRNA和蛋白质水平,其中pSIREN-M819表达载体干扰效果最好,与对照组比较,MSTN的mRNA表达量降低了71%,蛋白水平也明显降低。结论 成功构建了pSIREN-MSTN-shRNA表达载体,并在小鼠体内能够有效抑制MSTN基因的表达。     

Livin和Survivin基因联合靶向siRNA重组表达载体的构建和鉴定

目的 构建Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体,探讨用RNA干扰方法同时下调Livin和Survivin基因表达的增效作用.方法 通过前期的实验,分别从靶向Livin基因和Survivin基因的siRNA序列中各挑选出1对最有效的siRNA序列,然后采用1个载体编码2个shRNA技术,将其构建到同一个真核表达载体上,转化DH5a菌株,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析.结果 经酶切鉴定和测序分析证实Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功.结论 Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功.     

小鼠肝脏特异的微RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的利用分子克隆技术,构建微RNA(microRNA,miRNA)真核细胞载体.方法人工合成小鼠肝脏特异的微RNA(miR-122)前体基因序列,并添加酶切位点及polyT转录终止序列,经退火处理后形成双链结构,插入小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pAVU6 27中,经酶切鉴定和测序证实后,构建成为miR-122真核表达载体(pAVU6 27-mir122).结果合成的基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体pAVU6 27上.结论 miR-122真核表达载体的构建,为进行真核细胞转染及miR-122表达的研究奠定了基础.     

利福平致大鼠肝损伤模型肝组织CYP2E1表达的动态观察

目的:动态观察利福平肝损伤大鼠肝组织中CYP2E1的表达。方法:健康清洁级SD大鼠48只,雌雄各半,随机分成正常组和利福平组两组,各24只。利福平组实验大鼠每天以利福平混悬液50mg/(kg.d)灌胃,正常组大鼠每天以去离子水灌胃。分别在实验7、14、21天末及停药后14天末各取6只实验大鼠脱臼处死,迅速打开腹腔,取部分肝组织置4%多聚甲醛溶液中固定24小时,石蜡包埋切片,进行CYP2E1免疫组化染色。结果:利福平组大鼠肝组织CYP2E1表达跟正常组比较明显增强,差异有统计学意义(P0.05),其中第14天时达到最高点。利福平组CYP2E1表达在21天时有所下降,停药14天后,CXP2E1表达明显下降,跟实验第7、14天时比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论:利福平所致肝毒性有一定蓄积效应,这种效应可随着停药而改善。CYP2E1表达可反应利福平致肝组织损伤的程度。     

甘遂配伍甘草对大鼠肝脏CYP2E1表达及活性的影响

目的通过检测细胞色素氧化酶CYP2E1的表达和活性变化,从分子水平探讨中药配伍禁忌"十八反"理论中甘遂配伍甘草的药理机制.方法利用RT-PCR检测大鼠肝脏CYP2E1 mRNA水平;通过Western blot检测大鼠肝脏CYP2E1蛋白表达;采用高效液相色谱(HPLC)法测定CYP2E1酶活性.结果甘遂组、甘草组和甘遂甘草配伍组均明显诱导大鼠肝脏CYP2E1的表达与活性上升,并发现甘草组和甘遂甘草配伍组对CYP2E1活性的诱导作用显著高于甘遂组.结论甘遂可能通过诱导肝脏CYP2E1的表达与活性上升,促使其所含的前致癌物质和前毒物转化成为致癌物和毒物,导致对机体的毒性作用;甘遂甘草配伍使用时,甘草对CYP2E1活性的诱导能力更强,故而甘草可促进甘遂所含前致癌物质和前毒物转化成为致癌物和毒物的过程,并导致对机体毒性作用的增强,从而表现出"十八反"中药物配伍禁忌的特征.     

CYP2E1基因多态性与肺癌遗传易感性的关系

目的 研究CYP2E1基因多态性与中国四川汉族人群肺癌遗传易感性之间的相关性.方法 应用PCR-RFLP技术检测150例中国四川汉族肺癌患者和152例健康人的CYP2E1基因Rsa Ⅰ/Pst Ⅰ和Dra Ⅰ多态性的分布频率,并分析了这两种基因多态性与中国四川汉族人群肺癌遗传易感性之间的相关性,以及与吸烟在肺癌易感性中的交互作用.结果 ①CYP2E1基因Rsa Ⅰ/Pst Ⅰ和Dra Ⅰ多态基因型分布频率在2组间比较无显著性差异(分别为x2=3.186,P=0.203和x2=1.756,P=0.416);②按照吸烟因素分层,携带c1/c1基因型的不吸烟个体较携带突变基因型的个体肺癌风险显著增加(OR=2.453,95%CI=1.140～5.276,P=0.022);③与携带至少1个突变c2基因型的个体比较,携带c1/c1基因型的个体患肺腺癌的风险显著增加(OR=2.440,95%CI=1.235～4.820,P=0.01);④没有发现Dra Ⅰ多态性与肺癌风险之间的相关件.结论 ①CYP2E1的c1/c1基因型为中国四川汉族人群肺癌易感基因型;②Rsa Ⅰ/Pst Ⅰ多态性与中国四川汉族人群患肺腺癌的风险显著相关;③Dra Ⅰ多态性与中国四川汉族人群肺癌风险无相关性.     

肺癌中医证候与代谢酶基因CYP1A1、CYP2E1多态性的关联研究

目的:探讨代谢酶基因多态性与肺癌中医证型的关联,寻找肺癌中医证型的易感基因,分析基因辅助辨证的可行性。方法:分析207例肺癌患者的中医证型,运用聚合酶链反应-连接酶检测(polymerase chain reaction-ligase detection reaction,PCR-LDR)技术检测207例肺癌患者CYP1A1基因MspⅠ、Ⅱe/val位点和CYP2E1基因RsaI位点的基因型,分析其基因型和等位基因频率分布与肺癌中医证候之间的关系。结果:CYP1A1基因MspⅠ位点3种基因型在不同中医证型中的分布具有统计学差异(P0.01);精气两亏证CC基因型和C等位基因出现的频率明显高于脾虚痰湿证和痰热内蕴证(P0.0083);痰热内蕴证以CT基因型为主(50.0%),阴虚内热证以CC基因型为主(76.2%),两组具有显著差异(P0.0083)。CYP1A1基因Ⅱe/val位点和CYP2E1基因RsaI位点基因型及等位基因频率在4组证型中的分布,差异均无统计学意义(P0.05)。结论:CYP1A1基因MspⅠ位点可能与肺癌中医证型具有关联,CC基因型和C等位基因可能与精气两亏证的形成相关联。     

细胞色素P4502E1基因多态性对再生障碍性贫血易感性的影响

目的探讨CYP2E1基因多态性对再障遗传易感性的影响.方法应用病例对照分子流行病学研究方法,采用PCR-RFLP和PCR方法分别分析72例再障病人和80例健康对照的CYP2E1的PstI和CYP2E1的96bp插入多态性.结果CYP2E1(c1c2,c2c2)基因型在再障组和对照组的频率分别为50.00%,45.00%,差异无显著性(P＞0.05);CYP2E1的96bp插入多态在再障组和对照组的频率分别为41.67%,27.50%,亦差异无显著性(P＞0.05);联合分析时,发现CYP2E1(c1c2,c2c2) Ins96( / , /-)基因型的个体较正常野生型个体患再障危险性升高(OR值为4.88,P＜0.05).结论CYP2E1(c1c2,c2c2) Ins96( / , /-)基因型与再障遗传易感性有关,可能在再障的发病过程中起重要作用.     

注射用盐酸头孢他美对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影响

目的 研究注射用盐酸头孢他美对大鼠肝微粒体细胞色素P450(CYP450)酶系CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影响。方法 将SD大鼠分成盐酸头孢他美给药组和生理盐水空白组,每组6只,雌雄各半,给药组尾静脉注射盐酸头孢他美50 mg/(kg·d),连续给药7 d,每天2次。HPLC法同时测定CYP450的3种同工酶特异性探针底物在SD大鼠肝微粒体内代谢产物生成量和原型探针底物降解量,判断酶亚型活性变化。分析柱Diamonsil C₁₈ (150 mm×4.6 mm,5 μm),流速1.0 mL/min。CYP1A2代谢样品测定条件为甲醇(0.1%甲酸)(A)-水(0.1%甲酸)(B),0~5 min: 18%A,5~10 min: 18%~60%A,10~15 min: 60%A,检测波长为247 nm;CYP3A4代谢样品测定条件为甲醇(A)-水(0.02%甲酸)(B),0~11 min: 40%~60%A,检测波长为223 nm;CYP2E1代谢样品测定条件为甲醇(A)-水(B),0~10 min: 37%~75%A,检测波长为287 nm。结果 探针底物及其代谢产物在测定浓度范围内线性关系良好(r≥0.999 7),精密度RSD<6％(n=5),提取回收率83.2%～97.5%。SD大鼠连续注射给予盐酸头孢他美后,CYP3A4的活性与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),可能存在诱导作用;CYP1A2和CYP2E1的活性与对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)。结论 静注给予盐酸头孢他美能诱导SD大鼠肝微粒体CYP3A4,对CYP1A2和CYP2E1没有诱导或抑制作用。提示经CYP3A4 代谢的药物在临床上与注射用盐酸头孢他美合用时,可能存在潜在药物-药物相互作用。     

代谢酶基因CYP2E1多态性与甘肃地区食管癌易感性的关系

目的:研究甘肃地区P4502E1(CYP2E1)基因多态性与食管癌易感性的关系.方法:采用PCR-RFLP方法检测129例食管癌患者和156例健康对照者血中代谢酶CYP2E1基因RsaI、DraI位点多态性的改变.结果:①CYP2EI基因c1/c1基因型在食管癌组中的分布频率为58.1%,高于健康对照组的50.5%,但尚未达到显著性差异程度(P>0.05).②食管癌组中DD基因型为58.1%,而健康对照组中DD基因型为51.9%.DD基因型在食管癌组和健康对照组中差异亦无显著性(P>0.05).结论:CYP2E1基因RsaI、DraI位点多态性变化与甘肃地区人群食管癌易感性之间未发现存在协同作用.     

含CYP2E1基因的重组腺病毒载体转染人骨髓间充质干细胞联合达卡巴嗪的抗肿瘤效应

目的 构建含人细胞色素P-450 CYP2E1(CYP2E1)基因的缺陷型重组腺病毒载体,检测其协同化疗药物的抗肿瘤效应,为基因介导酶前药治疗提供新的思路.方法 克隆人肝CYP2E1全长cDNA,制备高滴度的重组腺病毒颗粒(1.2×1012 pfu/ml).分离、培养、传代纯化及鉴定人骨髓间充质干细胞(BMSC).用Transwell小室检测BMSC向肿瘤细胞的趋化迁移.将重组腺病毒分别转染BMSC和人黑色素瘤细胞A375细胞.荧光显微镜和RT-PCR、Western印迹法分别检测转基因细胞中外源增强绿色荧光蛋白(EGFP)、CYP2E1的表达.倒置显微镜、四甲基偶氮唑盐(MTT)和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)双染色法检测CYP2E1协同酶前药达卡巴嗪(DTIC)的抗肿瘤效应(实验分A375-CYP2E1组、BMSC-CYP2E1组和BMSC-CYP2E1+A375组,并以各自空载体组作为对照;细胞接种后分别加入不同浓度DTIC).结果 成功构建重组腺病毒载体pAd5CMV-NpA-CYP2E1和pAd5CMV-NpA-EGFP.成功分离BMSC,并证明BMSC可通过聚碳酸酯膜分别向下室内的K562和A375细胞迁移.荧光显微镜检测到转基因靶细胞EGFP表达,RT-PCR和Western印迹法均检测到目的基因在转基因细胞中高表达.倒置显微镜下见加入DTIC后BMSCCYP2E1+A375组的死亡细胞明显多于对照组.MTT法示DTIC呈浓度依赖性抑制转CYP2E1基因的细胞生长,其中BMSC-CYP2E1+A375组药物半数抑制量(IC50)值为(0.17±0.13)mmol/L,其对照组为(0.65±0.20)mmol/L,二者差异有统计学意义(P＜0.01),可选0.05 mmol/L DTIC浓度作人BMSC的相对安全浓度.Annexin V/PI法示0.05 mmol/L DTIC处理细胞48 h后BMSC-CYP2E1+A375组细胞凋亡率明显高于其对照组(26.8±2.0比8.7±1.3,P＜0.01).结论 BMSC体外具有向肿瘤细胞趋化迁移的特性.重组腺病毒载体介导的CYP2E1转染BMSC具有协同化疗前药的抗肿瘤效应.     

西藏藏族人群CYP2E1基因*c1/*c2功能多态性与酒精使用障碍之间的关联分析

目的:用病例对照研究的方法,对拉萨郊县藏族人群中CYP2E1基因的*c1/*c2多态性与酒精使用障碍之间进行关联分析,以期发现他们之间的相关性以及该基因多态性对酒精使用障碍严重程度及相关因子的影响.方法:使用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对 655份DNA标本的CYP2E1 *c1/*c2多态性进行基因分型.其中340份DNA来自酒精使用障碍鉴别测试(AUDIT)总分≥10的酒精使用障碍被试,另315份DNA来自AUDIT≤5的正常对照被试.将基因分型结果与酒精使用障碍进行关联分析.结果:不论在病例组还是对照组,该等位基因频率的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律.病例组CYP2E1 *c2等位基因的频率(16.2%)明显高于对照组(10.8%),其P值为0.005,OR值为1.60(95%可信区间为1.15～2.21).病例组带有*c2等位基因的基因型(*c1/c2 *c2/c2)频率明显比对照组高(28.5%vs.18.7%;χ2>=8.65,P=0.003;OR=1.73);在男性中,这样的差异性更显著,其OR值高达2.30;但在女性中,差异却无统计学意义.男性病例组中的*c2等位基因能使AUDIT及酒精依赖严重程度问卷(SADQ)中描述个体饮酒量的因子得分增加.结论:在该藏族人群中,特别是男性中,CYP2E1*c2等位基因与酒精使用障碍及饮酒量的增加均有关联.     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。